趙曼云， 郭蔚虹， 張 霞

(?？谑?20急救中心急救科，海南 ?？?570208)

脊髓損傷是臨床上常見的高致殘率中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，當(dāng)脊髓被直接或間接暴力損傷后會出現(xiàn)組織水腫、血管-脊髓屏障損傷和神經(jīng)元壞死等現(xiàn)象，使神經(jīng)再生被抑制，進而使神經(jīng)系統(tǒng)功能受到破壞[1]。脊髓損傷后的再生修復(fù)是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一，中和或阻斷髓鞘組織中的抑制成分或相關(guān)信號通路是目前治療脊髓損傷及促進其修復(fù)的主要策略[2-3]。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是細胞內(nèi)重要的信使，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細胞分化和增殖過程中起著重要作用，可以通過激活蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)促進神經(jīng)再生，且cAMP/PKA信號通路被證明是神經(jīng)再生、神經(jīng)重塑的重要調(diào)節(jié)因子[4-6]。益母草堿是唇形科植物益母草的主要有效成分之一，具有保護心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、生殖系統(tǒng)的作用及抗糖尿病等藥理用途[7]，并對cAMP/PKA信號通路介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙具有預(yù)防和治療作用[8]，可能通過調(diào)節(jié)cAMP/PKA信號通路對脊髓損傷后的神經(jīng)細胞凋亡有一定的抑制作用。因此，本研究探討益母草堿對脊髓損傷后神經(jīng)功能的保護作用及可能機制，為相關(guān)防治提供新思路和依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 75只SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(220±20)g，由海南省疾病預(yù)防控制中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK(瓊)2020-0012，常規(guī)飼養(yǎng)于安靜通風(fēng)環(huán)境下，室內(nèi)溫度20～24 ℃, 相對濕度50%～65%，循環(huán)照明12 h/12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 試劑與藥物 益母草堿(純度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號190225)。PKA通路抑制劑H-89(美國MedChemExpress公司，批號633210)；caspase-3、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)ELISA檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、蛋白激酶A(PKAc)、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、磷酸化的CREB[p-CREB (Ser133)]、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TUNEL凋亡試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器 電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；RT-qPCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥 75只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，益母草堿低、高劑量組，高劑量益母草堿+PKA抑制劑H-89組(益母草堿+H-89組)，每組15只。采用改良Allen’s打擊法建立脊髓損傷模型[9]，以T10為中心剃毛，消毒后作手術(shù)切口暴露T9-T11棘突，暴露T10對應(yīng)的脊髓，用20 g擊打棍從3 cm高度自由落體撞擊T10骨窗對應(yīng)的脊髓，當(dāng)大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動、雙下肢迅速回縮并揮動，受撞擊的脊髓組織水腫、出血，硬脊膜完整呈紫紅色的現(xiàn)象時，認(rèn)為模型制備成功；假手術(shù)組僅暴露T10對應(yīng)的脊髓，不進行打擊。造模成功后即開始腹腔注射給藥干預(yù)，益母草堿低、高劑量組分別注射4、16 mg/kg益母草堿，益母草堿+H-89組在注射16 mg/kg益母草堿的基礎(chǔ)上再注射5 mg/kg的H-89，假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 運動功能評價 分別于造模后第7、14、21、28天進行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分和斜板角度評估各組大鼠運動功能。BBB運動評分[10]方法為早期以無或極少的后肢關(guān)節(jié)運動為特征，中期出現(xiàn)幾次共濟失調(diào)步態(tài)，晚期表現(xiàn)為拖著腳趾和尾巴、軀干不穩(wěn)定以及爪子交替輪轉(zhuǎn)。將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分，記錄2次有效評分，取均值。斜板角度[11]檢測方法為，將大鼠頭朝左橫放在Rivlin斜板上，并從水平位置逐步增大傾斜角度，以大鼠在斜板上停留5 s不掉落為標(biāo)準(zhǔn)，測定斜板角度，獲取5次有效角度，取平均值。

