許錦濤， 鄭家勤， 王晗毓， 吳辰君， 王 浚， 董自波,2*

(1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.海洋藥用資源開發(fā)工程研究中心，江蘇 連云港 222005)

自上世紀(jì)中后期以來，微乳技術(shù)得到了迅速發(fā)展，尤其是在中藥制劑研究領(lǐng)域，國內(nèi)研究主要集中在中藥單味藥或復(fù)方制劑[1]，它是由油相、水相、乳化劑和助乳化劑按一定比例混合而成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定體系[2]，一般分為W/O型、O/W型、復(fù)合型，粒徑在10～100 nm之間[3]。陳皮為蕓香科植物橘CiteusreticulateBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效，臨床上用于治療脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等[4]，其中陳皮油具有平喘、化痰、行氣之功效[5]，主要成分為D-檸檬烯[6]，但因其難溶于水，性質(zhì)不穩(wěn)定，從而限制了應(yīng)用[7]。微乳具有流動(dòng)性較強(qiáng)、黏度較小、粒徑較小等特點(diǎn)，故陳皮油制成該劑型后能提高生物利用度，增強(qiáng)穩(wěn)定性，并便于儲(chǔ)存[8]。本實(shí)驗(yàn)通過偽三元相圖[9]得到陳皮油微乳處方，再利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法[10]優(yōu)化處方，再對(duì)其外觀、粒徑、多分散指數(shù)[11](PDI)等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為進(jìn)一步相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 KDM型調(diào)溫電熱套(蘇州學(xué)森儀器設(shè)備有限公司)；JJ224BC型電子分析天平(上海賽多利斯貿(mào)易有限公司)；ZNCL-GS智能磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Nano ZS激光粒度儀(英國Malvern公司)；小型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2 試劑與藥物 陳皮油(自制)；吐溫80(Tween-80)、蓖麻油聚氧乙烯醚35(EL-35)、PEG400(上海麥克林生化科技有限公司)；聚氧乙烯氫化蓖麻油(CO-40)(上海源葉生物科技有限公司)；甘油、無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 藥材 陳皮購自安徽省亳州市藥材總公司中西藥公司，經(jīng)江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院秦昆明研究員鑒定為蕓香科植物橘CiteusreticulateBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 水蒸氣蒸餾提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 料液比 稱取50 g陳皮，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水浸泡過夜，發(fā)現(xiàn)吸收較完全，再分別以料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14提取4 h，結(jié)果見表1，選擇1∶8、1∶10、1∶12進(jìn)行后續(xù)考察。根據(jù)2020年版《中國藥典》方法測(cè)定陳皮油提取率，公式為提取率=(陳皮油質(zhì)量/陳皮質(zhì)量)×100%。

2.1.1.2 浸泡時(shí)間 固定料液比1∶10，提取時(shí)間6 h，分別浸泡0.5、1、1.5、2、2.5 h，結(jié)果見表1，選擇1、1.5、2 h進(jìn)行后續(xù)考察。

2.1.1.3 提取時(shí)間 固定料液比1∶10，浸泡時(shí)間1 h，連續(xù)提取7 h，結(jié)果見表1，可知隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)陳皮油提取率先快速增加后趨緩，故選擇4、5、6 h進(jìn)行后續(xù)考察。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)[12]，因素水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。由此可知，各因素影響程度依次為提取時(shí)間(C)>料液比(A)>浸泡時(shí)間(B)，最優(yōu)工藝為A2B1C3，即料液比1∶10，浸泡時(shí)間1 h，提取時(shí)間6 h。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析

2.2 偽三元相圖

2.2.1 乳化劑、助乳化劑用量篩選 分別選擇EL-35、CO-40、Tween-80作為乳化劑，PEG400、甘油、無水乙醇作為助乳化劑。先固定Km值(乳化劑用量與助乳化劑用量的比值)為1，向50 mL干凈干燥燒杯中分別按油相與混合乳化劑比例10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10依次加入乳化劑、助乳化劑、陳皮油，在500 r/min、(37±2)℃條件下進(jìn)行磁力攪拌，待初乳液混勻后緩慢滴加純化水，使溶液由澄清變渾濁再變澄清，或由渾濁變澄清，當(dāng)澄清至不再變化時(shí)記錄臨界點(diǎn)加水量[13]，通過馬爾文激光粒度儀進(jìn)行測(cè)定，以確定粒徑是否符合要求。再將油相、水相、混合乳化劑分別作為3個(gè)頂點(diǎn)繪制偽三元相圖，見圖1。

