畢效銘，王 雯,2，高 茜，袁長(zhǎng)永,3

三維打印是一種以數(shù)字程序?yàn)榛A(chǔ)，通過(guò)逐層打印的方式來(lái)構(gòu)造物體的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于頜面部修復(fù)、關(guān)節(jié)和骨盆手術(shù)、器官再造等方面[1]。同時(shí)，在數(shù)字化正畸、數(shù)字化種植、頜骨重建等口腔領(lǐng)域，三維打印也發(fā)揮著重要作用[2]。三維生物打印是三維打印的一個(gè)分支，它以負(fù)載細(xì)胞的生物墨水為原料，按預(yù)設(shè)的路徑打印結(jié)構(gòu)，在牙再生[3]、皮膚修復(fù)[4]、成骨[5]、成軟骨[6]、組織工程[7]等領(lǐng)域均有巨大的發(fā)展前景。

甲基丙烯酰化明膠(GelMA膠)是一種水凝膠材料，細(xì)胞相容性和組織相容性良好，且具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，是理想的生物墨水材料[8]。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，在一定誘導(dǎo)條件下可以成骨和成血管[9-10]，具有多向分化潛能和神經(jīng)血管特性[11]。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVECs)具有一定的干細(xì)胞潛能，是一種常用的細(xì)胞模型。

目前存在的共培養(yǎng)體系大多是體外共培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃利用生物打印技術(shù)，以GelMA30膠為原料，構(gòu)建新型間接共培養(yǎng)體系。若實(shí)驗(yàn)成功，將為后期檢測(cè)共培養(yǎng)體系下干細(xì)胞的成骨和成血管能力，建立既可以應(yīng)用于體外、也能夠體內(nèi)移植的間接共培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，ECM培養(yǎng)基(ScienCell，美國(guó))，胎牛血清(天杭生物，湖州)，胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液、4%多聚甲醛溶液(微科曼得，徐州)，1×PBS、1×D-PBS(凱基生物，中國(guó))，GelMA30水凝膠(EFL產(chǎn)業(yè)化公司，蘇州)，Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天，上海),HUVECs(中喬新舟，上海)，DPSCs自行分離培養(yǎng)并經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定。

三維打印機(jī)(Regenovo Bio-Architect?，捷諾飛，中國(guó))，Stellaris 5超高分辨激光共聚焦顯微鏡(徠卡，德國(guó))，BX43研究級(jí)正置熒光顯微鏡(Olympus，中國(guó))。

1.2 配制GelMA溶液

1.2.1 配制0.25%引發(fā)劑 避光條件下，取GelMA30試劑盒中的光引發(fā)劑LAP 0.05 g，加入20 mL PBS，40～50 ℃水浴加熱15 min，持續(xù)振蕩，直至LAP完全溶解。

1.2.2 配制5% GelMA30 取1 g GelMA30膠置于50 mL離心管內(nèi)，加入20 mL引發(fā)劑，37 ℃水浴鍋內(nèi)避光加熱20～30 min并持續(xù)振蕩，直至GelMA30膠完全溶解。將配好的GelMA30膠過(guò)濾滅菌。

1.3 出絲測(cè)試和可打印性測(cè)試

控制室溫23 ℃，出絲速度5 mm/s，壓強(qiáng)0.04～0.08 MPa。將配制好的GelMA30膠置于4 ℃搖床上，孵育20 min，再置于一定溫度的噴頭上孵育20 min，然后出絲。低溫噴頭分別控溫15、17、19、21、23、25 ℃，檢測(cè)不同溫度下的出絲情況，由此確定噴頭的最適溫度為21～23 ℃。

在最適溫度下，打印一根連續(xù)不間斷的絲，置于間隔分別為1、2、3、4、5、6 mm的支架上，觀察絲的塌陷程度并測(cè)量絲的下垂距離。

配制GelMA30膠，置于5 mL光固化料筒中，4 ℃搖床孵育20 min。預(yù)設(shè)三維打印機(jī)的參數(shù)，平臺(tái)控溫5 ℃，低溫噴頭控溫21 ℃，室溫控制23 ℃；構(gòu)建圓形網(wǎng)格狀模型，每層0.2 mm，共5層，斷絲抬高1 mm，兩絲間距1 mm。將料筒從搖床轉(zhuǎn)移至低溫噴頭上，控溫20 min。試出絲，出絲速度5 mm/s。待出絲順暢后，按預(yù)設(shè)路徑開(kāi)始打印。打印完成后光固化2次，每次20 s。在正置熒光顯微鏡下拍攝上層、中層、下層的孔隙照片，用Image J分別測(cè)量孔隙的周長(zhǎng)(L)和面積(A)，運(yùn)用公式計(jì)算模型的可打印性(printability，Pr)[12]。

