徐云霞， 徐珺萍， 卞景新

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種發(fā)病多因性、臨床表現(xiàn)多態(tài)性的內(nèi)分泌疾病，患病率為8%～13%[1]，占無排卵不孕癥的80%[2]，具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，其主要特征為高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變、排卵功能異常等，而且疾病呈進(jìn)行性發(fā)展，易致女性生育功能障礙[3]。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是動(dòng)物體內(nèi)基礎(chǔ)信號通路，通路中許多分子參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長、原始卵泡的發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖和分化等過程[4-6]。

中醫(yī)古籍中并無“PCOS”這一病名，根據(jù)其臨床特征將其歸屬于“不孕”“閉經(jīng)”“癥瘕”等范疇[7]，其發(fā)病多與腎、脾、肝關(guān)系密切，單證型以腎虛證為主[8]。孕育丹糖漿是國家名老中醫(yī)徐志華教授以“腎藏精，主生殖”的中醫(yī)理論基礎(chǔ)為指導(dǎo)，以“溫腎暖宮，調(diào)補(bǔ)沖任”為治則，結(jié)合多年理論研究與臨床實(shí)踐創(chuàng)制的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的特色醫(yī)院制劑，主治腎陽虛性不孕癥，臨床療效確切[9]。本實(shí)驗(yàn)基于PCOS大鼠模型，觀察孕育丹糖漿對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用，以期闡明其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 6周齡SPF級雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(皖)2017-001，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(22±2)℃，相對濕度 50%～70%，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(審批號2022003)。

1.2 試劑與藥物 孕育丹糖漿(皖藥制字Z20050059)由熟地黃、鹽沙苑子、覆盆子、枸杞子、鹽菟絲子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、鹽補(bǔ)骨脂、肉蓯蓉、鎖陽、燙狗脊、當(dāng)歸組成。枸櫞酸氯米芬(進(jìn)口藥品注冊證號H20140688)購自塞浦路斯高特制藥有限公司；來曲唑(國藥準(zhǔn)字H19991001)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。羧甲基纖維素溶液(carboxylmethtl cellulose,CMC,1%，批號130225)購自伊勢久(江蘇連云港)生物科技有限責(zé)任公司；促卵泡素(FSH)定量檢測試劑盒(貨號RX302805R)、黃體生成素(LH)定量檢測試劑盒(貨號RX303076R)、雌二醇(E2)定量檢測試劑盒(貨號RXJ302812R)、睪酮(T)定量檢測試劑盒(貨號RXJ302700R)均購自泉州市睿信生物科技有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體(貨號ZA-09)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號ZB-2305)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號ZB-2301)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗Akt多克隆抗體(貨號AF6261)、兔抗p-Akt多克隆抗體(貨號AF0016)、兔抗PI3K p85 alpha多克隆抗體(貨號AF6241)、兔抗VEGF多克隆大鼠抗體(貨號AF5131)均購自美國Affinity Biosciences公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(貨號RR047A)購自日本TaKaRa公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)試劑盒(貨號G3322)購自武漢賽維爾生物科技有限公司公司。

1.3 儀器 RT-6100酶標(biāo)分析儀、RT-3100全自動(dòng)洗板機(jī)均購自美國Rayto公司；EPS300電泳儀、VE-180電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)膜儀均購自上海天能科技有限公司；JW-3021HR高速冷凍離心機(jī)購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；Master-S30 UF純水機(jī)購自上海和泰儀器有限公司；JS-M6P自動(dòng)曝光儀購自上海培清科技有限公司；PTC-200普通PCR儀購自美國Bio-Rad公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司；OD1000+超微量分光光度計(jì)購自南京五義科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 隨機(jī)選取10只大鼠為正常組，其余50只大鼠建立PCOS模型。參照文獻(xiàn)[10]報(bào)道，正常組大鼠灌胃1% CMC，造模大鼠灌胃來曲唑1 mg/kg(溶于1% CMC)，每天1次，連續(xù)21 d，最后5天進(jìn)行陰道涂片，灌胃第21天禁食后眼眶后靜脈采血。