2.3 HE染色觀察脊髓組織病理學(xué)變化 藥物干預(yù)28 d后，10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉大鼠后開胸，從左心室插管至主動脈，自心尖灌注生理鹽水和4%多聚甲醛固定2 h，取以脊髓損傷點為中心的上下各5 mm節(jié)段的脊髓組織，置于4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片(片厚4 μm)，按照試劑盒說明書進行HE染色，于光鏡下觀察脊髓組織結(jié)構(gòu)、炎癥細胞浸潤。

2.4 TUNEL染色檢測脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡情況 取“2.3”項下制備的切片，按照TUNEL染色試劑盒說明書進行透化、PBS漂洗、封閉、標(biāo)記、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片等步驟后，于顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。每張切片隨機取5個視野進行計數(shù)統(tǒng)計，凋亡率=[凋亡細胞核數(shù)(陽性細胞數(shù))/總細胞核數(shù)(總細胞數(shù))]×100%。

2.5 ELISA檢測脊髓組織中caspase-3和cAMP水平 取各組大鼠損傷的脊髓組織，加入裂解液冰浴超聲勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，吸取等量上清液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明說進行操作，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔光密度(OD450)值，以陰性對照孔調(diào)零，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的檢測結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組脊髓組織中caspase-3和cAMP水平。

2.6 RT-qPCR檢測脊髓組織中PKAc和BDNFmRNA表達 脊髓組織在冰上勻漿器中剪碎，加入TRIzol研磨混勻提取樣本總RNA，紫外分光光度計檢測各樣本總RNA濃度。取2 μg總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR擴增。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸31 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算各基因的mRNA相對表達量。PKAc正向引物序列5′-GCTGGCTTTGATTTACGG-3′，反向引物序列5′-GATGTTTCGCTTGAGGATA-3′；BDNF正向引物序列5′-CATCTTAGGAGTGGAAAGGGTG-3′，反向引物序列5′-TATGAAGCCACCTAATCGACCT-3′；β-actin正向引物序列5′-GATGACCCAGATCATGTTTGA-3′，反向引物序列5′-TTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。

2.7 Western blot檢測脊髓組織中PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF及凋亡相關(guān)蛋白表達 取脊髓組織剪碎勻漿，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量后使蛋白變性，取等量蛋白進行凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，4 ℃孵育稀釋后的一抗[cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF、β-actin，1∶1 000]過夜，次日清洗后加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，洗滌后，加入顯影液顯影成像。使用β-actin抗體進行內(nèi)參校正，采用Image J軟件對條帶灰度值進行分析，用目的蛋白與β-actin灰度值比表示目的蛋白的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 益母草堿對脊髓損傷大鼠運動功能的影響 如圖1所示，除假手術(shù)組外，給藥7 d時各組大鼠BBB評分和斜板角度無顯著性差異(P>0.05)。給藥14、21、28 d時，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BBB評分和斜板角度降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組BBB評分和斜板角度增加(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組BBB評分和斜板角度降低(P<0.01)。給藥時間越長，益母草堿高劑量組大鼠后肢功能恢復(fù)越好。

3.2 益母草堿對脊髓損傷大鼠脊髓組織病理損傷的影響 如圖2所示，假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整、致密整齊，細胞結(jié)構(gòu)完好，核大而圓且核仁清晰；模型組和益母草堿低劑量組脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，細胞核出現(xiàn)明顯固縮，伴有大量炎性細胞浸潤；益母草堿高劑量組和益母草堿+H-89組脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂情況有明顯改善，炎性細胞浸潤減少。

3.3 益母草堿對脊髓損傷大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡的影響 假手術(shù)組、模型組、益母草堿低劑量組、益母草堿高劑量組和益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織中caspase-3水平分別為(16.5±1.3)、(66.8±2.0)、(67.0±1.5)、(32.5±1.0)、(48.3±1.2)μg/L。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織中caspase-3水平升高(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織中caspase-3水平降低(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織中caspase-3水平升高(P<0.01)。如圖3～4所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達均升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達均降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達均升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)。

