王小虎 蘭寶鋒 韋圣博 何雙 周禮芹

(廣西科學(xué)院，廣西 南寧 530007)

引言

香蕉(Musa nana Lour)是一種大型的草本植物，屬芭蕉科芭蕉屬，起源于東南亞和西太平洋，在國(guó)內(nèi)主要分布于廣西、廣東、云南、海南以及臺(tái)灣等地[1]。香蕉肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，與蘋(píng)果、柑橘以及葡萄并稱世界4大水果，深受人們的喜愛(ài)。此外，在全球作物種植面積中，香蕉與小麥、玉米水稻以及水稻并稱世界4大糧食作物[2]，香蕉產(chǎn)量位居第1，成為世界上第1大貿(mào)易水果[3]。

香蕉產(chǎn)業(yè)作為一種支柱性產(chǎn)業(yè)，在廣西特色農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[4]，然而，隨著香蕉產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，其面臨的挑戰(zhàn)也日益艱巨，尤其是香蕉枯萎病的防治。香蕉枯萎病又稱巴拿馬病或香蕉黃葉病[5]，是由尖孢鐮刀菌古巴轉(zhuǎn)化型(Fusarium oxysporum f.sp cubense race 4,Foc TR4)侵染香蕉的維管束組織導(dǎo)致組織壞死腐爛的一種毀滅性病害[6]。由于香蕉枯萎病是一種土傳性病害，隨著疾病的蔓延，其產(chǎn)量損失可高達(dá)100%，嚴(yán)重影響香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。值得注意的是，自2006年于廣西發(fā)現(xiàn)的首例香蕉枯萎病至今，香蕉枯萎病一直呈現(xiàn)蔓延的趨勢(shì)，且在近幾年呈指數(shù)型增長(zhǎng)，導(dǎo)致香蕉的種植面積大幅度降低，甚至出現(xiàn)土地被迫荒廢或改種其他農(nóng)作物等情況[7]。因此，亟需一種安全、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行檢測(cè)，從而盡快恢復(fù)香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

傅里葉紅外光譜法(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR)是由分子基團(tuán)振動(dòng)而形成的振動(dòng)吸收光譜[8]，常用于物質(zhì)的定性與定量分析[9]。由于其具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高以及所需樣品量少等特點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于生物、食品和化學(xué)等領(lǐng)域。本研究主要利用傅里葉紅外光譜法對(duì)健康的香蕉葉片以及患香蕉枯萎病的香蕉葉片進(jìn)行檢測(cè)分析，為準(zhǔn)確、高效地鑒定香蕉枯萎病提供一種安全可靠的檢測(cè)方法，也為其它病蟲(chóng)害的檢測(cè)提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田的巴西蕉葉片。

1.2 儀器設(shè)備和測(cè)試條件

實(shí)驗(yàn)儀器主要包括Thermo Scientific 公司Nicolet iS10型傅立葉變換紅外光譜，Millipore超純水儀器，SPS402電子天平，高速粉碎機(jī)，壓片機(jī)，電熱鼓風(fēng)干燥箱。其中，傅立葉變換紅外光譜儀光譜范圍為4000～400cm-1，信號(hào)掃描累加次數(shù)32次[10]，光譜分辨率為4cm-1。

1.3 樣品處理

取4株健康的香蕉葉片與4株患香蕉枯萎病的香蕉葉片分別進(jìn)行烘箱干燥，取適量樣品于高速粉碎機(jī)中粉碎，隨后轉(zhuǎn)入瑪瑙缽中研磨，研磨均勻后進(jìn)行壓片，最后于傅里葉紅外光譜儀中進(jìn)行檢測(cè)，樣品各重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用OMNIC 9.0軟件將采集的紅外光譜信息進(jìn)行吸光度、自動(dòng)基線校準(zhǔn)、平滑9.0和二階導(dǎo)數(shù)處理，保存為T(mén)IF和CSV格式。將導(dǎo)出的CSV數(shù)據(jù)劃分成900～1100cm-1、1100～1400cm-1以及2800～3000cm-13個(gè)波段，將其分別導(dǎo)入PAST 3.0軟件進(jìn)行PCA和聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康與患病香蕉葉的紅外光譜分析

