徐方飚， 趙 哲， 謝 抗， 王新志

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000；2.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

再灌注損傷存在于心腦血管、肝腎臟、子宮移植等疾病變化過程中[1-4]，是缺血后恢復(fù)血流，使得相關(guān)組織細(xì)胞在再灌注過程中進一步受到的損傷[5]。在心血管疾病中，由于再灌注后改變了血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得血管消除阻塞后仍不能完全實現(xiàn)組織血液灌注，嚴(yán)重時可表現(xiàn)為心肌功能障礙、血流微循環(huán)障礙等危及生命的病理現(xiàn)象。在腦缺血再灌注中，大量免疫細(xì)胞會在損傷部位聚集，并在短時間內(nèi)大量釋放細(xì)胞分裂素和氧自由基等物質(zhì)，能夠直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，從而造成內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的損傷[6]，肝臟中再灌注損傷病理機制根據(jù)目前研究主要在無氧代謝、氧化應(yīng)激等方面[7]，腎臟中病理機制如內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)等[8]。中藥對于減輕缺血再灌注損傷是全面的，含括減少自由基、控制炎癥反應(yīng)等等多方面[9-10]。

中藥在再灌注損傷中的病理機制已有一定的基礎(chǔ)，涉及通路[11]、抗氧化、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]、藥代動力學(xué)[13]等方面。本研究旨在通過現(xiàn)有知識結(jié)構(gòu)及數(shù)據(jù)庫構(gòu)建缺血再灌注損傷機制核心靶點與中藥成分及中藥的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，利用數(shù)學(xué)思維幫助基礎(chǔ)實驗及臨床上中藥選擇，補充中醫(yī)基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證據(jù)以及開拓新藥研發(fā)思路。

1 材料與方法

1.1 再灌注損傷靶點獲取 通過檢索文本挖掘數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Disgenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)，以“reperfusion injury”為檢索詞，獲取再灌注損傷相關(guān)靶點，并作取交集處理，作為關(guān)鍵靶點。取交集的做法能夠一定程度的緩解不同數(shù)據(jù)庫信息不對等的狀況，并對獲得關(guān)鍵靶點輸入Unipot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)由Gene symbol轉(zhuǎn)換成蛋白名稱。

1.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及篩選核心靶點 將關(guān)鍵靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)中，蛋白種類設(shè)置為智人(Homosapiens)，證據(jù)評分(minimum required interaction score)選取最高評分0.9分，獲取蛋白相互作用關(guān)系。將獲取的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI)輸入Cytoscape 3.7.2軟件中可視化呈現(xiàn)及拓?fù)浞治龊螳@取核心靶點。

1.3 構(gòu)建“化合物-核心靶點”網(wǎng)絡(luò) 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，收集與核心靶點相關(guān)的化合物，并以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選化合物后[14-16]，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建“化合物-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)，同時保存化合物對應(yīng)中藥及化合物分子結(jié)構(gòu)。

1.4 構(gòu)建“核心靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge插件融合“核心靶點-化合物”和“化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)，最終可視化“核心靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 核心靶點與化合物對接驗證 在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中檢索并下載核心靶點3D結(jié)構(gòu)，利用Autodock 4.2.6軟件進行分子對接，進一步評估核心靶點與化合物之間的聯(lián)系[17]。

1.6 數(shù)據(jù)挖掘 參照“十二五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[18]及2020年版《中國藥典》，獲取核心靶點對應(yīng)中藥的性味歸經(jīng)，利用Origin 2019b繪圖軟件繪制柱狀圖、散點圖和條形圖。

2 結(jié)果

2.1 再灌注損傷靶點篩選 經(jīng)過Genecards數(shù)據(jù)庫和Disgenet數(shù)據(jù)庫檢索、比對后，共獲得85個關(guān)鍵靶點，見圖1。

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 為了明確85個關(guān)鍵靶點中的核心靶點，利用STRING數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件可視化后利用Cytohubba 0.1插件對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以獲取度值不小于中位數(shù)2倍，即度值不小于18的靶點為核心靶點。共獲得6個核心靶點，按度值從大到小依次為STAT3(度值26)、JUN(度值24)、TNF(度值24)、RELA(度值19)、IL1B(度值19)、IL6(度值18)，見圖2。圖中關(guān)鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)黃色節(jié)點為核心靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點顏色越紅則靶點度值越高。