2.2 模型驗(yàn)證 造模最后5 d，每天早上在7：00至8：00收集大鼠陰道分泌物制作陰道涂片，瑞氏染色后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量比例。圖1～2顯示，造模大鼠陰道涂片無周期性改變，基本維持在動(dòng)情間期，顯微鏡下陰道涂片可見大量點(diǎn)狀白細(xì)胞及少許片狀角質(zhì)化細(xì)胞；血清T水平較正常組升高(P<0.01)，表明造模成功。

2.3 給藥方法 造模成功后，造模大鼠隨機(jī)分為模型組、枸櫞酸氯米芬組(0.45 mg/100 g)及孕育丹糖漿低、中、高劑量組(1.0、2.0、4.0 mL/100 g)，每組10只，而正常組、模型組大鼠灌胃給予生理鹽水1 mL/100 g，各給藥組大鼠灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，連續(xù)12 d，給藥最后5 d內(nèi)每天進(jìn)行陰道涂片。給藥結(jié)束后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清性激素水平 取材前1 d20：00禁食，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，取腹主動(dòng)脈血5 mL，4 000 r/min離心20 min，取上層血清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平，酶聯(lián)免疫競爭法檢測血清雌二醇(E2)、睪酮(T)水平。

2.5 HE染色觀察大鼠卵巢組織病理學(xué)改變 取血后處死大鼠，摘取卵巢組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，制作切片，常規(guī)HE染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察卵泡的形態(tài)改變并拍照。

2.6 RT-qPCR法檢測大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、VEGFmRNA表達(dá) 提取大鼠卵巢組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后得到cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測PI3K、Akt、VEGFmRNA表達(dá)，2-△△CT法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法檢測大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 取大鼠卵巢組織適量，加入NP-40細(xì)胞裂解液(含PMSF)裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清，即得總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、孵育一抗二抗、顯影后，采用Image J軟件測定各蛋白質(zhì)條帶的吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的吸光度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.8 免疫熒光組織化學(xué)染色檢測卵巢組織中PI3K、Akt、p-Akt 蛋白的表達(dá)和定位 取“2.5”項(xiàng)下大鼠卵巢組織切片適量，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 封閉，滴加兔抗VEGF多克隆抗體(1∶100)，在4 ℃下孵育過夜，次日洗滌后滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶400)，室溫避光孵育50 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，漂洗后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，以平均熒光強(qiáng)度為指標(biāo)進(jìn)行半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 陰道涂片檢查 給藥后，正常組大鼠動(dòng)情周期基本規(guī)律；模型組大鼠動(dòng)情周期紊亂，基本維持在動(dòng)情間期，顯微鏡下陰道涂片可見大量點(diǎn)狀白細(xì)胞及少許片狀角質(zhì)化細(xì)胞；孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠動(dòng)情周期大部分恢復(fù)規(guī)律，并呈周期性變化，動(dòng)情前期可見有核上皮細(xì)胞及少量角化細(xì)胞；動(dòng)情期可見大量外形不規(guī)則的角化上皮細(xì)胞，有少量有核上皮細(xì)胞；動(dòng)情后期可見不規(guī)則角化上皮細(xì)胞，有核上皮細(xì)和白細(xì)胞均可見,且比例相當(dāng)。見圖3。

3.2 孕育丹糖漿對PCOS大鼠血清性激素水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清FSH、LH、T水平升高(P<0.01)，E2水平降低(P<0.01)。與模型組比較，孕育丹糖漿低劑量組FSH、LH、T水平有降低趨勢，E2水平有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；孕育丹糖漿中劑量組FSH、LH、T水平降低(P<0.05，P<0.01)，E2水平升高(P<0.05)；孕育丹糖漿高劑量組及枸櫞酸氯米芬組FSH、LH、T水平降低(P<0.01)，E2水平升高(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平

3.3 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織病理變化的影響 正常組大鼠卵巢組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,可見不同發(fā)育階段的卵泡、多個(gè)黃體；模型組大鼠卵巢組織可見大小不等的囊腔，卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)較正常組明顯減少，各級卵泡與黃體稀少；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組大鼠卵巢組織病理變化得到改善，可見各級卵泡及黃體，顆粒細(xì)胞層厚度增加且排列整齊，其中高劑量組卵巢改善最明顯；枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織內(nèi)可見成熟卵泡，體積較大，卵泡液較多，顆粒細(xì)胞層厚度增加但排列較紊亂。見圖4。

