覃冬杰， 張 鵬， 鐘文俊， 覃華亮， 劉永逸*

(1.柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，廣西 柳州 545006；2.廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)集團(tuán)股份公司，廣西 柳州 545007)

陳香露白露片由陳皮、川木香等9種藥材組成，具有健胃和中、理氣止痛的功效[1]，因處方中陳皮易發(fā)霉變質(zhì)，而且所有藥材均為生粉入藥，故根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，處方中含有易污染的藥材及生粉投料的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的檢測(cè)[2]。

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的有毒代謝物，對(duì)人體有致畸、致癌、致突變作用[3-6]，較為成熟的相關(guān)檢測(cè)方法有氣相色譜法[7]、液相色譜法[8]、液質(zhì)聯(lián)用法[9]。其中，液質(zhì)聯(lián)用法以其高靈敏度、高選擇性、多目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，成為了目前常用手段。在前處理方面，大多采用固相萃取柱[10-12]、分散固相萃取[13-15]凈化，其中QuEChERS法以其快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、有效、耐用、安全、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，正越來(lái)越多地應(yīng)用于真菌毒素的檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS-LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定陳香露白露片中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，以期為評(píng)價(jià)該制劑安全性提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-30AD超高效液相色譜儀(日本島津公司)；Triple Quad 4500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；SK8200HP超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；3-3OK臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma-Aldrich公司)；VIBRAX VXR振蕩器(德國(guó)IKA集團(tuán))；TTL-DCII型氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；XP26電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；24 UV超純水器(德國(guó)默克密理博公司)。

1.2 材料 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)照品，純度均大于95%，購(gòu)于青島普瑞邦生物工程有限公司。13C18-玉米赤霉烯酮(25 μg/mL)、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(25 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)于美國(guó)Romer Labs公司。陳香露白露片共20批，由廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)集團(tuán)股份公司提供，批號(hào)分別為20190402、20190705、20190922、20191001、20191106、20200102、20200301、20200502、20200522、20200630、20200701、20200715、20200724、20200817、20201101、20201103、20201105、20201106、20201109、20201114。流動(dòng)相所用甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；其余試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 Boltimate C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相[0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨](A)-[甲醇-乙腈(1∶1)](B)，梯度洗脫(0～2.0 min，95%A；2.0～2.1 min，95%～60%A；2.1～7.0 min，60%～45%A；7.0～10.0 min，45%～10%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電化學(xué)噴霧ESI離子源；正、負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集；離子源溫度550 ℃；氣簾壓力25 psi(1 psi=0.133 kPa)；霧化器壓力45 psi；輔助加熱器壓力55 psi。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 各真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為5 μg/mL的單標(biāo)貯備液；精密稱取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的單標(biāo)貯備液，置于-20 ℃冰箱中備用；精密量取13C18-玉米赤霉烯酮、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為40、4 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，置于-20 ℃的冰箱中備用，即得。

2.3 供試品溶液制備 取片劑50片，研細(xì)，精密稱取2 g，置于50 mL離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，待溶劑揮干后精密加入乙腈-10%甲酸(9∶1)20 mL，超聲處理10 min，加入4 g無(wú)水MgSO4、1 g NaCl，渦旋2 min，10 000 r/min離心5 min，精密量取上清液5 mL至10 mL離心管中，加入100 mg C18、300 mg無(wú)水MgSO4，渦旋2 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液至10 mL離心管中，40 ℃氮?dú)獯抵两?，加入初始流?dòng)相定容至1 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 基質(zhì)效應(yīng) 以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分別為67.3%、70.5%、81.4%、84.5%、88.6%、68.9%、126.1%、131.0%、58.6%、65.8%，大部分有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，故需采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

2.5 線性關(guān)系考察 取空白樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，制備空白基質(zhì)液，用以配制混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各真菌霉素峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，再分別以各組分3、10倍基線噪音時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限、定量限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各真菌毒素在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 各真菌毒素線性關(guān)系

2.6 方法學(xué)考察 取空白樣品，加入一定量對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備低、中、高水平供試品溶液(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮添加水平為1、5、10 μg/kg，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素添加水平為10、50、100 μg/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇添加水平為100、500、1 000 μg/kg)，每個(gè)水平平行6份。取中水平1份，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算精密度RSD；另取1份，于0、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算穩(wěn)定性RSD；另取6份，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算重復(fù)性RSD；3種水平各取6份，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，10種真菌毒素精密度RSD為0.7%～2.2%，穩(wěn)定性RSD為1.3%～3.3%，重復(fù)性RSD為0.9%～2.8%，平均加樣回收率為80.7%～109.6%，均符合相關(guān)要求。

2.7 樣品含量測(cè)定 以建立的方法對(duì)20批樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有2批檢出黃曲霉毒素B1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.6、0.7 μg/kg；有1批檢出赭曲霉毒素A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.3 μg/kg；其余真菌毒素均未檢出。

3 討論

3.1 前處理考察

3.1.1 提取條件 比較不同比例的乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)9∶1時(shí)回收率最高。進(jìn)一步比較了不同pH值對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著甲酸加入，伏馬毒素B1、B2的回收率顯著提高，當(dāng)以乙腈-10%甲酸(9∶1)為提取溶劑時(shí)，各真菌毒素回收率均大于80%。

3.1.2 凈化方式 比較了GCB、PSA、C18與無(wú)水MgSO4作為凈化材料對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入GCB時(shí)，玉米赤霉烯酮回收率明顯下降；當(dāng)加入PSA時(shí)，伏馬毒素B1、B2和赭曲霉毒素A回收率也明顯下降；僅用C18與無(wú)水MgSO4作為凈化材料時(shí)，有最好的凈化效果，回收率最高，最優(yōu)凈化材料為100 mg C18和300 mg無(wú)水MgSO4。

3.2 色譜條件考察 比較了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在甲醇-乙腈(1∶1)系統(tǒng)下各組分有較適宜的出峰時(shí)間，可在較短時(shí)間內(nèi)完成分析測(cè)定。水相加入甲酸時(shí)，正離子模式組分的響應(yīng)值明顯提高，但其體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，負(fù)離子模式組分的響應(yīng)值會(huì)降低；當(dāng)加入甲酸銨時(shí)，情況則相反。由于本實(shí)驗(yàn)是正負(fù)離子同時(shí)采集，為兼顧所有組分，最終以0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨作為水相，此時(shí)各真菌毒素響應(yīng)值最高。

3.3 質(zhì)譜條件考察 分別取各真菌毒素單標(biāo)液，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子掃描，選取各自響應(yīng)值最高的模式進(jìn)行采集。二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)，選取響應(yīng)值高而穩(wěn)定的2個(gè)子離子分別作為定性、定量離子，通過(guò)儀器自動(dòng)優(yōu)化最佳的去簇電壓和碰撞能量，使響應(yīng)值最高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確靈敏，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，各項(xiàng)指標(biāo)均滿足分析要求，可作為陳香露白露片中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇10種真菌毒素含量的快速測(cè)定方法。