張 營(yíng)， 干國(guó)平,2*， 楊桂平， 楊德森,2 ， 余 亮， 陳 倩

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430065；3.孝感市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 孝感 432000)

慢性淺表性胃炎屬于慢性胃炎的范疇，是指胃黏膜在各種致病因素作用下所發(fā)生的非萎縮性慢性炎癥性病變，約90%胃炎患者屬于該類型[1-3]，患者常表現(xiàn)為反復(fù)或持續(xù)性上腹不適、飽脹、反酸、噯氣等，本病是慢性胃炎發(fā)展的最初階段，如繼續(xù)加重，有發(fā)展為慢性萎縮性胃炎甚至癌變的可能[4-5]。目前認(rèn)為，慢性淺表性胃炎的發(fā)病多與幽門螺桿菌感染、十二指腸液反流、免疫等因素相關(guān)[6-7]，西醫(yī)治療手段包括根除幽門螺桿菌、抑酸、保護(hù)胃黏膜等，雖有一定療效，但存在容易復(fù)發(fā)、過(guò)敏等問(wèn)題。

大量研究表明，中醫(yī)藥在治療慢性胃炎方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。慢性淺表性胃炎屬中醫(yī)“胃痛”“痞滿”范疇，其病變部位均在胃[8]，胃黏膜受損，胃失和降而致痞滿、升降失常、氣機(jī)不暢而表現(xiàn)為脹滿不適、胃痛，應(yīng)從脾胃論治。金砂行氣膠囊是孝感市中醫(yī)醫(yī)院研制的純中藥制劑，主要作用于慢性淺表性胃炎、反流性胃炎、十二指腸球炎等，具有和胃降逆、理氣止痛、消積導(dǎo)滯等功效。為了探究金砂行氣膠囊治療慢性淺表性胃炎的藥理作用及其機(jī)制，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)揭示該制劑作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供新的思路及方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，雌雄各半，購(gòu)于湖北省三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2017-0012。

1.2 試劑與藥物 金砂行氣膠囊(組方藥材柴胡、郁金、青皮、香附、黃連、法半夏、雞內(nèi)金、砂仁、焦山楂、降香、萊菔子)由孝感市中醫(yī)醫(yī)院提供。氣滯胃痛顆粒(批號(hào)20191226)，購(gòu)自遼寧華潤(rùn)本溪三藥有限公司；阿莫西林膠囊(批號(hào)200644)，購(gòu)自海南通用三洋藥業(yè)有限公司；克拉霉素膠囊(批號(hào)2001008)，購(gòu)自江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司；奧美拉唑腸溶膠囊(批號(hào)JA2004001)，購(gòu)自浙江金華康恩貝生物制藥有限公司；膠體果膠鉍劑膠囊(批號(hào)20191103)，購(gòu)自山西振東安特生物制藥有限公司。羧甲基纖維素鈉(批號(hào)20120330)、氨水(批號(hào)20200529)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4%多聚甲醛(批號(hào)HT202201)，購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。PierceTM Rapid Gold BCA 蛋白測(cè)試盒、TNF-α試劑盒、 IL-6 ELISA 試劑盒(貨號(hào)E-BC-K318-M、E-EL-R2856c、E-EL-R27842c)，購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；5×蛋白上樣緩沖液，購(gòu)自四維加生物科技(武漢)有限公司；Tris緩沖液，購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司。

1.3 儀器 RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；IX70光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 模型建立 60只大鼠隨機(jī)分為正常組8只、造模組52只，造模組大鼠每天自由飲用0.05%氨水，同時(shí)配合饑飽失常復(fù)制慢性淺表性胃炎模型。造模80 d后，隨機(jī)抽取2組大鼠進(jìn)行胃組織病理學(xué)檢測(cè)，根據(jù)慢性淺表性胃炎胃組織的病理改變判定模型是否建立成功[9-10]。

2.2 分組及給藥 稱取膠囊內(nèi)容物適量，溶于1% CMC-Na中，超聲溶解30 min，即得藥液。將大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，金砂行氣膠囊低、中、高劑量組(187.5、375、750 mg/kg)，氣滯胃痛顆粒組(782 mg/kg)，四聯(lián)療法組(阿莫西林、克拉霉素、奧美拉唑腸、膠體果膠鉍聯(lián)合用藥，劑量分別為20.82、5.21、0.42、2.08 mg/kg)，每組8只，給藥組大鼠每天灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積1% CMC-Na混懸液，連續(xù)給藥30 d。

