孫 蘭 李家春王燕 皇立衛(wèi)王麗 王振中

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 淮安223003； 2.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 淮安223003；3.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所， 江蘇 無(wú)錫214063； 4.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司， 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 連云港222001）

盆腔炎性疾病是女性多發(fā)性疾病，主要由腹膜、子宮、卵巢等發(fā)生感染時(shí)所引起的炎癥總稱(chēng)［1］。由于定位不準(zhǔn)確，疾病播散不局限于一個(gè)器官，盆腔炎癥疾病很難診斷，延誤診治可能導(dǎo)致慢性盆腔痛、輸卵管卵巢膿腫、不孕癥等永久性后遺癥［2］。除了常規(guī)臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查外，超聲檢查、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等成像技術(shù)也用以診斷盆腔炎癥疾?。?］。正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)（positron emission tomography，PET）在腫瘤學(xué)、心臟病學(xué)和神經(jīng)病學(xué)中的廣泛應(yīng)用使其受到越來(lái)越多的關(guān)注［4?5］。18F?2?氟?2?脫氧?D?葡萄糖（18F?FDG）作為葡萄糖同系物，是MicroPET 診斷和治療癌癥、神經(jīng)疾病的標(biāo)準(zhǔn)放射性藥物［6?8］?；诨罨难仔约?xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取增加，18F?FDG 被開(kāi)發(fā)為炎癥疾病顯影的顯像劑［9］。

桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍和桃仁5 種藥材組成，處方源于《金匱要略》桂枝茯苓丸，具有活血化瘀、緩消癥塊的功效，主要用于盆腔炎性疾病、原發(fā)性痛經(jīng)和子宮肌瘤等疾病，臨床療效顯著［10?11］。本實(shí)驗(yàn)采用苯酚膠漿復(fù)制大鼠盆腔炎模型，采用MicroPET 技術(shù)觀察炎癥子宮對(duì)18F?FDG 的攝取水平，以此反映桂枝茯苓膠囊對(duì)模型大鼠盆腔炎的改善作用，為桂枝茯苓膠囊臨床治療盆腔炎性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，雌性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017?0005。大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（蘇）2019?0025，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審查號(hào)jsinm?39）。

1.2 藥物 桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）；婦科千金片（株洲千金藥業(yè)股份有限公司）。

1.3 試劑 苯酚、乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、K2CO3、NaHCO3、水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；18F?FDG 前體（無(wú)錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)有限公司）；注射用水（江蘇四環(huán)生物股份有限公司）。腫瘤壞血因子α（TNF?α）、白細(xì)胞介素?1β（IL?1β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國(guó)eBioscience 公司）。

1.4 儀器 醫(yī)用回旋加速器（Sumitomo HM?7型，日立住友重機(jī)械建機(jī)起重機(jī)株式會(huì)社）；18F?FDG 專(zhuān)用合成模塊（PET?FDG?IT?Ⅱ型，北京派特生物技術(shù)有限公司）；麻醉機(jī)（Matrx VMR型，美國(guó)Matrx公司）；MicroPET 掃描儀（Inveon型，德國(guó)Simens公司）；γ 計(jì)數(shù)儀、Cyclone?磷屏成像系統(tǒng)（1470型、C431200型，美國(guó)Perkin Elmer 公司）；活度計(jì)（CURIEMENTOR 3型，德國(guó)PTW 公司）；電子天平（AS210型，德國(guó)Sartorius 公司）；QMA 柱、C18柱固相萃取小柱（WAT023525 型、Sep?Pak型，美國(guó)Waters 公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 60 只大鼠，參考文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道方法復(fù)制大鼠盆腔炎模型。用10% 水合氯醛350 mg／kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部分別用碘伏和75%乙醇消毒，下腹部正中切口約2 cm，暴露子宮，由左側(cè)子宮向卵巢方向緩慢注入15% 苯酚膠漿0.1 mL（液化苯酚5 mL、黃蓍樹(shù)膠粉1 g、甘油2 mL 制成的混合液中加蒸餾水至33.3 mL，配制15%苯酚膠漿），分層關(guān)腹，消毒術(shù)區(qū)。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、桂枝茯苓膠囊組（0.558 g／kg）和婦科千金片組（1.525 g／kg），其中桂枝茯苓膠囊組、婦科千金片組各12只，假手術(shù)、模型組各18 只。造模4 周后開(kāi)始灌胃給藥，桂枝茯苓膠囊組、婦科千金片組給予相應(yīng)劑量藥物，假手術(shù)組、模型組給予0.5% CMC?Na 混懸液，容量均為10 mL／kg，每天1次，連續(xù)給藥28 d。