2.1.1 健康香蕉葉紅外光譜分析

由圖1可知，4株健康香蕉葉的紅外光譜圖在波形上極其相似，其吸收峰的位置、數(shù)量以及大小也大致相同。值得注意的是，健康香蕉葉主要包含8個(gè)吸收峰，其波長(zhǎng)依次為1031cm-1、1416cm-1、1462cm-1、1594cm-1、1734cm-1、2848cm-1、2916cm-1、3325cm-1。其中，在1031cm-1處形成一個(gè)強(qiáng)而寬的吸收峰，為多糖C-O-C的伸縮振動(dòng)[11]；1416cm-1附近的吸收峰主要來(lái)自酚類(lèi)物質(zhì)中甲基的C-H的對(duì)稱彎曲振動(dòng)[12]；1462cm-1主要為-CH2-的伸縮振動(dòng)[13]；1594cm-1附近形成一個(gè)較寬的吸收峰，主要為苯環(huán)上C=C骨架的伸縮振動(dòng)[14]；1734cm-1附近形成1個(gè)尖銳的吸收峰，主要為苯環(huán)上C=O的伸縮振動(dòng)[15]；2848cm-1和2916cm-1附近形成2個(gè)極其尖銳的吸收峰，為C-H的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；3325cm-1附近形成的寬吸收峰為-OH的伸縮振動(dòng)[16]。

圖1 4株健康香蕉葉的紅外光譜圖

2.1.2 枯萎病香蕉葉的紅外光譜分析

由圖2可知，枯萎病香蕉葉的紅外光譜圖在波形上大致相似，但仍存在些許差異?？菸∠憬度~主要包含9個(gè)吸收峰，分別位于1030cm-1、1166cm-1、1317cm-1、1462cm-1、1612cm-1、1734cm-1、2847cm-1、2915cm-1、3214cm-1處。其中，在3214cm-1附近存在的寬而弱的吸收峰，為-OH的伸縮振動(dòng)；2915cm-1和2847cm-1處形成的尖銳吸收峰為甲基和亞甲基的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)與對(duì)稱伸縮振動(dòng)[17]；1734～1462cm-1的吸收峰主要為酰胺和羧基振動(dòng)區(qū)，其中1612cm-1處的吸收峰為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶吸收[18]，同時(shí)還可能含有多糖的吸收[17]；1317cm-1處為C-H的剪切式振動(dòng)；1030cm-1處形成的強(qiáng)吸收峰為多糖的C-O-C伸縮振動(dòng)[11]。

2.2 健康香蕉葉與枯萎病香蕉葉的紅外光譜比較

如圖3所示，為健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉紅外光譜的分層譜圖，xjk代表患枯萎病香蕉葉的紅外光譜圖，xj代表健康香蕉葉的紅外光譜圖。由圖可知，2種香蕉葉的紅外光譜圖波形相似，但在不同波長(zhǎng)下的峰數(shù)、峰形與峰強(qiáng)度存在較為明顯的差異，其具體差異如下：在1032cm-1附近，患病香蕉葉形成一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，而健康香蕉葉形成的吸收峰明顯弱于患病香蕉葉；波長(zhǎng)在1100～1500cm-1范圍內(nèi)，2種香蕉葉在吸收峰的數(shù)量以及強(qiáng)度方面存在明顯的差異，健康香蕉葉在1416cm-1和1462cm-1處存在2個(gè)強(qiáng)度較弱的吸收峰，而患枯萎病香蕉葉則在1166cm-1、1317cm-1和1462cm-1處存在3個(gè)較弱的吸收峰；在1594cm-1以及1734cm-1附近，健康香蕉葉比患病香蕉葉的吸收峰更強(qiáng)；在2800～3000cm-1范圍內(nèi)，健康香蕉葉于2916cm-1和2848cm-1處存在2個(gè)最強(qiáng)尖峰，而患枯萎病香蕉葉的吸收峰明顯變?nèi)酢＞C上所述，健康香蕉葉的吸收峰明顯強(qiáng)于患枯萎病香蕉葉，故健康香蕉葉的物質(zhì)成分如糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及碳水化合物等在含量上均高于患枯萎病香蕉葉。

