涂小華， 楊光勇， 楊 欣， 鄧 穎， 徐萌萌， 魏硯君， 萬(wàn) 億， 王 慧

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

胃腸黏膜對(duì)機(jī)體有特殊的保護(hù)作用，非甾體類抗炎藥物、酒精、微生物感染等均可引起其損傷。黏膜損傷后，機(jī)體將啟動(dòng)快速修復(fù)機(jī)制，包括上皮細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、黏膜重構(gòu)等環(huán)節(jié)，而多胺可通過調(diào)控鉀通道蛋白及鈣離子信號(hào)等促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移過程[1-2]，調(diào)控生長(zhǎng)相關(guān)基因蛋白而促進(jìn)正常上皮細(xì)胞增殖及黏膜生長(zhǎng)過程，還可影響上皮細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)[3]。Rho GTP酶(RhoA)既是細(xì)胞骨架重建的重要調(diào)控因子，又可調(diào)控細(xì)胞增殖過程[4-6]；p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子之一，對(duì)細(xì)胞增殖有重要負(fù)調(diào)控作用；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，Cdk2)通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程而影響上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)[6-7]。另外，多胺可通過調(diào)控上述基因蛋白表達(dá)而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖[6,8]。

四君子湯源于《太平惠民和劑局方》，具有益氣健脾之功效，常用于治療慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍等屬脾虛者。有研究表明，四君子湯可修復(fù)胃腸黏膜損傷，其機(jī)制與影響多胺信號(hào)通路有關(guān)[9-12]。上皮細(xì)胞增殖是黏膜損傷后修復(fù)的重要環(huán)節(jié)之一，但四君子湯促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制尚未明確，故本研究探索了該方對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖，多胺調(diào)控RhoA、磷酸化Cdk2蛋白表達(dá)，p21、Cdk2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞 大鼠小腸上皮細(xì)胞IEC-6，購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號(hào)ZQ0783。

1.2 動(dòng)物 健康SD大鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0014，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)11072622011001638，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后制備含藥血清。

1.3 試劑與藥物 人參、茯苓、炒白術(shù)、炙甘草,購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司(貴陽(yáng)分店)，經(jīng)專家鑒定為正品。胎牛血清(批號(hào)1606F，澳大利亞Bovogen Biological公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(批號(hào)20200211)、高糖DMEM(批號(hào)20200720)、胰酶(批號(hào)20191030)，購(gòu)自賽澳美細(xì)胞技術(shù)(北京)有限公司；腐胺(貨號(hào)D13208-25G)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；α-二氟甲基鳥氨酸(DFMO，批號(hào)3305986)，購(gòu)自德國(guó)Calbiochem公司；MTT(批號(hào)1015D058)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)PC0020)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液(貨號(hào)P0013B)、PMSF(貨號(hào)ST506)、SDS-PAGE凝膠試劑盒(貨號(hào)P0012A)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào)P0285)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸蛋白酶抑制劑(批號(hào)K10151133EE8D)，購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司；ECL化學(xué)發(fā)光液(貨號(hào)1705060)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；β-actin一抗(貨號(hào)4970S)、GAPDH一抗(貨號(hào)5174S)、RhoA一抗(貨號(hào)2117S)、Cdk2一抗(貨號(hào)18048S)、Phospho-Cdk2 (Thr160)一抗(貨號(hào)2516S)，購(gòu)自美國(guó)CST公司；p21一抗(貨號(hào)ab109199)、山羊抗兔IgG抗體(批號(hào)GR3321256-7)，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)9767)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)AJ92011A)、PCR熒光染料(批號(hào)AJE1687A)，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.4 儀器 RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；3111 CO2培養(yǎng)箱、Multiskan go酶標(biāo)儀、Nanodrop lite超微量紫外可見光分光光度計(jì)、Multifuge X1R離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；DMil倒置相差顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)；TC-96/G/H(b)梯度PCR儀(杭州博日科技股份有限公司)；CFX96熒光定量PCR儀、Power PacTMBasic電泳儀、ChemicDocTMXRS+成像(美國(guó) Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 空白、含藥血清制備 取人參、茯苓、炙甘草、炒白術(shù)各75 g，剪碎，12倍量水浸泡2 h后煎煮提取2 h，收集濾液，同法再煎煮1次，合并2次濾液，減壓濃縮至生藥量為1 g/mL的水提液。將大鼠隨機(jī)分為四君子湯組、空白組，每組10只，四君子湯組灌胃相應(yīng)水提液，給藥劑量為每天13 g/kg(相當(dāng)于人臨床給藥劑量約20倍)，而空白組灌胃等體積生理鹽水，每天2次，連續(xù)4 d，第4天一次性灌胃全天劑量。給藥2 h后乙醚麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，血樣靜置2 h后3 000 r/min離心15 min，分離血清，混勻同組血清，在56 ℃下滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝，置于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用前，以含0.5%胎牛血清的DMEM將空白血清稀釋成10%培養(yǎng)基，四君子湯血清稀釋成5%、10%、20%培養(yǎng)基。