1.4 細(xì)胞活死檢測(cè)

1.4.1 DPSCs活死檢測(cè) 在三維打印機(jī)上構(gòu)建同心圓模型，直徑8 mm，每圈間隔1 mm，共7圈，如圖1所示。每層高0.2 mm，共5層，總層高1.0 mm。

圖1 同心圓模型路徑圖

以10% MEM培養(yǎng)基代替PBS配制GelMA30膠。在無(wú)菌環(huán)境下，將1 mL 5% GelMA30與2×106個(gè)DPSCs混合均勻，置于5 mL光固化料筒中，4 ℃搖床孵育20 min，低溫噴頭控溫20 min。出絲順暢后，按預(yù)設(shè)路徑開(kāi)始打印。所有模型均打印在60 mm培養(yǎng)皿中。

打印完成后，光固化2次，每次20 s。24孔板中加入1 mL 10% MEM培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子將模型轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。使用Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行活死染色。避光條件下，向1 mL染色緩沖液中加入10 μL Calcein AM和10 μL PI配制染色劑。于模型培養(yǎng)的第1天和第7天，吸棄24孔板中的培養(yǎng)基，加入PBS沖洗3次，吸棄PBS，加入0.5 mL染色液，使其覆蓋模型。避光條件下，將24孔板移入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)45 min。染色結(jié)束后，PBS沖洗模型3次并吸棄。用激光共聚焦顯微鏡觀察活死情況，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.2 HUVECs活死檢測(cè) 以10% ECM培養(yǎng)基代替PBS配制GelMA30膠。將1 mL 5% GelMA30與2×106個(gè)HUVECs混勻，打印同心圓結(jié)構(gòu)，打印參數(shù)和方法同上。在24孔板內(nèi)加入1 mL ECM培養(yǎng)基，移入固化后的模型，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在第1天和第7天，活死染色45 min，D-PBS反復(fù)沖洗后，用激光共聚焦顯微鏡觀察，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 構(gòu)建共培養(yǎng)模型

1.5.1 構(gòu)建DPSCs-HUVECs直接共培養(yǎng)模型(M組) 用1∶1混合的MEM培養(yǎng)基和ECM培養(yǎng)基代替PBS配制GelMA30膠。將1 mL GelMA30膠與2×106個(gè)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein, EGFP)基因轉(zhuǎn)染的DPSCs細(xì)胞(EGFP-DPSCs)和2×106個(gè)負(fù)載表達(dá)mCherry質(zhì)粒的慢病毒轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞(mCherry-HUVECs)混合均勻(細(xì)胞總密度為4×106個(gè)/mL)，置于5 mL料筒中，4 ℃搖床孵育20 min，移至21 ℃控溫噴頭控溫20 min，打印同心圓模型并進(jìn)行光固化。24孔板內(nèi)加入MEM培養(yǎng)基與ECM培養(yǎng)基各500 μL，混合均勻后將模型移入。

1.5.2 構(gòu)建單純DPSCs培養(yǎng)模型(D-D200組) 以不含細(xì)胞的GelMA30膠作為間隔物，將含細(xì)胞的膠分隔開(kāi)，此時(shí)DPSCs的間距為200 μm。用MEM培養(yǎng)基代替PBS配制GelMA30膠。將1 mL GelMA30膠與4×106個(gè)EGFP-DPSCs混合，打印D-D200模型并固化。24孔板內(nèi)加入1 mL MEM培養(yǎng)基，移入模型。

1.5.3 構(gòu)建單純HUVECs培養(yǎng)模型(H-D200組) 使用mCherry-HUVECs和ECM培養(yǎng)基，步驟同1.5.2，構(gòu)建間距為200 μm的單純HUVECs培養(yǎng)模型。

1.5.4 構(gòu)建DPSCs-HUVECs間接共培養(yǎng)模型(M-D0組) 分別配制細(xì)胞密度為4×106個(gè)/mL的EGFP-DPSCs和mCherry-HUVECs的GelMA30膠，步驟同上。將兩個(gè)料筒分別置于2號(hào)、3號(hào)低溫噴頭，使其交替打印同心圓結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行光固化。24孔板內(nèi)加入MEM與ECM各500 μL，混合均勻后將模型移入。