3.4 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織PI3K、Akt、VEGFmRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織PI3K、AktmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，VEGFmRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織PI3K、AktmRNA表達(dá)升高(P<0.01)，VEGFmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，見圖5。

3.5 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt、VEGF蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，VEGF蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，VEGF蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見圖6。

3.6 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響 正常組大鼠卵巢細(xì)胞中VEGF表達(dá)較少；與正常組比較，模型組大鼠卵巢細(xì)胞中VEGF表達(dá)增加，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組、枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢細(xì)胞中VEGF表達(dá)有不同程度的降低，綠色熒光減弱，以枸櫞酸氯米芬組最明顯，見圖7。

4 討論

PCOS以生殖障礙、內(nèi)分泌異常、代謝紊亂和精神問題為特征,其發(fā)病機(jī)制尚未闡明[11]。近年來多項(xiàng)研究表明PCOS與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)，該通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的重要信號通路[12-13]，其與卵巢功能密切相關(guān)，尤其影響顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡、卵母細(xì)胞的成熟[14]。顆粒細(xì)胞主要為卵母細(xì)胞的生長發(fā)育提供營養(yǎng)，是卵泡成熟的物質(zhì)支持細(xì)胞[15]。PCOS患者的卵巢病理改變常為顆粒細(xì)胞層萎縮變薄，增殖低下[16]。趙帥等[17]認(rèn)為激活PI3K/Akt信號通路以增強(qiáng)顆粒細(xì)胞的增殖能力，降低其凋亡率，有助于改善PCOS排卵障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠卵巢中PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵蛋白及基因的表達(dá)較正常大鼠降低，且顆粒細(xì)胞層菲薄、紊亂；給予孕育丹糖漿治療后，PI3K/Akt通路相關(guān)因子表達(dá)升高，顆粒細(xì)胞層病理損傷明顯修復(fù)，說明激活PI3K/Akt信號通路可以上調(diào)顆粒細(xì)胞的增殖能力，明顯改善卵巢病理改變。與孕育丹糖漿比較，氯米芬的作用效果更佳，但氯米芬存在自身局限性，首先，其本質(zhì)是抗雌激素藥物[18]，易致宮頸黏液變稠，子宮內(nèi)膜容受性差，不利于受精及著床；其次，大約15%～40%女性對氯米芬不敏感，出現(xiàn)氯米芬抵抗[19]。前期研究表明，臨床治療PCOS時(shí)聯(lián)合應(yīng)用孕育丹糖漿可提高排卵率、妊娠率[20]。

《周易》有云：“天地氤氳，萬物化醇，男女媾精，萬物化生”，說明受孕關(guān)鍵在于腎中精氣充盛。腎陰為卵泡發(fā)育成熟的物質(zhì)基礎(chǔ)，腎陽是鼓動(dòng)卵子排出的動(dòng)力來源?！半硽杵凇奔础敖?jīng)間排卵期”，為陰陽二氣相接之際，癸水充盛，腎陽充旺，由此可見，腎精充足，陽氣旺盛，重陰轉(zhuǎn)陽順利，乃可排出卵子。徐志華教授認(rèn)為PCOS主因臟腑功能失調(diào)，其中尤以腎虛為關(guān)鍵，治療時(shí)以溫補(bǔ)腎陽為主，輔以益陰。孕育丹糖漿由熟地黃、鹽沙苑子、覆盆子、枸杞子、鹽菟絲子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、鹽補(bǔ)骨脂、肉蓯蓉、鎖陽、燙狗脊、當(dāng)歸組成，共奏溫腎助陽、調(diào)補(bǔ)沖任之功。方中重用補(bǔ)腎溫陽之品，同時(shí)選用少量滋養(yǎng)腎陰的藥物，溫而不燥，陰陽俱顧。孕育丹糖漿通過補(bǔ)益腎中陰陽，使卵泡成熟化生有源，卵子排出得以鼓動(dòng)，其補(bǔ)陽之力尤甚，保證了氤氳期重陰轉(zhuǎn)陽的順利運(yùn)行。

綜上所述，孕育丹糖漿防治PCOS的機(jī)制可能是通過補(bǔ)益腎中陽氣以激活PI3K/Akt信號通路，改善卵巢功能，修復(fù)顆粒細(xì)胞層損傷，從而提高卵泡質(zhì)量，增加排卵率，最終達(dá)到提高妊娠率的目標(biāo)。