陸馨雨， 張澤宇， 司鵬飛， 秦路平， 王小艷

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000)

新冠肺炎病毒肺炎(COVID-19)是影響全球社會(huì)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生事件[1]。中醫(yī)認(rèn)為，COVID-19屬于“寒濕疫”的范疇[2]，病因?yàn)闈穸綶3]，病機(jī)為濕毒壅肺、阻遏氣機(jī)，病位在肺，多涉及脾、胃，重癥期可波及心、腎[4]。我國臨床醫(yī)生及科研團(tuán)隊(duì)嘗試運(yùn)用中醫(yī)藥經(jīng)典方劑或現(xiàn)有中成藥對新冠肺炎開展辨證施治，從中篩選抗新型冠狀病毒的有效藥物，復(fù)方板藍(lán)根顆粒(FFBLG)是一種實(shí)驗(yàn)有效的陽性候選藥物。

復(fù)方板藍(lán)根顆粒的主要組成為大青葉與板藍(lán)根，兩者植物基源相同[5]。中醫(yī)認(rèn)為，這2味藥物性味均苦寒，善能清熱解毒，此外還具涼血、消腫之效，因而被歷代醫(yī)家廣泛用于治療各類傳染性疫病(古稱“天行”)，尤其是伴有出血、發(fā)斑或咽喉腫痛者。在現(xiàn)代臨床治療中，復(fù)方板藍(lán)根顆粒主要用于風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛等癥。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根及大青葉對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腮腺炎病毒、流感病毒、乙肝病毒等均有一定的抑制作用。本研究運(yùn)用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)(TCMIP)V2.0[6]，旨在通過數(shù)據(jù)挖掘與分析，構(gòu)建方劑-中藥材-成分-核心靶標(biāo)-通路-疾病多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，闡釋復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)新型冠狀病毒肺炎的潛在作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 有效成分及相應(yīng)靶標(biāo)分析 采用TCMIP V2.0平臺(tái)(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)，在“中藥材數(shù)據(jù)庫”模塊中檢索板藍(lán)根、大青葉所有化學(xué)成分，根據(jù)結(jié)構(gòu)類似的生物分子化合物具有類似的理化性質(zhì)和生物活性原理，在TCMIP V2.0中采用化合物二維結(jié)構(gòu)相似性搜索，通過與FDA上市藥物進(jìn)行Tanimoto系數(shù)計(jì)算相似性分值，預(yù)測有效成分相應(yīng)靶標(biāo)[7]。本研究選擇相似性≥0.8作為篩選條件，得到有效成分預(yù)測作用靶標(biāo)，并進(jìn)一步數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，自主創(chuàng)建數(shù)據(jù)集“復(fù)方板藍(lán)根顆粒方劑庫”。

1.2 COVID-19疾病靶標(biāo)分析 TCMIP V2.0平臺(tái)中疾病相關(guān)的靶標(biāo)基因及其相關(guān)數(shù)據(jù)來源于基因相關(guān)性數(shù)據(jù)庫(DisGeNET)、人類表型本體數(shù)據(jù)庫(HPO)、Drugbank數(shù)據(jù)庫、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(TTD)等[8]，本研究選擇“疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘”模塊，根據(jù)COVID-19在臨床上的3個(gè)主要癥狀，即“肺炎(pneumonia)”“發(fā)燒(fever)”“咳嗽(cough)”，挖掘獲得相應(yīng)的靶標(biāo)基因，由此構(gòu)建相關(guān)疾病靶標(biāo)[9-10]。

1.3 干預(yù)COVID-19潛在作用靶標(biāo)分析 采用Venn Diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，將“1.1”“1.2”項(xiàng)下所得復(fù)方板藍(lán)根顆粒有效成分的靶標(biāo)與COVID-19疾病靶標(biāo)進(jìn)行映射，從而獲得干預(yù)COVID-19的潛在作用靶標(biāo)。

1.4 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶標(biāo)篩選 采用TCMIP V2.0平臺(tái)中的“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊，得到靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。在選擇核心節(jié)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，以連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)的中位數(shù)為卡值，以同時(shí)滿足三者為條件篩選出核心靶標(biāo)。

1.5 基因功能GO分析、信號通路Reactome Pathway富集分析 采用TCMIP V2.0平臺(tái)中的“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊，對“1.4”項(xiàng)下所得核心靶標(biāo)進(jìn)行基因功能GO分析和信號通路Reactome Pathway富集分析，以P值升序排列，其值越小，分析可信度越高。

2 結(jié)果與討論

2.1 有效成分與相應(yīng)靶標(biāo)預(yù)測 復(fù)方板藍(lán)根顆粒中板藍(lán)根、大青葉所含有效成分共39種，前者25種，后者24種；相應(yīng)靶標(biāo)389個(gè)，前者290個(gè)，后者336個(gè)。