2.2 IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 參照文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法，IEC-6細(xì)胞以5×104/mL密度接種于96孔板，每孔200 μL，以含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道加入不含血清的DMEM進(jìn)行血清饑餓24 h后，對(duì)照組每孔加入含10%空白血清培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入含腐胺(終濃度10 μmol/L)的10%空白血清培養(yǎng)基，含藥血清低、中、高劑量組分別加入5%、10%、20%四君子湯含藥血清培養(yǎng)基，總體積為200 μL。在DFMO負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中，除對(duì)照組外其余各組均加入2.5 mmol/L DFMO，DFMO組加入含DFMO(終濃度2.5 mmol/L)的10%空白血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，在37 ℃下避光孵育4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，以吸光度表示細(xì)胞增殖活力。每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 RT-qPCR法檢測(cè)p21、Cdk2 mRNA表達(dá) IEC-6細(xì)胞以8×104/mL密度接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“2.2”項(xiàng)(培養(yǎng)基體積為2.5 mL)。培養(yǎng)48 h后，RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，檢測(cè)其純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，所得cDNA樣品加入引物及熒光染料，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為25 μL總體系，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算p21、Cdk2 mRNA相對(duì)表達(dá)，每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，序列見表1。

2.4 Western blot法檢測(cè)RhoA、p21、Cdk2及p-Cdk2蛋白表達(dá) IEC-6細(xì)胞以8×104/mL密度接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“2.2”項(xiàng)(培養(yǎng)基體積為2.5 mL)。給藥培養(yǎng)48 h后刮取細(xì)胞，并用RIPA裂解液(臨用前加PMSF及磷酸化蛋白酶抑制劑)提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，蛋白樣品加入上樣緩沖液后，沸水浴5 min以制備蛋白印跡上樣樣品，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h，β-actin、GAPDH、RhoA、p21、Cdk2、p-Cdk2一抗在4 ℃下孵育過夜，洗膜后加入山羊抗兔二抗孵育1 h，再將PVDF膜浸沒在ECL發(fā)光液中5 min，置于Chemic DocTMXRS+成像儀上成像。以β-actin、GAPDH為內(nèi)參，采用Image Lab軟件分析RhoA、p21、Cdk2、p-Cdk2蛋白條帶灰度值，每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 四君子湯含藥血清對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響 圖1顯示，與對(duì)照組比較，給藥24 h后腐胺組及10%、20%四君子湯含藥血清組細(xì)胞增殖活力增加(P<0.01)，給藥48、72 h后腐胺組及各劑量四君子湯含藥血清組細(xì)胞增殖活力均增加(P<0.01)。與對(duì)照組比較，給藥48、72 h后，多胺合成抑制劑DFMO可降低細(xì)胞增殖活力(P<0.01)；與DFMO組比較，給藥48 h后腐胺組及各劑量四君子湯含藥血清組可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的細(xì)胞增殖活力降低(P<0.01)，而給藥72 h后腐胺組及10%、20%四君子湯含藥血清組亦可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的細(xì)胞增殖活力降低(P<0.01)。

3.2 四君子湯含藥血清對(duì)RhoA蛋白表達(dá)的影響 圖2顯示，與對(duì)照組比較，腐胺組及10%、20%四君子湯含藥血清組可升高RhoA蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，而DFMO組可抑制其蛋白表達(dá)(P<0.05)；與DFMO組比較，腐胺組及四君子湯各劑量含藥血清組可逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)RhoA蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.01)。