2.3 “化合物-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過對TCMSP數(shù)據(jù)庫的全面檢索，共得到41個經(jīng)口服利用度和類藥性篩選后的化合物與6個核心靶點相對應(yīng)，將對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“化合物-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中核心靶點為菱形，化合物為六邊形節(jié)點，節(jié)點大小以該節(jié)點度值為標(biāo)準(zhǔn)，即度值越大，節(jié)點越大。

2.4 構(gòu)建“核心靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò) 為了更好的了解中藥與成分與靶點之間的聯(lián)系，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“核心靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。由于中藥數(shù)量較大，不便于觀察，節(jié)選中藥度值不小于4的中藥進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。6個靶點度值代表所對應(yīng)的成分個數(shù)，依次為轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA，度值26)、腫瘤壞死因子(TNF，度值19)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN，度值14)、白介素6(IL6，度值12)、白介素1β(IL1B，度值7)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3，度值4)。度值排名前5的成分為β-谷甾醇(MOL000358，度值246)、槲皮素(MOL000098，度值193)、山柰酚(MOL000422，度值136)、木犀草素(MOL000006，度值97)、異鼠李素(MOL000354，度值41)，41個化合物信息見表1。中藥度值不小于5的有45個，條形圖見圖5。

表1 化合物信息及度值

2.5 分子對接結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取41個成分結(jié)構(gòu)，利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲取STAT3、TNF、JUN、IL1B、RELA、IL6分子結(jié)構(gòu)，pymol 2.3.1去除水分子和自身配體，AutoDockTools-1.5.6軟件進行分子對接。小分子化合物與蛋白之間相互作用的強度可用結(jié)合力(Affinity)表示，Affinity值越低，結(jié)合力越強[19]。若結(jié)合力<0 kcal/mol，表明配體分子能與受體蛋白進行自發(fā)的結(jié)合[20]。結(jié)合力熱圖見圖6，圖中顏色越紅則結(jié)合力越強。聚類歸整后，STAT3與41個成分整體結(jié)合力較高，IL1B與RELA較為相似，IL6與TNF較為相似，故這兩組聚類在一起，JUN則整體最低。為了更好地展現(xiàn)各靶點分子結(jié)構(gòu)，在這6個靶點中選取各自結(jié)合力最強的，展示其結(jié)合構(gòu)象的2D與3D展示圖像，見圖7。構(gòu)象2D圖中，鏈接的紅色虛線為疏水作用，綠色虛線氫鍵作用，字母代表結(jié)合位點的氨基酸，氫鍵作用力與氨基酸殘基之間的疏水作用力是結(jié)合穩(wěn)定的主要存在。

2.6 中藥性味歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計 共收集381味中藥，大部分中藥均有入肝經(jīng)的功效，苦、寒藥居多，見圖8～9。中醫(yī)在治療時的理念是整體論治，而本研究對象為再灌注損傷，其可以出現(xiàn)在全身多個部位，同時本次統(tǒng)計結(jié)果包含所有十二正經(jīng)，符合疾病本身病理特性，符合中醫(yī)整體論治的理念。歸三焦經(jīng)的兩味中藥分別是香附與梔子，同時，這2味中藥的度值分別為5、3，成分中與香附有聯(lián)系的為MOL000006、MOL000098、MOL000354、MOL000358、MOL000422，與梔子有聯(lián)系的為MOL000098、MOL000358、MOL000422。所含成分根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫可調(diào)控除STAT3外的5個核心靶點，但通過分子對接顯示，它們與STAT3靶點的結(jié)合力較好，不排除結(jié)合的可能性，有待進一步驗證。