2.2 子宮組織病理形態(tài)觀察 給藥28 d后，脫頸椎處死動(dòng)物，各組大鼠子宮組織放射自顯影、18F?FDG MicroPET 測(cè)定結(jié)束后，取子宮固定于10%甲醛溶液，脫水，石臘包埋，切片經(jīng)HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察（1）子宮內(nèi)膜及固有層腺體上皮細(xì)胞有無(wú)變性壞死，（2）子宮內(nèi)膜有無(wú)充血水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，（3）子宮肌層有無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)無(wú)明顯病變、輕度病變、中度病變、重度病變分別記為0 分、1 分、2 分、3分，計(jì)算各組平均分值，分值越高表明盆腔炎性病變程度越嚴(yán)重。

2.3 ELISA 法檢測(cè)血清IL?1β、TNF?α 水平 給藥第14、28天，各組大鼠脫頸椎處死前，眼眶靜脈層采血1.5 mL 于未加抗凝劑EP 管中，3 000 r／min離心15 min，取上層血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL?1β、TNF?α 水平。

2.4 放射自顯影檢測(cè) 給藥前假手術(shù)組、模型組各取6 只大鼠，給藥后第14天，各組取6 只大鼠通過(guò)尾靜脈注射11.1 MBq（0.3 mCi）18F?FDG，1 h后脫頸椎處死所有大鼠，取出每只大鼠兩側(cè)子宮并固定在顯微鏡玻片上，分別將解剖后的子宮進(jìn)行磷屏顯像放射自顯影，使用OptiQuant 軟件對(duì)放射自顯影圖像進(jìn)行定量，分析18F?FDG 攝取情況，計(jì)算各組攝取相對(duì)值，公式為攝取相對(duì)值＝左側(cè)子宮攝?。覀?cè)子宮攝取。

2.5 γ 計(jì)數(shù) 各組大鼠子宮完成放射自顯影檢測(cè)后，利用γ 計(jì)數(shù)儀檢測(cè)每只大鼠兩側(cè)子宮γ 計(jì)數(shù)。

2.618F?FDG MicroPET 檢測(cè) 各組大鼠給藥第28天，禁食8 h，用異氟醚麻醉大鼠，并通過(guò)插管注射11.1 MBq（0.3 mCi）18F?FDG，1 h 后將大鼠俯臥在掃描儀內(nèi)掃描。在各組大鼠子宮上繪制感興趣區(qū)域（ROI），并計(jì)算ROI 中的平均標(biāo)準(zhǔn)攝取值（SUV mean，%ID／g）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)Graphpad Prism5.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎大鼠子宮組織病理形態(tài)的影響 假手術(shù)組子宮組織結(jié)構(gòu)正常；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織病理綜合評(píng)分升高（P＜0.01），子宮壁有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜水腫、充血明顯；與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠子宮病理綜合評(píng)分降低（P＜0.01），內(nèi)膜充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷程度明顯減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 桂枝茯苓膠囊對(duì)大鼠子宮組織病理形態(tài)（A）及綜合評(píng)分（B）的影響（，n＝6）Fig.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on histopathological morphology（A）and comprehensive scores（B）of rat uterus tissue（，n＝6）

3.2 桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平升高（P＜0.01）；給藥第14、28天，與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 桂枝茯苓膠囊對(duì)大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平的影響（pg／mL，，n＝6）Tab.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat serum IL?1β and TNF?α levels（pg／mL，，n＝6）

表1 桂枝茯苓膠囊對(duì)大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平的影響（pg／mL，，n＝6）Tab.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat serum IL?1β and TNF?α levels（pg／mL，，n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.3 桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎大鼠子宮自顯影的影響 如圖2 所示，給藥前，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠攝取相對(duì)值升高（P＜0.01），表明盆腔炎模型建立成功的。如圖3 所示，給藥第14天，與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠子宮攝取相對(duì)值降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠子宮自顯影（A）及攝取相對(duì)值（B）（，n＝6）Fig.2 Uterine autoradiography（A）and relative uptake value（B）of rats in each group（，n＝6）

圖3 桂枝茯苓膠囊對(duì)大鼠子宮自顯影的影響（，n＝6）Fig.3 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat uterine autoradiography（，n＝6）

3.4 桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎大鼠子宮γ 計(jì)數(shù)的影響 給藥前及給藥第14天，模型組大鼠左側(cè)子宮每分鐘放射性活性高于假手術(shù)組（P＜0.01），見(jiàn)圖4A。給藥第14天，與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠左側(cè)子宮每分鐘放射性活性降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4B。

圖4 各組大鼠子宮γ 計(jì)數(shù)比較（，n＝6）Fig.4 Comparison of γ?count in rat uterus of each group（，n＝6）