2.2.2Km值確定 由圖1可知，以EL-35為乳化劑，甘油為助乳化劑，在Km值為1時(shí)微乳區(qū)域最大。Km值分別取1/3、1/2、2/3、1、3/2、2、3，油相與Ts比例分別取10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10，依次加入燒杯后在500 r/min、(37±2)℃條件下制備微乳，通過繪制偽三元相圖比較微乳區(qū)域大小，見圖2。由此可知，以EL-35為乳化劑，甘油為助乳化劑，Km值為1/2時(shí)，微乳面積最大。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法 由“2.2”項(xiàng)下結(jié)果可知，隨著含油量、Km值變化，微乳區(qū)域大小也有所改變，其中Km<1/2或>2時(shí)無法形成微乳或存在大量的凝膠區(qū)而影響其形成，同時(shí)含油量>70%時(shí)也較難形成微乳。因此，在文獻(xiàn)[14]報(bào)道與單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)確定了以含油量、Km值為影響因素，粒徑、PDI為評(píng)價(jià)指標(biāo)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化處方，因素水平見表5，結(jié)果見表6。由此確定，含油量為10%～60%，Km值為0.5～2。

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法因素水平

表6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果

按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備微乳，通過Design-Expert8.0軟件進(jìn)行方差分析，見表7～8。由此可知，模型具有高度顯著性(P<0.01)，失擬項(xiàng)P>0.05，AB、A2、B2對(duì)粒徑和PDI的影響較顯著(P<0.05)。

表7 粒徑方差分析

表8 PDI方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化處方進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表9，可知粒徑、PDI平均值分別為14.70 nm、0.070，與理論值14.63 nm、0.067接近(相對(duì)偏差分別為0.5%、4.3%)，表明工藝穩(wěn)定可靠。

3 微乳理化性質(zhì)檢查

3.1 外觀性狀 微乳澄清透明，呈略顯微弱的淡藍(lán)色，再分別滴加亞甲藍(lán)溶液、蘇丹Ⅲ溶液，發(fā)現(xiàn)前者較快擴(kuò)散到微乳體系中，而后者一直停留在表面，表明它為O/W型，見圖4。

3.2 形態(tài) 將微乳滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置20 min后濾紙片吸干，再滴加2%磷鎢酸溶液，置于銅網(wǎng)上負(fù)染10 min，待自然揮干后在透射電子顯微鏡下觀察，見圖5。

3.3 穩(wěn)定性 將微乳在5 000 r/min下離心30 min，發(fā)現(xiàn)離心前后未見分層，表明其穩(wěn)定性良好。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用最常用的水蒸氣蒸餾法提取陳皮油，最佳提取條件為料液比1∶10，浸泡時(shí)間1 h，提取時(shí)間6 h，因藥材未粉碎，故提取率略低于先前文獻(xiàn)[15]報(bào)道。微乳制備方法較簡(jiǎn)單，常用高壓均質(zhì)法[16]、加油滴定法和加水滴定法等，其中加水滴定法最常見，在處方合理的情況下均能形成，與各組分的加入順序無關(guān)，具有吸收快、靶向釋放、增加溶解度等特點(diǎn)[17]。判斷溶液是否為微乳的最有效直接辦法就是測(cè)定粒徑和PDI，在一定范圍內(nèi)，粒徑越小表示微乳體系越穩(wěn)定，PDI越小則表明微乳中顆粒分散越均勻，因此，在篩選陳皮油微乳處方時(shí)，以兩者和PDI為指標(biāo)能得到最佳處方組成。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法是一種采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合進(jìn)行二階實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，相比較均勻設(shè)計(jì)法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精密度高、預(yù)測(cè)性好等特點(diǎn)[18]。本研究采用加水滴定法制備陳皮油微乳，在偽三元相圖篩選最佳處方的基礎(chǔ)上，經(jīng)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)處方組成進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證試驗(yàn)表明其重復(fù)性良好，方法可行。綜上所述，本研究制備了澄清透明、分布均勻顯微弱淡藍(lán)色的陳皮油微乳，其粒徑較小，分散均勻，穩(wěn)定性更好，為進(jìn)一步擴(kuò)大陳皮油的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。