高騰美， 楊涵月， 常 娟， 常銀霞， 魏硯明， 劉必旺

(山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030619)

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，主要有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[1-2]，其中黃芩苷含量一般不低于9.0%，漢黃芩苷含量為2.0%～8.0%，黃芩素含量為0.10%～1.60%，漢黃芩素含量為0.01%～0.30%[3-4]。黃芩苷、漢黃芩苷分別為黃芩素、漢黃芩素的葡萄糖醛酸化合物，含有糖苷，脂溶性差，轉(zhuǎn)化為黃芩素等苷元在小腸中才能被直接吸收[5]。黃芩素等苷元具有更強(qiáng)的抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化等功能活性，生物利用度更高[6-9]。

將黃芩苷轉(zhuǎn)變?yōu)辄S芩素的方法包括酸堿水解法、酶解法和微生物發(fā)酵法[10]，其中微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)特異性強(qiáng)、條件溫和、副產(chǎn)物少、清潔環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[11]。黃酮、生物堿、萜類、皂苷、多酚等中藥成分均可采用生物轉(zhuǎn)化[12-15]。姚磊等[16]以牛肉膏為培養(yǎng)基，利用納豆菌微生物發(fā)酵黃芩，但培養(yǎng)過程繁瑣，成本高，時(shí)間長(zhǎng)；本實(shí)驗(yàn)采用納豆發(fā)酵黃芩，無須加入牛肉膏等其他培養(yǎng)基，可快速將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素等苷元，具有發(fā)酵速度快、轉(zhuǎn)化率高、成本低、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)。

1 材料

1.1 儀器 MC-101C納豆機(jī)(中山市名臣電器有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀，配置Waters 2998 PDA 檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；半微量型號(hào)New Classic MS電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；PH-070A干燥箱、HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)(金西盟北京儀器有限公司)；HL-200高速多功能粉碎機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芩(山西元和堂中藥有限公司，產(chǎn)地山西，批號(hào)200201)，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院藥用植物教研室樊杰副教授鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。納豆菌菌粉(青島凱麥森食品科技有限公司)。黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為P20A9F39333、C04D8Y49741、R31M9F62605、P11M9F61014)。甲醇、乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 納豆制備 選取小粒干黃豆約300 g，加水浸泡8 h后放入高壓鍋內(nèi)蒸90 min，冷卻至室溫，加入1 g納豆發(fā)酵菌粉，攪拌均勻，放入自動(dòng)納豆發(fā)酵機(jī)中發(fā)酵，溫度約37 ℃，發(fā)酵24 h后取出放入保鮮袋內(nèi)，室溫放置30 d以上(發(fā)酵時(shí)間過短，酶活性、黃芩苷轉(zhuǎn)化率低；發(fā)酵30 d以上，黃芩苷轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定)，即得。

2.2 發(fā)酵步驟 稱取藥材粉末適量，高壓滅菌后加入2倍量滅菌水、納豆(研磨成泥狀)，在一定溫度下發(fā)酵，一段時(shí)間后在60 ℃下恒溫干燥24 h以終止發(fā)酵。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材或發(fā)酵品0.3 g(扣除納豆質(zhì)量)，加70%乙醇40 mL，水浴加熱回流3 h，放冷，濾過，少量70%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，濾液置于100 mL量瓶中，70%乙醇定容，精密量取1 mL，甲醇定容至10 mL，即得。

2.4 色譜條件 Thermo BDSHYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%甲酸(C)，梯度洗脫(0～8 min，15%～34%A，5%～6%B；8～25 min，34%～55%A，6%～7.5%B；25～35 min，55%～66%A，7.5%～8%B；35～45 min，66%～80%A，8%～10%B)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn)和線性關(guān)系考察 取對(duì)照品、藥材、發(fā)酵品溶液適量，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1，可知各成分色譜峰達(dá)到基線分離。另精密稱取上述4種對(duì)照品適量，加適量甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.60、0.40、0.68、0.50 mg/mL的溶液，稀釋成5個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定5次，測(cè)得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.42%、0.54%、0.27%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批發(fā)酵品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD為0.58%～1.54%，表明該方法重復(fù)性好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批發(fā)酵品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.57%、0.59%、0.62%、0.63%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批發(fā)酵品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，稀釋成高、中、低質(zhì)量濃度，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素平均加樣回收率為98.15%～101.23%，RSD為0.58%～0.91%。

