樊燕燕， 張石在

(鄂爾多斯應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

腦缺血是最常見的臨床疾病之一，血運快速重建是腦缺血最有效治療方法之一，然而再灌注可引起缺血區(qū)域氧化應(yīng)激和炎癥損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，進一步加重腦損傷[1]。因此，保護神經(jīng)元細(xì)胞免受缺血再灌注(I/R)損傷將為缺血性腦病治療提供理論參考。肉蓯蓉總苷是肉蓯蓉中主要活性成分，具有滋補肝腎、益精血、抗氧化、抗衰老、免疫增強和神經(jīng)保護作用[2]。早期研究顯示，肉蓯蓉總苷可減少降低腦組織梗死面積，增強抗氧化酶活性，防止脂質(zhì)過氧化，減輕腦組織病理損傷，抑制腦細(xì)胞凋亡，對小鼠腦I/R具有保護作用[3-4]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類缺乏編碼能力、長度大于200 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本，近年來研究證實lncRNA是大腦發(fā)育和許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要調(diào)節(jié)劑。lncRNA生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5)因在雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯中表達升高而得名，已有研究顯示在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元中l(wèi)ncRNAGAS5表達上調(diào)，并對細(xì)胞存活具有負(fù)調(diào)控作用[5]。抑制lncRNAGAS5表達可增加深低溫停循環(huán)(DHCA)后神經(jīng)元存活數(shù)量，改善大鼠DHCA后認(rèn)知和記憶功能，減輕大鼠DHCA后腦損傷[6]。本研究以PC12細(xì)胞氧糖剝奪再復(fù)氧復(fù)糖模型模擬體外腦缺血再灌注損傷[7]，觀察肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞活力、凋亡、炎癥反應(yīng)的影響，并探討其機制是否與調(diào)控lncRNAGAS5表達有關(guān)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑與藥物 肉蓯蓉總苷(純度80%，貨號YN048)購自山西玉寧生物科技有限公司，實驗時用含血清培養(yǎng)基配置所需濃度。人工腦脊液購自南京億迅生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)、兔源半胱氨酸蛋白酶3前體(pro-caspase3)、裂解的caspase3(cleaved-caspase3)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、羊抗兔IgG抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒上海廣銳生物科技有限公司；SYBR-Green Master Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程 (大連) 有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和模型構(gòu)建 PC12細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(補充10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗)置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。糖氧剝奪模型制備參考張蕾等[7]報道方法進行，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗，將DMEM培養(yǎng)基更換為無糖無血清的人工腦脊液模擬無氧無糖環(huán)境，置于37 ℃含95% N2、5% CO2缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。

2.2 實驗分組和處理 細(xì)胞分為對照組，PC12細(xì)胞不進行糖氧剝奪，僅更換為無血清DMEM培養(yǎng)基于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；I/R組，PC12細(xì)胞氧糖剝奪4 h后，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h；肉蓯蓉總苷低、中、高劑量組，PC12細(xì)胞氧糖剝奪4 h后，更換為含6.5、12.5、25.0 μg/mL肉蓯蓉總苷[4]的無血清DMEM培養(yǎng)基復(fù)氧復(fù)糖20 h；si-NC組、si-GAS5組，分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-GAS5的PC12細(xì)胞氧糖剝奪4 h后，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h；肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA組、肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA-GAS5組，轉(zhuǎn)染pcDNA或pcDNA-GAS5的PC12細(xì)胞氧糖剝奪4 h后，用含25.0 μg/mL肉蓯蓉總苷的無血清DMEM培養(yǎng)基復(fù)氧復(fù)糖20 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照Lipofectamine 2000使用說明進行。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL后接種于96孔板，每孔100 μL，貼壁后每孔加入10 μL CCK-8工作液，培養(yǎng)2 h后采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取各孔光密度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞活力。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌各組細(xì)胞，1×結(jié)合緩沖液重懸后，向100 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI室溫避光染色15 min，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。早期凋亡(Annexin V+/PI-)和晚期凋亡(Annexin V+/PI+)之和表示細(xì)胞凋亡率。

2.5 Western blot檢測pro-caspase3和cleaved-caspase3表達 用RIPA緩沖液裂解各組細(xì)胞總蛋白，檢測蛋白濃度后，取等量蛋白上樣至各孔進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉，特異性一抗溶液4 ℃孵育過夜，次日加二抗室溫孵育2 h，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用Image J軟件對目的條帶灰度進行定量分析。

2.6 試劑盒檢測TNF-α、IL-6水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心10 min后取上清液。按照大鼠TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒步驟加入待檢樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)、檢測抗體、底物，終止反應(yīng)后，15 min內(nèi)采用酶標(biāo)儀檢測各孔OD450 nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照方程計算上清液中TNF-α、IL-6水平。

2.7 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNAGAS5表達 使用TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR-Green Master Mix說明書進行RT-qPCR擴增。GAS5正向引物5′-TGGTTCTGCTCCTGGTAACG-3′，反向引物5′-AGGATAACAGGTCTGCCTGC-3′；GAPDH正向引物5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGA-3′，反向引物5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法對lncRNAGAS5相對表達進行分析。