3.3 四君子湯含藥血清對(duì)p21、Cdk2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 圖3顯示，與對(duì)照組比較，腐胺組及四君子湯各劑量含藥血清組可抑制p21 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，而腐胺組及10%、20%四君子湯含藥血清組可升高Cdk2 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。圖4顯示，與對(duì)照組比較，DFMO組可升高p21 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.01)，抑制Cdk2 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；與DFMO組比較，腐胺組及10%、20%四君子湯含藥血清組可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的p21 mRNA和蛋白表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)及Cdk2 mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)。

3.4 四君子湯含藥血清對(duì)p-Cdk2蛋白表達(dá)的影響 圖5顯示，與對(duì)照組比較，腐胺組及四君子湯各劑量含藥血清組可提高p-Cdk2蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，而DFMO組可降低其蛋白表達(dá)(P<0.01)；與DFMO組比較，腐胺組及四君子湯各劑量含藥血清組可逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)p-Cdk2蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.01)。

4 討論

中醫(yī)“四季脾旺不受邪”“內(nèi)傷脾胃，百病由生”等理論與胃腸黏膜保護(hù)功能相關(guān)，胃腸黏膜保護(hù)是中醫(yī)“脾”功能的重要內(nèi)容。有研究表明，非器質(zhì)性病變脾虛患者可見胃腸黏膜損傷的病理改變，其十二指腸及胃上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，脫落等癥狀[15-16]。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、甘草等比例組方，方中人參為君藥，甘溫益氣，養(yǎng)胃健脾；臣以苦溫之白術(shù)，健脾燥濕；佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，茯苓白術(shù)配伍，則健脾祛濕之功益著；炙甘草為使，益氣和中，調(diào)和諸藥，諸藥配伍，具有益氣健脾之功效，可改善患者的脾胃功能，緩解消化性潰瘍患者癥狀，促進(jìn)病灶愈合[17-18]。前期研究表明四君子湯通過影響多胺調(diào)控細(xì)胞遷移過程而促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù)[9-10]，但其對(duì)上皮細(xì)胞增殖過程作用機(jī)制研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯含藥血清對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖都有促進(jìn)作用。DFMO可減少多胺的生物合成，目前常用于多胺信號(hào)通路相關(guān)研究[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，多胺合成抑制劑DFMO可抑制小腸上皮細(xì)胞增殖，四君子湯含藥血清可逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，該作用與腐胺(外源性多胺)作用相似,提示四君子湯可影響多胺促進(jìn)正常小腸上皮細(xì)胞增殖。

RhoA是Rho家族成員之一，調(diào)控細(xì)胞骨架重建過程[19]，在黏膜損傷早期修復(fù)過程中，多胺可通過增加鈣離子濃度、提高RhoA蛋白表達(dá)而促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移過程，加入DFMO后，則可降低鈣離子濃度，抑制RhoA蛋白表達(dá)而阻滯細(xì)胞遷移[20]。p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子之一，在黏膜損傷后修復(fù)過程中，多胺可通過上調(diào)c-Myc表達(dá)而抑制p21蛋白表達(dá)，促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖過程[21]。Cdk2是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶成員之一，對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控有重要作用，Thr160位點(diǎn)的磷酸化為其活性形式。過表達(dá)RhoA可提高Cdk2表達(dá)及活性而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖[6]。研究發(fā)現(xiàn)，多胺合成減少可引起p21表達(dá)升高，增加其與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk2、Cdk4等)復(fù)合物的形成，最終降低Cdk2、Cdk4蛋白活性而抑制正常小腸上皮細(xì)胞增殖[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，DFMO可抑制RhoA蛋白、Cdk2 mRNA和蛋白的表達(dá)，升高p21 mRNA和蛋白表達(dá)；四君子湯含藥血清可逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)RhoA蛋白和p21、Cdk2 mRNA和蛋白表達(dá)的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，四君子湯含藥血清不僅可提高磷酸化Cdk2蛋白表達(dá)，還可逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)Cdk2磷酸化水平的抑制作用。上述結(jié)果表明，四君子湯含藥血清可能通過影響多胺上調(diào)RhoA蛋白及Cdk2表達(dá)，并提高Cdk2蛋白磷酸化水平，最終促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖。

綜上所述，四君子湯可作用于多胺信號(hào)通路，上調(diào)RhoA蛋白表達(dá)以及下調(diào)p21表達(dá)，從而提高Cdk2表達(dá)及其活性，最終促進(jìn)正常小腸上皮細(xì)胞增殖。