3.5 桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎大鼠子宮18F?FDG MicroPET 掃描的影響 模型組大鼠雙側(cè)子宮MicroPET 掃描圖像的ROI 分析顯示放射性攝取存在顯著差異，左側(cè)子宮為（2.672±0.095）%ID／g，而右側(cè)子宮為（1.779±0.486）% ID／g，模型組左側(cè)子宮攝取值高于假手術(shù)組（P＜0.01）；與模型組比較，給藥28 d后，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠左側(cè)子宮放射性攝取值均降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 桂枝茯苓膠囊對(duì)大鼠子宮18F?FDG MicroPET 掃描的影響（，n＝6）Fig.5 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat uterus revealed by 18F?FDG MicroPET scanning（，n＝6）

4 討論

盆腔炎性疾病主要包括盆腔腹膜炎、子宮內(nèi)膜炎等，如治療不徹底，常會(huì)引起慢性盆腔痛、輸卵管妊娠等并發(fā)癥，給患者的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重危害［13］。中醫(yī)認(rèn)為血瘀是盆腔炎性疾病主要病機(jī)，歸為“不孕”“婦人腹痛”等范疇［14］。桂枝茯苓膠囊是臨床治療婦科血瘀證的經(jīng)典方劑，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍組成，具有活血調(diào)經(jīng)、化瘀消癥功能，臨床上用于治療痛經(jīng)、盆腔炎、子宮肌瘤等疾病［15］?，F(xiàn)代藥理研究表明，桂枝茯苓膠囊具有抑制子宮平滑肌收縮、抑制炎癥因子、調(diào)節(jié)免疫、改善微循環(huán)等作用［16］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎性疾病抗炎作用，本研究采用苯酚膠漿復(fù)制大鼠盆腔炎模型。病理結(jié)果表明，模型組大鼠子宮壁有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜水腫、充血明顯；桂枝茯苓膠囊組大鼠內(nèi)膜充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷程度明顯減輕，子宮病理綜合評(píng)分降低，結(jié)果提示，桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎模型大鼠具有抗炎作用。

IL?1β、TNF?α 是主要促炎細(xì)胞因子，在炎癥早期階段，體內(nèi)TNF?α 水平升高，激活淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等向病變部分遷移，進(jìn)而促進(jìn)IL?1β、IL?6 等多種炎性因子的合成釋放［17］。IL?1β 是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)，是促進(jìn)體內(nèi)白細(xì)胞浸潤(rùn)的主要細(xì)胞因子［18］。研究顯示，桂枝茯苓膠囊通過(guò)降低TNF?α、IL?2 水平以發(fā)揮治療盆腔炎性疾病的作用［19?20］。牡丹皮、白芍中丹皮酚具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用，可以降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清中IL?6、IL?1β 細(xì)胞因子水平［21］；桃仁中苦杏仁苷通過(guò)抑制一氧化氮合酶的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用可有效緩解炎性痛［22］；茯苓中齊墩果酸通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)［23］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平升高；桂枝茯苓膠囊干預(yù)后，血清IL?1β、TNF?α 水平降低，結(jié)果提示，桂枝茯苓膠囊能夠減輕大鼠盆腔炎癥反應(yīng)，與前述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。

應(yīng)用MicroPET 技術(shù)評(píng)價(jià)桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎性疾病的研究較少報(bào)道，18F?FDG 是MicroPET技術(shù)常用的炎癥診斷顯像劑［24?25］。當(dāng)有炎癥反應(yīng)時(shí)，機(jī)體炎癥細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等代謝增強(qiáng)，攝取葡萄糖相應(yīng)增加，通過(guò)MicroPET 技術(shù)可觀察病變部位對(duì)葡萄糖的攝取量差異來(lái)診斷機(jī)體炎癥疾病發(fā)展的嚴(yán)重程度，攝取值越高，提示炎癥越嚴(yán)重［26?27］。研究結(jié)果表明，模型組左側(cè)子宮攝取值高于假手術(shù)組（P＜0.01）；桂枝茯苓膠囊給藥28 d后，大鼠左側(cè)子宮放射性攝取值均降低（P＜0.01）。結(jié)果提示，桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎模型大鼠子宮炎癥具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究成功地復(fù)制了大鼠盆腔炎模型，并使用放射自顯影、γ 計(jì)數(shù)和MicroPET 方法評(píng)價(jià)了桂枝茯苓膠囊的抗炎作用，結(jié)合桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎模型大鼠子宮組織病理及炎性因子IL?1β、TNF?α 的影響，18F?FDG MicroPET 技術(shù)能有效評(píng)價(jià)桂枝茯苓膠囊對(duì)盆腔炎模型大鼠子宮損傷的改善作用。