肖 瑞，翁子依，段義君，糜志遠(yuǎn)，張 佳

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068)

泥鰍是一種傳統(tǒng)的中藥材，享有“水中人參”的美名[1]，具有非常高的藥用以及食用價(jià)值[2]?！吨腥A大詞典》記述其分泌的黏液可以入藥，具有味甘性平等特點(diǎn)[3-5]?，F(xiàn)有研究顯示，泥鰍中含有多糖[6]、凝集素[7-8]、超氧化物歧化酶[9-10]、抗菌肽[11-13]以及透明質(zhì)酸[14]等多種藥理活性成分。從泥鰍中分離出的多糖對人癌細(xì)胞系具有抗增殖以及凋亡等作用[15]，具有抗氧化增強(qiáng)免疫力等生理功能[16-18]。還有研究指出，泥鰍多糖對小鼠的免疫性肝損傷具有保護(hù)作用[19]。鑒于目前泥鰍活性物質(zhì)的研究系統(tǒng)性、完整性不強(qiáng)，且尚不深入，本研究旨在從泥鰍表皮中活性物質(zhì)的提取方法入手為泥鰍中活性物質(zhì)的研究打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍(購自武漢南湖綜合生鮮市場)。

95%乙醇，無水乙醇，葡萄糖，考馬斯亮藍(lán)G-250，硫酸，苯酚，牛血清白蛋白。以上試劑均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與工具

TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)；UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；UPT-I-10T型超純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；BCD-232EJL/R小天鵝冰箱(江蘇小天鵝營銷有限責(zé)任公司)；BP121S 電子天平(德國賽多利斯集團(tuán)公司)；0.1～5000μL移液槍(德國Eppendorf公司)；YB-2000A型粉碎機(jī)(永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；s6恒溫水浴鍋(常州市華怡儀器制造有限公司)；LGJ-50F真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(鄭州予華儀器制造有限公司)；PNG-9096A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；IG-50紅外光譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.3 泥鰍表皮活性物質(zhì)的制備

1.3.1泥鰍表皮的制備將市售活泥鰍置清水中靜養(yǎng)3～4 d，取出瀝干，置-20℃冷柜中冷凍24 h后取出，切成3～4 cm長段，置真空冷凍干燥機(jī)中，-50℃下預(yù)凍20 h，-45℃～-5℃升華除水40 h，-5℃～20℃二次干燥10 h，取出粉碎，過20目篩，取泥鰍皮裝袋備用。工藝流程見圖1。

圖1 泥鰍表皮的制備流程

1.3.2泥鰍表皮中活性物質(zhì)的制備稱取泥鰍皮適量，按料液比1∶20加入超純水中，65℃提取2 h，冷卻至室溫，6000 r/min離心10 min，棄去沉淀，上清液加入10倍體積的95%乙醇，置冰箱中冷藏過夜，減壓過濾，棄去濾液，所得固體用無水乙醇洗3次，30℃干燥，即得泥鰍表皮活性物質(zhì)(類白色至淡黃色粉末，以下簡稱活性物質(zhì))。

2 單因素試驗(yàn)及結(jié)果

按上述制備方法，分別考察提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間以及料液比等因素對活性物質(zhì)提取率的影響。

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取次數(shù)對活性物質(zhì)得率的影響設(shè)定提取溫度為65℃、提取時(shí)間2 h、料液比1∶20等條件不變，觀察提取次數(shù)分別是1、2、3和4次時(shí)活性物質(zhì)的得率(圖2)。從圖2可知，隨著提取次數(shù)的增加，活性物質(zhì)得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在提取次數(shù)為3次時(shí)最大，因此提取次數(shù)初步確定為3次。