3 結(jié)果

3.1 肉蓯蓉總苷對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響 與對照組比較，I/R組細(xì)胞活力、pro-caspase3蛋白表達降低，凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)；與I/R組比較，肉蓯蓉總苷中、高劑量組細(xì)胞活力、pro-caspase3蛋白表達升高，凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 肉蓯蓉總苷對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響

3.2 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞炎癥因子水平的影響 與對照組比較，I/R組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與I/R組比較，肉蓯蓉總苷中、高劑量組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

3.3 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞lncRNAGAS5表達的影響 與對照組比較，I/R組細(xì)胞lncRNAGAS5表達升高(P<0.05)；與I/R組比較，肉蓯蓉總苷中、高劑量組細(xì)胞lncRNAGAS5表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表3。

3.4 抑制GAS5表達對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷及炎癥因子水平的影響 與si-NC組比較，si-GAS5組細(xì)胞活力、pro-caspase3蛋白表達升高，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達及細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，見圖2、表4。

表2 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞炎癥因子水平的影響

表3 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞lncRNA GAS5表達的影響

表4 抑制GAS5表達對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷及炎癥因子水平的影響

3.5 過表達GAS5逆轉(zhuǎn)肉蓯蓉總苷對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響 與肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA組比較，肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA-GAS5組細(xì)胞活力、pro-caspase3蛋白表達降低，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，見表5、圖3。

3.6 過表達GAS5逆轉(zhuǎn)肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞中炎癥因子水平的影響 與肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA組比較，肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA-GAS5組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)，見表6。

表5 過表達GAS5逆轉(zhuǎn)肉蓯蓉總苷對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響

表6 過表達GAS5逆轉(zhuǎn)肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞中炎癥因子的影響

4 討論

腦缺血損傷是世界范圍內(nèi)僅次于心血管疾病和癌癥的常見死亡原因，研究顯示，即使短暫性腦缺血也可導(dǎo)致海馬區(qū)錐體遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，甚至誘發(fā)認(rèn)知缺陷，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[8]。因此，尋找有效的策略抑制神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷十分重要。

肉蓯蓉總苷是肉蓯蓉的主要活性成分，由咖啡酸、糖基和苯乙醇苷元3部分組成，具有較好的缺血再灌注保護作用。Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)注射苯乙醇苷類化合物能縮小大鼠心臟梗死面積，降低心肌組織中抗凋亡蛋白表達，并抑制心肌細(xì)胞凋亡。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉總苷治療能降低大腦中動脈閉塞-再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損評分和梗塞體積，促進血管生成和神經(jīng)重塑，提高腦組織抗氧化活性，并有效維持血腦屏障的完整性。此外，肉蓯蓉總苷亦可提高大鼠腎組織X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)表達，減少腎臟細(xì)胞凋亡，保護大鼠腎臟免受缺血再灌注損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量肉蓯蓉總苷可提高細(xì)胞活力，降低缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性。caspase-3是內(nèi)源線粒體途徑和外源性死亡受體凋亡途徑caspase級聯(lián)反應(yīng)的終極效應(yīng)因子，caspase-3的激活可切割DNA，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)特征改變，引起細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉總苷能降低缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞cleaved-caspase3表達，提高pro-caspase-3表達，與其抗凋亡作用一致。糖氧剝奪再復(fù)糖復(fù)氧實驗除導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、促凋亡因子表達和線粒體功能障礙外，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡亦有促進作用[12]。本研究顯示，肉蓯蓉總苷能降低缺血再灌注誘導(dǎo)細(xì)胞上清液中促炎因子TNF-α和IL-6水平，與由淑萍等[13]研究相類似。以上研究表明，肉蓯蓉總苷通過提高細(xì)胞活力，減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)進而對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷具有保護作用。

lncRNAGAS5在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、心肌缺血再灌注損傷、腦卒中等病理生理過程中具有調(diào)節(jié)作用[14-15]。Wu等[16]研究顯示，lncRNAGAS5過表達促進缺氧復(fù)氧暴露的心肌細(xì)胞凋亡，下調(diào)其表達可改善心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷。Zhang等[17]研究表明，lncRNAGAS5能夠增強神經(jīng)元糖酵解反應(yīng)，加劇缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，抑制lncRNAGAS5可防止腦缺血再灌注損傷，改善整體神經(jīng)功能。此外，Zhao等[18]指出抑制lncRNAGAS5表達對新生兒缺氧/缺血性腦損傷具有潛在治療作用。本研究顯示，肉蓯蓉總苷干預(yù)后缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞中l(wèi)ncRNAGAS5表達降低。進一步研究顯示，抑制lncRNAGAS5表達可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡，降低炎癥反應(yīng)，與肉蓯蓉總苷保護作用一致。而過表達lncRNAGAS5則逆轉(zhuǎn)肉蓯蓉總苷對缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞活力、凋亡、炎癥反應(yīng)以及pro-caspase-3和cleaved-caspase3蛋白的影響，證實肉蓯蓉總苷通過下調(diào)lncRNAGAS5進而對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注發(fā)揮保護作用。

綜上所述，本研究證實肉蓯蓉總苷通過下調(diào)lncRNAGAS5表達促進細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進而對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用，這豐富了肉蓯蓉總苷在神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷中的調(diào)控機制，為缺血性腦損傷治療提供了新的方向。