2.2 COVID-19疾病靶標(biāo) 根據(jù)COVID-19在臨床上的3個(gè)主要癥狀，獲得COVID-19相關(guān)的疾病靶標(biāo)共258個(gè)。

2.3 干預(yù)COVID-19的潛在作用靶標(biāo) 將“2.1”“2.2”項(xiàng)下復(fù)方板藍(lán)根顆粒有效成分靶標(biāo)與COVID-19疾病靶標(biāo)映射取交集，共獲得16個(gè)干預(yù)COVID-19的潛在作用靶標(biāo)(圖1)，包括VCP、ABCC2、ABL1、ADA、AK2、FBP1、HBB、NME1、PRKAR1A、TLR4、TP53、ACTA1、NFκB1、NFκB2、PNP、PRKCD。其中，AK2定位于線粒體的膜間隙，主要功能是作用于底物AMP，并通過催化可逆的磷酸基轉(zhuǎn)移反應(yīng)來激活A(yù)TP濃度敏感的信號通路[7,11]，在細(xì)胞凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[12]；NME1基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其啟動(dòng)子區(qū)rs16949649、rs3760468、rs3760469、rs2302254等單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)基因多態(tài)性與肺癌易感性和預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，SNPs基因突變可影響NME1基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合, 進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄和蛋白表

達(dá)，并影響腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后[13]；TLR4主要通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB炎癥通路后啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等作用[14]，與病源相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式相結(jié)合，促進(jìn)IL-6、IL-1、IFN-γ、TNF-α等免疫炎癥因子分泌，進(jìn)而趨化、激活巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致呼吸道、肺泡及肺血管炎癥反應(yīng)產(chǎn)生[15]；TP53是編碼腫瘤蛋白p53的抑癌基因，為人類多種癌癥中最常見的突變基因之一[16]，其突變型可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、生存、侵襲，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性，破壞正常組織的生理結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞代謝[17]；NF-κB是一種廣泛存在于真核生物內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，NFκB1、NFκB2為其家族成員，其通路在細(xì)胞增殖、存活、早期病毒應(yīng)答及細(xì)胞因子分泌、促炎等方面具有重要作用[18]。根據(jù)交叉靶標(biāo)目前已發(fā)現(xiàn)的功能特點(diǎn)來推測，復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19時(shí)可能主要參與炎癥反應(yīng)、激活A(yù)TP、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、參加免疫反應(yīng)、抑制細(xì)胞增殖分化、清理氣道、改善通氣等，通過修復(fù)或緩解肺損傷、咳喘、呼吸困難等主要癥狀起到防治作用。

2.4 干預(yù)COVID-19的多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 采用TCMIP V2.0的數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，構(gòu)建復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19的方劑-中藥材-成分-核心靶標(biāo)-通路-疾病多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖2。由此可知，干預(yù)作用主要與5種有效成分相關(guān)聯(lián)，作用于17條主要通路的76個(gè)核心靶標(biāo)，即能通過多途徑、多靶標(biāo)、多環(huán)節(jié)來干預(yù)COVID-19。

2.5 干預(yù)COVID-19的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò) 核心靶標(biāo)共26個(gè)，見表1。其中，Akt1是PI3K途徑中重要的分子，活化后可磷酸化下游多個(gè)細(xì)胞激酶[19]，PI3K/Akt信號通路是腫瘤研究的熱門通路，在肺腺癌中被激活，并與低分化、進(jìn)展期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，并且Akt1是肺腺癌預(yù)后的影響因素之一[20]；TSC1/2復(fù)合體位于PI3K-Akt下游，Akt磷酸化可通過抑制TSC1/TSC2的活性來對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，同時(shí)TSC1對細(xì)胞的增殖具有調(diào)節(jié)作用[21-22]，TSC1表達(dá)升高有助于抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖與分化，對肺纖維化起到抑制作用[23]；IL10通過作用于不同的免疫細(xì)胞介導(dǎo)免疫抑制，使其產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子或抑制某些分子的表達(dá)，介導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤免疫抑制，從而使機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞增殖失控、免疫逃逸[24-27]，主要由Treg、Breg細(xì)胞的某些特定亞型分泌抑制性調(diào)節(jié)因子，肺癌患者體內(nèi)往往都存在不同程度的免疫抑制，兩者作為腫瘤微環(huán)境的重要負(fù)性調(diào)節(jié)成分，介導(dǎo)免疫抑制[28]；IL-6/IL-10對重癥肺炎具有較好診斷價(jià)值，可用于鑒別入院時(shí)重癥肺炎，有助于篩查可能發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，對臨床治療具有一定指導(dǎo)意義[29]；JAK2激活后可使STAT的酪氨酸磷酸化，JAK2/STAT3信號通路的激活參與肺癌發(fā)生發(fā)展及機(jī)體細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程[30-31]；BCL2位于線粒體外膜上，其家族在凋亡基因調(diào)控中起著重要作用[32]，主要通過促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)、抑制促凋亡基因表達(dá)、干擾線粒體膜的通透性來阻礙肺癌細(xì)胞凋亡。根據(jù)核心靶標(biāo)目前已發(fā)現(xiàn)的功能特點(diǎn)推測，復(fù)方板藍(lán)根顆?？赡軈⑴c炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、參加免疫反應(yīng)、抑制細(xì)胞增殖分化、抑制肺纖維化等，推測可能通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)肺功能等途徑來干預(yù)COVID-19。