3 討論

再灌注損傷可以發(fā)生在全身各個臟器中，造成的連鎖反應(yīng)給予疾病恢復(fù)等各方面一定程度的打擊。目前，對于再灌注損傷的機制研究趨于完善，治療上受限于發(fā)病機制較多，結(jié)合患者個人體質(zhì)原因復(fù)雜，西藥的單一成分、單靶點及常規(guī)輸液治療方式起到的治療效果有限。中藥中成分多，多靶點多通路，同時對多種發(fā)病機制的共同干預(yù)，治療方式以口服湯藥為主要，并且已有一定的臨床療效及病理基礎(chǔ)研究[21-22]。本研究通過符合中藥多靶點多機制干預(yù)特性的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建靶點到中藥成分之間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過分析統(tǒng)計后，總結(jié)出中藥在減少再灌注損傷的用藥規(guī)律。

白果、菊花、葫蘆巴、木蝴蝶和山豆根調(diào)控多個再灌注損傷的核心靶點。現(xiàn)代藥理學(xué)對于白果，既銀杏成熟種子的基礎(chǔ)研究較多，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中研究與應(yīng)用較多，能夠促進腦部供血，改善癡呆患者學(xué)習(xí)記憶能力，同時能夠減少腦組織損傷，保護神經(jīng)功能[23]。菊花中多成分[24]、多部位[25]均具有抗氧化作用，張永利等[26]發(fā)現(xiàn)，在抗視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的兔模型中，菊花通過影響SOD、MDA活性，從而達到減少再灌注損傷的功效。就成分而言，多成分已發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用，如槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素[27-30]。

本研究對6個核心靶點及41種成分進行高通量的分子對接模擬，結(jié)合能熱圖顯示，它們均有良好對接，并且達到具有一定的結(jié)合活性標(biāo)準(zhǔn)。其中STAT3與41種成分整體對接活性較高，但目前關(guān)于此靶點的中藥作用機制研究較少，TCMSP數(shù)據(jù)庫中僅有4種成分、8味中藥證實能夠調(diào)節(jié)此靶點，同時STAT3是PPI網(wǎng)絡(luò)中度值最高的靶點，提示其可作為潛在有效的治療靶點。STAT3在心臟、大腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎臟和胰腺均有表達，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，能夠介導(dǎo)細(xì)胞對白介素和一些列生長因子的反應(yīng)[31]。JUN與41種成分結(jié)合整體偏低，考慮與JUN自身蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，其蛋白結(jié)構(gòu)是長條型蛋白，空間交錯較少，這意味著與小分子的結(jié)合均在蛋白結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合。結(jié)合力熱圖中，花生四烯酸與6個核心靶點結(jié)合力均處于勉強能夠結(jié)合的狀態(tài)，與自身復(fù)雜結(jié)構(gòu)一定關(guān)系?；ㄉ南┧峥烧{(diào)節(jié)多種炎癥因子表達，同時其代謝通路亦影響多種炎性因子水平[32]。任越等[33]利用藥效團模型，基于花生四烯酸代謝通路匹配出適合應(yīng)用于抑制炎癥風(fēng)暴的藥物，與本研究中的成分多數(shù)重合。

中醫(yī)認(rèn)為肝藏血，再灌注損傷相關(guān)中藥歸肝經(jīng)居多，基于此，本研究認(rèn)為藥物代謝與這中間具有一定的聯(lián)系。目前有研究表明，藥物代謝與肝藥酶有關(guān)，亦可從此角度來探討中藥歸經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)中藥亦涉及肺經(jīng)，肺主治節(jié)，朝百脈，具有宣發(fā)和肅降的作用。肝與肺均對全身氣血運行起到重要調(diào)節(jié)作用，再灌注損傷發(fā)生的場所大多處于脈內(nèi)，氣攝血于脈內(nèi)，肝臟與肺是人體氣機，提示再灌注損傷中的物質(zhì)基礎(chǔ)與中醫(yī)中氣概念的存在一定的聯(lián)系。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，以再灌注損傷相關(guān)靶點作為出發(fā)點，探尋中藥減少再灌注損傷的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及一般應(yīng)用規(guī)律，為中醫(yī)理論現(xiàn)代化研究提供了新的切入點，也為進一步基礎(chǔ)研究深入開發(fā)可減少再灌注損傷的天然制劑提供思路，還可為中西醫(yī)結(jié)合治療再灌注損傷的用藥提供借鑒。