2.3 取材 取材前夜大鼠禁食不禁水，當(dāng)天(給藥第30天)稱定體質(zhì)量后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.1 mL/kg)麻醉，采用一次性采血針腹主動(dòng)脈采血于真空采血管中，血樣室溫靜置60 min后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存。大鼠取血后處死，迅速取胃組織，沿胃大彎側(cè)切開，生理鹽水沖洗后濾紙吸干，切取部分胃組織，置于4%多聚甲醛中固定，其余放入消毒處理過(guò)的凍存管中，立即置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 HE染色觀察大鼠胃組織病理變化 將已固定的大鼠胃組織采用石蠟包埋法制片，HE染色后在高倍顯微鏡下觀察，拍照記錄病理切片的形態(tài)變化。

2.5 ELISA法檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6水平 酶標(biāo)儀讀取光密度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-6水平。

2.6 Western blot法檢測(cè)大鼠胃組織中p-IκBα、p-Akt1蛋白表達(dá) 取大鼠胃組織適量，加入組織蛋白提取試劑，在冰浴中勻漿裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清，即得總蛋白樣本。蛋白樣本加入5×蛋白上樣緩沖溶液，100 ℃水浴煮沸10 min進(jìn)行變性處理，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗置于搖床上，在4 ℃下孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜，加入二抗置于搖床上，在4 ℃下孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。采用Odyssey成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜，通過(guò)Odyssey v2.0軟件進(jìn)行分析。

2.7 金砂行氣膠囊成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 應(yīng)用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，得到金砂行氣膠囊的活性成分，并檢索其活性成分的作用靶點(diǎn)，Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢索到的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行基因名校正。以“chronic superficial gastritis”為關(guān)鍵詞，在OMIM(https://www.omim.org/)和Genecards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與慢性淺表性胃炎相關(guān)的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)。于Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)上分別錄入金砂行氣膠囊和慢性淺表性胃炎的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，得到兩者交集，作為潛在作用靶點(diǎn)，最后上傳至在線STRING軟件，設(shè)置參數(shù)為>0.9，最后輸出PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，獲取蛋白互作信息。

2.8 金砂行氣膠囊成分靶點(diǎn)交互作用和機(jī)制研究 采用Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建金砂行氣膠囊“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互作用網(wǎng)絡(luò)圖，“Network Analysis”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯罁?jù)度值篩選分析關(guān)鍵化合物。通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析，預(yù)測(cè)金砂行氣膠囊作用于慢性淺表性胃炎的分子作用機(jī)制。

3 結(jié)果

3.1 藥理作用研究

3.1.1 模型評(píng)價(jià) 在第30～80天，造模組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，同一時(shí)間點(diǎn)低于正常組(P<0.05,P<0.01)，見表1。正常組大鼠胃組織黏膜腺管排列整齊，大小形狀一致，腺體排列緊密整齊；造模組大鼠在80 d時(shí)，胃黏膜層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，程度以中重度為主，胃腺管紊亂或疏密不均，黏膜層呈充血性水腫等炎性損傷表現(xiàn)，見圖1。依照我國(guó)慢性胃炎病理診斷標(biāo)準(zhǔn)(2006，上海)和悉尼直觀模擬評(píng)分法，評(píng)定模型建立成功。

表1 造模期間大鼠體質(zhì)量變化

3.1.2 金砂行氣膠囊對(duì)慢性淺表性胃炎大鼠體質(zhì)量的影響 如表2所示，與模型組比較，給藥15 d后，金砂行氣膠囊低、中劑量組大鼠體質(zhì)量有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，金砂行氣膠囊高劑量組、四聯(lián)療法組大鼠體質(zhì)量均增加(P<0.05)；給藥30 d后，金砂行氣膠囊中、高劑量組大鼠體質(zhì)量有較大幅度增長(zhǎng)，但差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.1.3 金砂行氣膠囊對(duì)慢性淺表性胃炎大鼠胃組織病理學(xué)變化的影響 如圖2所示，正常組大鼠胃黏膜腺管排列整齊，大小形狀一致，腺體排列緊密整齊，壁細(xì)胞、主細(xì)胞界限清楚，固有層內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層無(wú)或稍輕微水腫；模型組大鼠胃腺管紊亂或疏密不均，黏膜層呈充血性水腫，可見上皮細(xì)胞壞死脫落，黏膜下層水腫，程度以中、輕度為主；金砂行氣膠囊給藥30 d后，大鼠胃黏膜固有層炎性細(xì)胞數(shù)目減少，胃腺排列稍整齊平整且腺管構(gòu)造逐漸規(guī)則，接近正常組。由此表明，金砂行氣膠囊對(duì)慢性淺表性胃炎的胃組織病理改變有顯著抑制作用。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化

3.1.4 金砂行氣膠囊對(duì)慢性淺表性胃炎大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.01)；與模型組比較，四聯(lián)療法組和金砂行氣膠囊各劑量組大鼠血清TNF-α水平均降低(P<0.05，P<0.01)，氣滯胃痛顆粒組、四聯(lián)療法組和金砂行氣膠囊高、中劑量組大鼠血清IL-6水平均降低(P<0.05，P<0.01)。

