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        UPLC?MS/MS 法測定右歸丸中3 種雙酯型生物堿及風險評價

        2022-12-03 11:58:26刁春玲鄧杰華袁秀澤朱建蒙楊建冬周云峰
        中成藥 2022年11期

        刁春玲 鄧杰華 袁秀澤 朱建蒙 楊建冬 周云峰

        (1.淳安縣第一人民醫(yī)院, 浙江 杭州311700; 2.宜春市食品藥品檢驗所, 江西 宜春336000)

        附子是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.子根的加工品,具有補火助陽、回陽救逆功效[1],臨床作用顯著,但毒性較強,使用不當會導(dǎo)致中毒甚至死亡[2?3],其有效成分和有毒物質(zhì)均為二萜類生物堿,其中雙酯型生物堿毒性最強[4],包括烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿[5?7],故需經(jīng)過炮制加工成飲片來減低毒性后才能使用,但不同方法效果有所差異[8?10],不能保證完全去除該類成分,導(dǎo)致潛在風險一直存在。

        右歸丸中含有炮附片[11],它作為附子炮制飲片可能會引入雙酯型生物堿,其現(xiàn)行質(zhì)量標準是采用TLC 法對烏頭堿含量進行限制[11],但樣品前處理過程復(fù)雜繁瑣,判定依據(jù)也只是與對照品比較斑點大小,專屬性不強,而且部分雙酯型生物堿的限量控制并不能完全消除安全風險,目前也無關(guān)于對該制劑毒性物質(zhì)評價的報道。因此,本實驗采用超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC?MS/MS)法同時測定右歸丸中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿3 種雙酯型生物堿的含量,并對其進行風險評價,以期為其他中藥復(fù)方制劑安全性評價及有害物質(zhì)限度控制研究提供依據(jù)。

        1 材料

        Waters ACQUITY UPLC H?class/xevo TQD 液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters 公司);LE204E 電子天平(萬分之一)、MS205DU 電子天平(十萬之一)[梅特勒?托利多儀器(上海)有限公司];PL?S60 超聲波清洗儀(東莞康士潔超聲波科技有限公司)。右歸丸(小蜜丸)共12批,由仲景宛西制藥股份有限公司提供。新烏頭堿(批號17011302,純度98%)、烏頭堿(批號17022702,純度98%)、次烏頭堿(批號17072103,純度98%)對照品均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈(德國默克公司);甲酸[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];水為屈臣氏蒸餾水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);流動相乙腈(A)?0.1% 甲酸(B),梯度洗脫,程序見表1;體積流量0.3 mL/min;柱溫30 ℃;樣品室溫度10 ℃;進樣量5 μL。

        表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

        2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子檢測;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;脫溶劑氣溫度600 ℃,體積流量1 000 L/h;錐孔氣體積流量50 L/h,其他參數(shù)見表2。

        表2 各雙酯型生物堿質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrum parameters for various diester alkaloids

        2.3 溶液制備

        2.3.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量,50% 甲醇(含0.1% 鹽酸)溶解,制成含烏頭堿166.600 ng/mL、次烏頭堿219.520 ng/mL、新烏頭堿161.500 ng/mL 的貯備液,分別精密量取1、5、10、15、25 mL,置于50 mL 量瓶中,50%甲醇(含0.1%鹽酸)溶解稀釋至刻度,搖勻,即得。

        2.3.2 供試品溶液 本品用粉碎機打碎后取約2.5 g,精密稱定,置于250 mL 錐形瓶中,精密加入50%甲醇(含0.1%鹽酸)50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,振搖5 min,常溫超聲(功率250 W,頻率50 kHz)處理30 min,放冷,50%甲醇(含0.1%鹽酸)補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.3.3 陰性樣品溶液 取不含炮附片的本品約2.5 g 作為陰性樣品,精密稱定,按“2.3.2”項下方法制備,即得。

        2.3.4 空白溶液 不加本品,按“2.3.2”項下方法制備,即得。

        2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項下系列質(zhì)量濃度貯備液各5 μL,在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行回歸,以信噪比(S/N)3∶1 時的質(zhì)量濃度為檢測限,結(jié)果見表3,可知各雙酯型生物堿在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        表3 各雙酯型生物堿線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various diester alkaloids

        2.5 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品(批號190502)、陰性樣品、空白溶液各5 μL,在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定,結(jié)果見圖1。由此可知,供試品溶液出現(xiàn)與對照品溶液保留時間一致的色譜峰,而且提取的各離子對均有較高響應(yīng),保留時間也基本相同,同時陰性樣品、空白溶液均無對應(yīng)色譜峰,對測定無干擾,表明該方法專屬性良好。

        圖1 各雙酯型生物堿MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various diester alkaloids