2.6 單因素試驗(yàn)

2.6.1 粒徑 精密稱取10、20、40、60目黃芩粉末各15 g，固定黃芩與納豆比例3∶1，發(fā)酵溫度37 ℃，按“2.2”項(xiàng)下方法發(fā)酵2 d。結(jié)果，黃芩苷轉(zhuǎn)化率分別為84.15%、92.45%、96.87%、96.32%，即粒徑為40目時(shí)最高。

2.6.2 黃芩與納豆比例 精密稱取40目黃芩粉末15 g，固定發(fā)酵溫度37 ℃，黃芩與納豆比例分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按“2.2”項(xiàng)下方法發(fā)酵2 d。結(jié)果，黃芩苷轉(zhuǎn)化率分別為93.61%、96.86%、95.27%、94.44%，即黃芩與納豆比例為3∶1時(shí)最高。

2.6.3 發(fā)酵溫度 精密稱取40目黃芩粉末15 g，固定黃芩與納豆比例3∶1，發(fā)酵溫度分別為33、35、37、39 ℃，按“2.2”項(xiàng)下方法發(fā)酵2 d。結(jié)果，黃芩苷轉(zhuǎn)化率分別為68.60%、76.06%、96.87%、85.24%，即發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)最高。

2.6.4 發(fā)酵時(shí)間 精密稱取40目黃芩粉末15 g，固定黃芩與納豆比例3∶1，發(fā)酵溫度37 ℃；按“2.2”項(xiàng)下方法分別發(fā)酵1、2、3、4 d。結(jié)果，黃芩苷轉(zhuǎn)化率分別為91.81%、96.85%、96.87%、96.88%，即發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)最高，但2 d后變化程度不明顯。

2.7 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇粒徑(A)、黃芩與納豆比例(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)、發(fā)酵溫度(D)作為影響因素，黃芩苷轉(zhuǎn)化率(Y)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)因素3個(gè)水平，見表2。

稱取黃芩27份，每組3份，每份15 g，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3，方差分析見表4。由表3可知，最優(yōu)工藝為A2B2C2D2，即粒徑40目，黃芩與納豆比例3∶1，發(fā)酵時(shí)間2 d，發(fā)酵溫度37 ℃，黃芩苷轉(zhuǎn)化率為96.87%。由表4可知，各因素影響程度依次為發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>粒徑>黃芩與納豆比例。

表2 因素水平

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

2.8 發(fā)酵前后成分含量比較 稱取黃芩15 g，共3份，按“2.7”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見表5～6，可知發(fā)酵后黃芩苷、漢黃芩苷含量明顯降低，黃芩素、漢黃芩素含量明顯升高。

表5 黃芩苷、黃芩素含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

表6 漢黃芩苷、漢黃芩素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

在相同發(fā)酵條件下，不同發(fā)酵時(shí)間的納豆對(duì)黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素有較大的影響。納豆發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，黃芩苷轉(zhuǎn)化越快，發(fā)酵30 d以上后發(fā)酵速度趨于穩(wěn)定。

發(fā)酵3 d時(shí)，納豆激酶的活性和含量最高。納豆在長(zhǎng)期發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生納豆纖溶酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、過氧化物歧化酶等[17-18]，說明納豆發(fā)酵黃芩轉(zhuǎn)化機(jī)理可能與增加的β-葡萄糖苷酶有關(guān)，還與納豆發(fā)酵產(chǎn)生的其它多種活性酶有關(guān)，納豆發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)產(chǎn)生酶的種類多是黃芩發(fā)酵速度變快的主要原因。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用納豆發(fā)酵黃芩，可縮短黃芩發(fā)酵時(shí)間，最優(yōu)發(fā)酵工藝為粒徑40目，黃芩與納豆比例3∶1，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間2 d，黃芩苷、漢黃芩苷分別轉(zhuǎn)化成其苷元黃芩素、漢黃芩素，轉(zhuǎn)化率分別為96.87%、86.38%。姚磊[16]等報(bào)道，優(yōu)化工藝為發(fā)酵時(shí)間7 d，黃芩苷平均轉(zhuǎn)化率為96.50%；本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間短，黃芩苷轉(zhuǎn)化率相當(dāng)，不需加入牛肉膏等培養(yǎng)基，成本低，并且納豆可提供發(fā)酵所需的碳源和氮源。