圖2 4株患病香蕉葉的紅外光譜圖

圖3 健康香蕉葉與患病香蕉葉的紅外光譜圖

2.3 健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉的二階導(dǎo)數(shù)分析

二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜可將一些微小的差異放大或?qū)⒅丿B峰展開(kāi)[19]，故對(duì)健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)分析將有利于將2種不同的香蕉葉進(jìn)行區(qū)分。如圖4所示，為健康香蕉葉與患病香蕉葉的二階導(dǎo)數(shù)圖。由圖4可知，2種香蕉葉在二階導(dǎo)數(shù)方面存在顯著差異，在1400～1800cm-1和2800～3000cm-1范圍內(nèi)，健康香蕉葉的二階導(dǎo)數(shù)明顯強(qiáng)于患病香蕉葉。由于2800～3000cm-1附近主要是蛋白質(zhì)與多糖的振動(dòng)吸收峰，故健康香蕉葉的蛋白質(zhì)與多糖含量更高，因此，利用二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜法可以鑒別健康香蕉葉與患病香蕉葉。

圖4 健康香蕉葉與患病香蕉葉的二階導(dǎo)數(shù)圖

2.4 健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉的主成分分析

對(duì)健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉選擇900～1100cm-1、1100～1400cm-1、2800～3000cm-1范圍進(jìn)行主成分1和主成分7分析，其結(jié)果如圖5所示，1為正常香蕉葉，2為患病香蕉葉，主成分1為橫坐標(biāo)，貢獻(xiàn)率為99.28%，主成分7為縱坐標(biāo)，貢獻(xiàn)率為0.29%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.57%，說(shuō)明以主成分1和主成分7為代表進(jìn)行主成分分析是真實(shí)可靠的。由圖5可知，健康香蕉葉與患病香蕉葉分別聚合在2個(gè)不同的區(qū)域，并且兩者之間無(wú)交叉，說(shuō)明利用主成分1和主成分7 2種成分能明顯地區(qū)分健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉。

圖5 4株健康香蕉葉與4株患枯萎病香蕉葉PCA分析

2.5 健康香蕉葉與患病香蕉葉的聚類(lèi)分析

圖6為健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉在900～1100cm-1、1100～1400cm-1、2800～3000cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)聚類(lèi)分析圖。由圖6可知，健康香蕉葉分為2類(lèi)聚類(lèi)，分別為xj1和xj4，xj3和xj2；患病香蕉葉分為3類(lèi)聚類(lèi)，分別為xjk2和xjk4，xj1與xjk2、xjk4聚為1類(lèi)，xjk3與xj1、xjk2、xjk4聚為1類(lèi)。4株健康香蕉葉和4株患病香蕉葉各聚為一大類(lèi)，說(shuō)明利用該聚類(lèi)方法可有效區(qū)分健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉。

圖6 4株健康香蕉葉與4株患枯萎病香蕉葉的二階

3 討論

由傅里葉紅外光譜圖可知，2種不同的香蕉葉片在波形上極其相似，但在吸收峰的位置、強(qiáng)度以及大小方面存在顯著差異。在本研究中，4株健康香蕉葉的紅外光譜圖基本完全一致，4株患病香蕉葉中有一株香蕉枯萎病葉的圖譜與其他3株葉片的圖譜略有差異，可能是由其患病程度的不同而導(dǎo)致。此外，經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)光譜分析以及二階導(dǎo)數(shù)圖譜分析，健康香蕉葉具有更強(qiáng)的吸收峰強(qiáng)度，從而表明健康香蕉葉的物質(zhì)成分如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖等在含量上均高于患病香蕉葉。將900～1100cm-1、1100～1400cm-1和2800～3000cm-13個(gè)具有顯著差異的波段進(jìn)行PCA分析與聚類(lèi)分析，可以清楚地區(qū)分出健康香蕉葉與患病香蕉葉。綜上所述，利用傅里葉紅外光譜分析技術(shù)，結(jié)合PCA分析以及聚類(lèi)分析可以快速、準(zhǔn)確、高效地區(qū)分出健康香蕉葉與患病香蕉葉，為準(zhǔn)確、高效地鑒定香蕉枯萎病提供一種安全可靠的檢測(cè)方法，也為其它病蟲(chóng)害的檢測(cè)提供一種新的研究思路。

4 結(jié)論

傅里葉光譜顯示健康香蕉葉的吸收峰明顯強(qiáng)于患病香蕉葉，因此健康香蕉葉的物質(zhì)成分如糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及碳水化合物等在含量上均高于患病香蕉葉。

通過(guò)對(duì)900～1100cm-1、1100～1400cm-1和2800～3000cm-13個(gè)具有顯著差異二階導(dǎo)數(shù)的波段進(jìn)行PCA分析與聚類(lèi)分析，可以快速清楚地區(qū)分出健康香蕉葉與患枯萎病病香蕉葉。