1.5.5 構(gòu)建DPSCs-GelMA30膠-HUVECs模型(M-D200組) 配制細(xì)胞密度為4×106個(gè)/mL的EGFP-DPSCs膠、4×106個(gè)/mL的mCherry-HUVECs膠和不含細(xì)胞的GelMA30膠。以不含細(xì)胞的GelMA30膠作為間隔物，間距為200 μm。將三個(gè)料筒置于2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)低溫槍頭，交替打印同心圓結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行光固化。24孔板內(nèi)加入MEM與ECM各500 μL，移入模型。

1.5.6 構(gòu)建DPSCs-GelMA30膠-HUVECs模型(M-D400組) 步驟同1.5.5，打印間距更改為400 μm。

以上6種模型均在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光細(xì)胞分布情況并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 出絲試驗(yàn)和打印參數(shù)

低溫噴頭控溫15～19 ℃時(shí)，出絲粗糙，有顆粒感；21～23 ℃時(shí)，出絲連貫順滑；>25 ℃時(shí)，出絲呈液滴狀(圖2)。因此，低溫噴頭宜控溫21～23 ℃。打印參數(shù)見(jiàn)1.3部分。

圖2 不同溫度下的出絲狀況

2.2 可打印性測(cè)試

出絲塌陷試驗(yàn)：出絲可順利懸掛在支架上而不發(fā)生明顯塌陷，下垂距離為0.2 mm，證明5% GelMA30膠有一定的支持強(qiáng)度(圖3)。打印圓形網(wǎng)格狀模型：根據(jù)孔隙的面積和周長(zhǎng)計(jì)算出Pr平均值為0.97±0.02。綜上，證明5% GelMA30膠具有良好的可打印性。

圖3 出絲塌陷試驗(yàn)

2.3 DPSCs和HUVECs細(xì)胞存活率

細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。在5%的GelMA中，細(xì)胞存活狀況良好(圖4)，并可以進(jìn)一步伸展(圖5)。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 DPSCs與HUVECs活死染色平面圖( ×40)

圖5 DPSCs與HUVECs活死染色三維空間圖( ×40)

表1 DPSCs與HUVECs活細(xì)胞率

2.4 6種同心圓共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

6種共培養(yǎng)體系的三維打印模型、三維打印路徑和激光共聚焦顯微鏡下照片見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可以順利打印出6種預(yù)期的模型結(jié)構(gòu)。

圖6 同心圓共培養(yǎng)模型

3 討 論

隨著牙髓再生(regenerative endodontic procedures，REPs)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，共培養(yǎng)體系逐漸成為近些年的研究熱點(diǎn)[13]。Liu等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HUVECs培養(yǎng)液可以影響DPSCs的分化。吳一夢(mèng)等[15]發(fā)現(xiàn)，在牙本質(zhì)提取液中，HUVECs與DPSCs共培養(yǎng)，可促進(jìn)DPSCs成血管并向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。提示HUVECs可通過(guò)共培養(yǎng)促進(jìn)DPSCs的各向分化，從而恢復(fù)牙髓的部分功能。Dissanayaka等[16]發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)條件下，DPSCs不僅可以增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，還能促進(jìn)HUVECs的遷移，進(jìn)而促進(jìn)早期血管網(wǎng)的形成。安莉等[17]的研究表明，HUVECs與DPSCs共培養(yǎng)可以促進(jìn)體外血管再生。因此，負(fù)載DPSCs和HUVECs的GelMA水凝膠可用于臨床牙髓血運(yùn)重建治療[18]。本實(shí)驗(yàn)以加入DPSCs和HUVECs的5% GelMA30作為生物墨水，成功打印出同心圓狀間接共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)，為共培養(yǎng)提供了全新的打印模板。

本實(shí)驗(yàn)旨在為構(gòu)建體內(nèi)外均可應(yīng)用的共培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)，為共培養(yǎng)體系的口腔應(yīng)用提供新思路。后續(xù)可在不同共培養(yǎng)環(huán)境中，研究同心圓模型成骨、成牙本質(zhì)、成血管潛能，以期構(gòu)建可用于REPs的共培養(yǎng)體系；也可將該共培養(yǎng)體系與不同種類的支架材料相結(jié)合[19]，構(gòu)建出功能完整、更多樣化的牙髓支架[20]；還可將這種共培養(yǎng)體系植入動(dòng)物體內(nèi)，觀察其REPs的效果。將DPSCs植入外傷的年輕恒牙的治療已有成效[21]，共培養(yǎng)體系的體內(nèi)應(yīng)用也有望實(shí)現(xiàn)。此外，還可以拓寬生物打印的應(yīng)用范圍，推動(dòng)生物打印與口腔領(lǐng)域、組織細(xì)胞培養(yǎng)等多個(gè)領(lǐng)域的融會(huì)貫通。