3.1.5 金砂行氣膠囊對(duì)慢性淺表性胃炎大鼠胃組織p-IκBα、p-Akt1蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組大鼠胃組織p-IκBα、p-Akt1蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，氣滯胃痛顆粒組和金砂行氣膠囊中、高劑量組大鼠胃組織p-IκBα蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，氣滯胃痛顆粒組、四聯(lián)療法組和金砂行氣膠囊中、高劑量組大鼠胃組織p-Akt1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.2.1 成分和靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別檢索砂仁、半夏、黃連、柴胡、降香等11味中藥，刪除無(wú)作用靶點(diǎn)和重復(fù)的化合物，共有123個(gè)，對(duì)應(yīng)2 071個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到457個(gè)。以“慢性淺表性胃炎”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，在OMIM和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相關(guān)靶點(diǎn)，合并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到疾病靶點(diǎn)730個(gè)。將上述2種靶點(diǎn)進(jìn)行交集，發(fā)現(xiàn)有126個(gè)靶點(diǎn)重合，見圖5。

3.2.2 核心靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將126個(gè)共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，繪制相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6，設(shè)置置信度為0.9并隱藏?cái)嚅_單獨(dú)靶點(diǎn)，PPI圖中有90個(gè)節(jié)點(diǎn)，447條邊，平均節(jié)點(diǎn)度9.93，PPI的富集顯著性P<1.0×10-16。節(jié)點(diǎn)代表藥物治療慢性淺表性胃炎的作用靶點(diǎn)，邊代表靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間有相互作用，表明這些靶點(diǎn)在某些方面是相互關(guān)聯(lián)，協(xié)同配合起到治療疾病的作用。導(dǎo)出含節(jié)點(diǎn)信息的TSV文件，在Cytoscape中分析節(jié)點(diǎn)信息，篩選出前20個(gè)核心調(diào)控基因靶點(diǎn)，見表3。

表3 金砂行氣膠囊關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的拓?fù)鋵W(xué)分析

3.2.3 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 采用Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖7，圖中紅色圓形代表金砂行氣膠囊中活性成分，綠色三角形代表蛋白靶點(diǎn)。再進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治觯罁?jù)度值大小篩選得到排名前15的潛在重要活性成分，分別為槲皮素、山柰酚、木犀草素、熊果酸、金絲桃苷、β-谷甾醇、右旋巴馬汀、維斯體素、刺芒柄花素、柚皮素、異鼠李素、川陳皮素、豆甾醇、美迪紫檀素、卡維丁。

3.2.4 生物過(guò)程與通路分析 生物過(guò)程分析主要涉及藥物反應(yīng)、老化基因的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控及凋亡過(guò)程的正向調(diào)控等；在細(xì)胞組成和分子功能方面，主要集中在細(xì)胞胞外間隙、胞漿和線粒體外膜中，并涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白激酶活性等，見圖8A。對(duì)126個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，共得到165條信號(hào)通路(P<0.05)，選取排名前二十的繪制氣泡圖，進(jìn)行可視化分析，見圖8B，可知共同靶點(diǎn)主要富集于癌癥通路、腫瘤壞死因子、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。

4 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)126個(gè)，金砂行氣膠囊可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，靶點(diǎn)之間也存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，并且富集于多條炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。富集分析顯示核心靶點(diǎn)主要作用TNF、TP53、Akt1、MAPK等通路上，提示這些蛋白是金砂行氣膠囊作用于炎癥通路的主要分子。其中IL-6的表達(dá)與炎癥反應(yīng)程度、幽門螺旋桿菌相關(guān)胃腸病發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，不僅可以引起炎癥細(xì)胞的集中，還能刺激更多炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[11-12]。MAPK8作為一種激酶，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β的活化，加重慢性淺表性胃炎的炎癥損傷[13-14]。caspase3與慢性淺表性胃炎的發(fā)病關(guān)系密切，該基因低表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡異常降低可能是胃癌的發(fā)病機(jī)制之一[15]。TNF-α是促進(jìn)幽門螺旋桿菌感染、抑制胃酸分泌的關(guān)鍵性炎癥因子[16]，其能夠誘導(dǎo)NF-κB結(jié)合雄激素受體啟動(dòng)子，激活炎癥信號(hào)通路，使IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子水平升高，結(jié)合富集分析推測(cè)TNF信號(hào)通路的激活是慢性淺表性胃炎發(fā)生發(fā)展的重要因素，調(diào)控TNF信號(hào)通路可抑制幽門螺旋桿菌感染[17-18]，從而控制該病的進(jìn)展，可能成為該病新的治療方向。

綜上所述，金砂行氣膠囊可有效改善慢性淺表性胃炎模型大鼠癥狀。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明金砂行氣膠囊是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮抗慢性淺表性胃炎藥理作用，為進(jìn)一步分子作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。