3.4 益母草堿對脊髓損傷大鼠脊髓組織中PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF表達及cAMP水平的影響 假手術(shù)組、模型組、益母草堿低劑量組、益母草堿高劑量組和益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織中cAMP水平分別為(33.2±1.8)、(11.1±0.8)、(11.9±1.2)、(24.2±1.3)、(23.7±0.9)μg/L。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織中cAMP水平降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織中cAMP水平升高(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組脊髓組織中cAMP水平降低(P<0.01)。如圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表達升高(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表達均降低(P<0.01)。

4 討論

前期研究顯示，提高神經(jīng)元內(nèi)cAMP/PKA水平或激活該通路信號分子可增強其內(nèi)在的再生能力，有效地促進脊髓再生[12-15]。益母草堿是從中藥益母草中提取的具有顯著生物活性的生物堿，在心腦血管病、糖尿病、腎病、生殖等方面有許多新用途[16-17]，但益母草堿對脊髓損傷后的神經(jīng)細胞是否具有保護作用，尚未有文獻報道。

本研究采用改良Allen’s打擊法建立脊髓損傷大鼠模型，并連續(xù)4周腹腔注射給予不同劑量益母草堿，以探究其對脊髓損傷的作用。研究結(jié)果顯示，模型大鼠的BBB評分和斜板實驗評分均降低，大鼠后肢運動功能受到影響，與前人研究一致[18]，說明模型復(fù)制成功。同時，HE病理染色結(jié)果顯示，模型大鼠脊髓組織出現(xiàn)明顯水腫，細胞核明顯固縮，伴有大量炎性細胞浸潤；給予高劑量益母草堿干預(yù)給藥后，大鼠脊髓組織水腫和炎性細胞浸潤程度明顯減輕，后肢運動功能得到明顯改善，表明益母草堿對脊髓損傷大鼠有明顯的保護作用。

脊髓損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能永久或長期喪失與脊髓組織的水腫、變性、壞死，以及神經(jīng)細胞的凋亡是緊密相關(guān)[10]。caspase家族蛋白介導(dǎo)細胞凋亡，下調(diào)caspase-3在大鼠脊髓損傷神經(jīng)元中表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，對損傷后神經(jīng)組織再生和修復(fù)有積極的治療作用[19]。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠脊髓組織凋亡細胞增多，caspase-3蛋白表達升高；給予高劑量益母草堿干預(yù)能抑制模型大鼠神經(jīng)細胞凋亡，說明它能通過調(diào)節(jié)脊髓損傷大鼠脊髓組織中凋亡因子的表達抑制細胞凋亡，減輕脊髓損傷程度。

BDNF是一種具有促進神經(jīng)生長活性的蛋白質(zhì)，在維持神經(jīng)元功能、防止神經(jīng)元退行性變以及神經(jīng)元損傷后再修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用。CREB磷酸化后形成的p-CREB可作為調(diào)控因子誘導(dǎo)BDNF基因的表達，而PKAc蛋白可通過促進CREB蛋白磷酸化(Ser133)激活，促進靶基因BDNF的轉(zhuǎn)錄，進而促進神經(jīng)細胞存活[20]。本研究結(jié)果顯示，脊髓損傷大鼠脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)和BDNF的mRNA及蛋白表達均降低，說明脊髓損傷后cAMP/PKA信號通路被抑制；高劑量益母草堿干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)脊髓損傷對cAMP/PKA信號通路的抑制程度，表明它可能是通過激活cAMP/PKA信號通路來抑制神經(jīng)細胞凋亡、減輕脊髓組織損傷，從而改善大鼠后肢運動功能，促進脊髓損傷的修復(fù)。

綜上所述，益母草堿能通過激活cAMP/PKA信號通路，減輕脊髓組織病理損傷，減少神經(jīng)細胞凋亡，促進脊髓損傷大鼠后肢運動功能的恢復(fù)。此研究首次探究了益母草堿對脊髓損傷的作用，可為其治療提供新的潛在藥物。