表1 復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19核心靶標(biāo)

2.6 核心靶標(biāo)生物功能注釋和通路富集 表2顯示，復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19主要通過影響細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化、磷酸化、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA模板、細(xì)胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)、B細(xì)胞增殖、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、凋亡的調(diào)控、I-κB激酶/NF-κB信號傳導(dǎo)、DNA損傷誘導(dǎo)蛋白磷酸化、基因表達(dá)的正調(diào)控、B細(xì)胞分化、對脂多糖的反應(yīng)、病毒過程、細(xì)胞對機(jī)械刺激的反應(yīng)、對UV-B的反應(yīng)、細(xì)胞周期停滯、對γ射線的反應(yīng)、B細(xì)胞活化等生物過程發(fā)揮作用。表3顯示，復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19主要通過影響白介素4和白介素13信號、IκBA變體導(dǎo)致EDA-ID、RHO GTPases激活NADPH氧化酶、磷酸化調(diào)節(jié)TP13活性、白介素7信號、ZBP1進(jìn)行RIP介導(dǎo)的NFκB激活、白介素10信號、顆粒狀外源抗原的交叉展示、RUNX2調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、TRAF6介導(dǎo)的NF-κB激活、白介素9信號、白介素23信號、TP53調(diào)節(jié)代謝基因、白細(xì)胞介素受體SHC信號、白介素12信號、MAPK3(ERK1)激活、白介素21信號、在NMDAR下游激活A(yù)MPK，LκB1-AMPK對mTOR的能量依賴性調(diào)節(jié)、白介素6信號等信號通路發(fā)揮作用。

表2 復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19核心靶點(diǎn)GO功能分析(前20條生物過程)

表3 復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19核心靶標(biāo)的Reactome Pathway分析(前20條信號通路)

復(fù)方板藍(lán)根顆粒干預(yù)COVID-19核心靶標(biāo)的Reactome Pathway富集分析見圖3，可知白介素信號通路較為主要。已有研究表明，白介素信號通路影響多種生物過程，如IL-13能夠?qū)獾姥装Y與免疫反應(yīng)進(jìn)行有效調(diào)節(jié)[33]；IL-7高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良正相關(guān)[34]；IL-10是一種重要的抑炎性細(xì)胞因子，可參與機(jī)體的免疫功能和炎癥過程，具有廣泛的抑制炎性因子的作用[35]；IL-9和IL-10之間存在密切聯(lián)系，兩者相互作用影響，前者可作用于參與哮喘等多種疾病發(fā)病的炎癥細(xì)胞中[36]；IL-17是由輔助性T細(xì)胞17(Th17)分泌的一種促炎癥細(xì)胞因子；IL-23是一種促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17表達(dá)的調(diào)節(jié)因子[37]；IL-12主要由抗原刺激的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生, 可通過調(diào)控JAK-STAT信號通路分別誘導(dǎo)干擾素γ (IFN-γ)、IL-17表達(dá)，從而發(fā)揮促炎作用[38]；IL-21可促進(jìn)IL-17的表達(dá)，兩者協(xié)同作用時(shí)可誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、GM-CSF等促炎因子，影響氣道纖維結(jié)締組織的形成和平滑肌的增生[39]；IL-6是早期炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，由纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及T、B淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)活性，促使?jié){細(xì)胞分泌抗體，刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)[40]。因此，白介素信號通路多與肺部損傷、炎癥與免疫反應(yīng)有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究基于TCMIP V2.0平臺(tái)的數(shù)據(jù)挖掘與分析功能，獲得并預(yù)測了復(fù)方板藍(lán)根顆粒組方中兩味中藥的有效成分及其作用靶標(biāo)，同時(shí)根據(jù)COVID-19的3個(gè)主要臨床癥狀構(gòu)建了COVID-19相關(guān)的疾病靶標(biāo)，通過靶標(biāo)映射、基因功能GO分析、信號通路Reactome Pathway富集分析等研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方板藍(lán)根顆?？赡苤饕ㄟ^影響白介素信號通路等，以達(dá)到抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖分化、修復(fù)肺部損傷等多方面的作用，從而起到干預(yù)COVID-19的綜合功效。此外，根據(jù)新冠肺炎4個(gè)病期的證候以及臨床表現(xiàn)[41]，本研究推測復(fù)方板藍(lán)根顆?？赡軐π鹿诜窝椎母煽取⒖人源?、呼吸困難、動(dòng)輒氣喘或需要輔助通氣等癥狀起到一定的干預(yù)治療作用，適用于COVID-19各個(gè)病期階段的治療，相關(guān)的功效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床驗(yàn)證。