圖2 提取次數(shù)對活性物質(zhì)得率的影響

2.1.2提取溫度對活性物質(zhì)得率的影響設(shè)定提取次數(shù)為3次、提取時(shí)間2 h、料液比1∶20等條件不變，觀察提取溫度分別是45℃、55℃、65℃和75℃時(shí)活性物質(zhì)的得率(圖3)。從圖3可知，隨著提取溫度的增加，活性物質(zhì)的得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在提取溫度為65℃時(shí)有最大得率，因此提取溫度初步確定為65℃。

圖3 提取溫度對活性物質(zhì)得率的影響

2.1.3提取時(shí)間對活性物質(zhì)得率的影響設(shè)定提取次數(shù)為3次、提取溫度65℃、料液比1∶20等條件不變，觀察提取時(shí)間分別是1、2、3和4 h時(shí)活性物質(zhì)的得率(圖4)。從圖4可知，隨著提取時(shí)間增加，活性物質(zhì)得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在提取時(shí)間為2 h時(shí)最大，因此提取時(shí)間初步確定為2 h。

圖4 提取時(shí)間對活性物質(zhì)得率的影響

2.1.4料液比對活性物質(zhì)得率的影響設(shè)定提取次數(shù)為3次、提取溫度65℃、提取時(shí)間2 h等條件不變，觀察料液比分別是1∶10、1∶20、1∶30和1∶40時(shí)活性物質(zhì)的得率，結(jié)果見圖5。從圖5可知，隨著料液比的增加，活性物質(zhì)的得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在料液比為1∶20時(shí)有最大得率，因此料液比初步確定為1∶20。

圖5 料液比對活性物質(zhì)得率的影響

3 正交試驗(yàn)及結(jié)果

3.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間以及料液比等因素，以活性物質(zhì)得率為指標(biāo)進(jìn)行五因素四水平正交試驗(yàn)(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

分別從浸提次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間以及料液比等方面對泥鰍活性粗提物得率進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見泥鰍活性粗提物得率受影響的4個(gè)因素中，浸提次數(shù)最為顯著，其他三個(gè)因素依次為提取溫度、提取時(shí)間和料液比。最終試驗(yàn)結(jié)果表明：泥鰍活性物質(zhì)粗提最優(yōu)方法是A3B3C2D2，即浸提次數(shù)3次、提取溫度65℃、提取時(shí)間2 h、料液比為1∶20，這個(gè)結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

4 泥鰍表皮活性物質(zhì)中蛋白質(zhì)和多糖的含量測定

4.1 多糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法測定泥鰍表皮活性物質(zhì)中多糖的含量。

4.1.1線性范圍精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，置100 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶，定容，分別取上述溶液各1.0 mL置刻度試管中，各加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，混勻放置，待其冷卻至室溫，在波長490 nm處，測其吸光度，繪制A-C曲線。

4.1.2樣品測定精密稱取泥鰍活性物質(zhì)10 mg置100 mL容量瓶中，加超純水溶解過濾，取濾液1.0 mL至刻度試管中，加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，混勻放置，冷卻至室溫，在波長490 nm處，重復(fù)測定三次該樣品溶液的吸光度，取平均值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算多糖含量。

4.2 多糖含量的測定結(jié)果

按上述方法得到葡萄糖線性范圍(圖6)。在濃度0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度和吸光度呈良好線性，線性方程為y=12.52x+0.0682，R2=0.9994。樣品在490 nm處的吸光度測定結(jié)果見表3，吸光度測定的平均值為0.383，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得泥鰍活性物質(zhì)中多糖含量為0.025 mg/mL，即25%。

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 樣品的紫外吸收測定結(jié)果(490nm)

4.3 泥鰍表皮活性物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定泥鰍表皮中活性物質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量。

4.3.1線性范圍精密稱取牛血清白蛋白25 mg，置25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，精密吸取1、2.5、3.5、4.5和5.5 mL，分別置于10 mL容量瓶，定容，分別取上述溶液各0.1 mL置刻度試管中，各加入0.9 mL超純水、考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5 mL，混勻放置，在波長595 nm處，測其吸光度，繪制A-C曲線。