        2.6 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗

        2.6.1 精密度試驗 取同一份對照品溶液,在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次,測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD 分別為0.9%、0.4%、0.5%,表明儀器精密度良好。

        2.6.2 重復(fù)性試驗 取同一批本品(批號190502)6份,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定,測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD 分別為4.5%、3.1%、3.7%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批本品(批號190502),于0、1、2、4、8、12 h 在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定,測得烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積RSD 分別為3.4%、1.6%、2.2%,表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.7 加樣回收率試驗 取各雙酯型生物堿含量已知的本品(批號190502)約1.25 g,精密稱定,置于250 mL 錐形瓶中,精密加入對照品溶液(含烏頭堿69.2 ng/mL、次烏頭堿485.2 ng/mL、新烏頭堿257.6 ng/mL)5 mL,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次,計算回收率,結(jié)果見表4,可知均符合2020 年版《中國藥典》四部[12]要求。

        表4 各雙酯型生物堿加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of recovery tests for various diester alkaloids(n=6)

        2.8 樣品含量測定 取12 批樣品,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”“2.2”項條件下各進樣測定2次,計算含量,結(jié)果見表5。

        表5 各雙酯型生物堿含量測定結(jié)果(μg/g,n=2)Tab.5 Results of content determination of various diester alkaloids(μg/g,n=2)

        2.9 風險評價 12 批樣品均存在烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿3 種雙酯型生物堿,具有心血管系統(tǒng)[13?14]、神經(jīng)系統(tǒng)[15?16]、生殖[17?18]、胚胎[19]、肝腎[20]毒性,故有必要對三者風險進行評價。

        2020 年版《中國藥典》一部規(guī)定,炮附片含雙酯型生物堿以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量計,不得超過0.020%(200 μg/g),其一次服用量為3~15 g,則最大耐受總量為3 000 μg。右歸丸中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量范圍為2.346~3.241 μg/g,其一次服用量為9 g,則人體最大攝入量為29.169 μg,小于最大耐受總量,表明三者風險較小。

        半數(shù)致死量(LD50)可衡量藥物安全性,反映急性毒性強弱[21],烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的小鼠LD50分別為1.8、5.8、1.9 μg/g,而國際通用標準成人體質(zhì)量為55.9 kg,則折算成三者引起成人急性中毒量分別為100.620、324.220、106.210 mg。服用右歸丸后,進入人體的上述3 種雙酯型生物堿最大總量僅為29.169 μg,即不會構(gòu)成急性中毒風險。

        在3 種雙酯型生物堿中,烏頭堿毒性最強,成人口服0.2 mg 即可中毒,3~5 mg 即可致死[22]。以0.2 mg 為口服中毒閾值,測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿口服最大總量為29.169 μg,小于該閾值,表明三者產(chǎn)生安全風險的概率較低。

        3 討論

        烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿既是有效成分,又是毒性物質(zhì),其治療劑量與中毒劑量接近,臨床治療窗較窄[23?24],易產(chǎn)生安全風險,故有必要對三者進行限量控制。中成藥處方藥味較多,成分組成復(fù)雜,如僅采用1 個離子對進行MRM 定量檢測時,分子結(jié)構(gòu)式類似者易產(chǎn)生干擾,導(dǎo)致假陽性,故需先對其進行定性鑒別。本實驗通過一、二級質(zhì)譜發(fā)現(xiàn),各批次右歸丸均存在與烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品相應(yīng)的碎片離子,即均含有上述3 種毒性物質(zhì),再選取3 個以上響應(yīng)較高者進行MRM 定量測定。

        雙酯型生物堿會發(fā)生水解反應(yīng),加熱時其含量下降更快[25],故對該類成分進行含量測定時需考慮上述情況。右歸丸屬于蜜丸,具有黏性,難以研成細粉,故本實驗考察了水、0.1% 鹽酸、甲醇(含0.1%鹽酸)、50%甲醇(含0.1%鹽酸)等溶劑,以及常溫超聲處理30 min、過夜浸泡、過夜浸泡后再常溫超聲處理30 min 等提取方法對烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量的影響,最終確定為50%甲醇(含0.1%鹽酸)、常溫超聲處理30 min。

        本實驗建立UPLC?MS/MS 法同時測定右歸丸中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿3 種雙酯型生物堿的含量,發(fā)現(xiàn)市售樣品中三者均較低,風險評價顯示安全性較高,不易產(chǎn)生中毒風險。因此,有關(guān)企業(yè)在生產(chǎn)含附子的藥品時需加強質(zhì)量管理和風險把控,嚴格控制雙酯型生物堿含量,保證原料藥材和飲片質(zhì)量,優(yōu)化生產(chǎn)工藝,以期從源頭上減少該類成分帶來的安全風險。

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