4.3.2樣品測定精密稱取泥鰍活性物質(zhì)100 mg置10 mL容量瓶中，加超純水溶解過濾，取濾液0.1 mL至刻度試管中，加入超純水 0.9 mL、考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5 mL，混勻放置，在波長595 nm處，重復(fù)測定3次該樣品溶液的吸光度，取平均值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

4.4 蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果

對泥鰍活性物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。在濃度0.15～0.55 mg/mL范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度和吸光度呈良好線性，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.613x-0.2446，R2=0.9996。樣品在595 nm下吸光度測定結(jié)果見表4，吸光度平均值為0.149，代入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得泥鰍活性物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量為0.15 mg/mL，即15%。

圖7 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 樣品的紫外吸收測定結(jié)果(595nm)

5 泥鰍活性物質(zhì)的紅外圖譜

取適量泥鰍活性物質(zhì)，測定其紅外光譜(KBr壓片法)，結(jié)果見圖8。由譜圖可知，3699 cm-1處應(yīng)為N-H伸縮振動吸收峰(υN-H), 3304 cm-1為O-H伸縮振動吸收峰(υO(shè)-H), 2925 cm-1處中等強(qiáng)度的峰應(yīng)為飽和碳?xì)涞纳炜s振動吸收(υC-H), 2854 cm-1處為氨基酸分子中NH3+(偶極離子)的特征吸收，羰基伸縮振動吸收(υC=O)則出現(xiàn)在1746 cm-1處，1659 cm-1應(yīng)為羧酸根負(fù)離子的特征吸收(υCOO-), 1455 cm-1處應(yīng)為飽和碳?xì)涞膹澢駝游辗?δC-H)。綜上所述，本品既含有多糖的特征吸收(如較強(qiáng)的飽和碳?xì)湮?，?biāo)明應(yīng)含有大量的飽和碳?xì)滏I，以及羥基的存在，均符合多糖的特征)，也有明顯的蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)特征，如NH3+(偶極離子)和與之對應(yīng)的COO-(羧酸根負(fù)離子)均顯示為氨基酸的特征吸收；羰基的存在，也印證了這個(gè)結(jié)論。因此，紅外分析結(jié)果和化學(xué)分析結(jié)果基本一致，證明本品中的主要成分應(yīng)為多糖和蛋白質(zhì)。

圖8 泥鰍活性物質(zhì)的紅外圖譜(FT-IR Spectrum)

6 討論與結(jié)論

活性物質(zhì)可能會隨泥鰍加工而遭到破壞，故采用冷凍干燥法，將其活性物質(zhì)有效保存。由于泥鰍表皮特性柔軟，在粉碎過程中能較好地與其他組織(肌肉等)分離，而其表面的黏液等則可以固化在表皮表面，故采用65℃提取，以盡量保持活性物質(zhì)的穩(wěn)定。

1)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，泥鰍表皮活性物質(zhì)提取最佳條件為：提取次數(shù)3次、提取溫度65℃、提取時(shí)間2 h、料液比1∶20。其提取率為8.52%。

2)泥鰍表皮活性物質(zhì)主要為多糖(含量為25%)，蛋白質(zhì)含量較低(含量為15%)。紅外圖譜表明，本品的主要構(gòu)成應(yīng)為氨基酸和多糖。

3)采用硫酸苯酚法測定泥鰍活性物質(zhì)中的多糖含量，考馬斯亮藍(lán)法測定泥鰍活性物質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量，測定方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，便于實(shí)際應(yīng)用。

在下一步的研究中，會將蛋白質(zhì)和多糖進(jìn)行分離，對多糖進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，并比較泥鰍表皮中的蛋白質(zhì)是否和肌肉組織中的蛋白質(zhì)同源，為泥鰍中活性物質(zhì)的研究提供進(jìn)一步的證據(jù)。