畢雪嬋，謝孟諺，吳 艷

（北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家藥品監(jiān)督管理局化妝品質(zhì)量控制與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100034）

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是一種大分子糖胺聚糖，是皮膚細(xì)胞外基質(zhì)重要的組成部分，能結(jié)合多達(dá)其自身重量1 000倍的水，以提高皮膚水合和增加皮膚體積[1]。但隨著年齡增加，透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)量逐漸減少，導(dǎo)致皮膚水合度下降、萎縮，皮膚干燥、出現(xiàn)皺紋等老化表現(xiàn)[2]。近來透明質(zhì)酸被廣泛應(yīng)用于化妝品和醫(yī)療美容行業(yè)，已有許多臨床試驗(yàn)證明，滾針后涂抹或注射非交聯(lián)透明質(zhì)酸具有年輕化的效果，可以減輕皺紋，改善皮膚顏色、彈性、光澤度、粗糙度等，不同給藥方式的臨床改善效果也不同[3-5]，但透明質(zhì)酸不同給藥方式的具體作用機(jī)制不清。本試驗(yàn)擬研究復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸（Compound non-cross-linked hyaluronic acid，CNCLHA）通過注射和滾針后涂抹等不同給藥方式對小鼠皮膚的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及藥物：健康的C57BL/6小鼠21只，雌性，6～8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證批號(hào)SCXK(京)2015-0001。小鼠于清潔級動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)，被喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食，購入后適應(yīng)環(huán)境1周后開始試驗(yàn)。復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸試劑為潤維他化妝品有限公司的絲麗動(dòng)能素Cytocare 516，批號(hào)：國妝備進(jìn)字J20174673。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將小鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，每組7只，每組小鼠左右側(cè)皮膚接受不同處理，共6個(gè)處理組，分別為：CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組，0.9%生理鹽水滾針涂抹組，0.9%生理鹽水注射組，空白對照組。每組具體處理方法如表1所示。

表1 各組具體處理方法

在實(shí)驗(yàn)前、第7、14天根據(jù)分組進(jìn)行不同治療，實(shí)驗(yàn)前及第28天分別使用經(jīng)皮水分丟失測試儀Vapometer（Delfin Technologies Ltd，芬蘭）測量小鼠皮膚的TEWL，Corneometer（CM825，Courage and Khazaka，德國）測量角質(zhì)層含水量，Cutometer MPA 580（Courage & Khazaka electronic GmbH，德國）測量小鼠皮膚彈性。第28天取小鼠背部左右兩側(cè)皮膚，將一只小鼠一側(cè)背部采集的皮膚標(biāo)本分為3份，分別用于組織病理、Western blot及RT-PCR檢測。

1.2.1 組織病理：標(biāo)本用10%福爾馬林固定，包埋石蠟后切片，行HE染色、馬松（Masson）染色、EVG染色、阿申藍(lán)-糖原（AB-PAS）染色及MOVAT五色染色，來觀察小鼠皮膚在組織水平上的變化。以上染色所需試劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2.2 Western blot法：標(biāo)本加裂解液進(jìn)行勻漿，離心后取上清液用于Western Blot。一抗為Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）和α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體，二抗分別為HRP山羊抗兔抗體和HRP山羊抗小鼠抗體，用化學(xué)發(fā)光法使膠片顯影。以上抗體均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。使用Image J軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行相對定量分析。

1.2.3 RT-PCR檢測：標(biāo)本經(jīng)液氮研磨后用Total RNA Kit I（R6834-01，Omega）提取總RNA，TransScript cDNA Synthesis Super Mix（AT311-03，北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行cDNA合成，SYBR Green Master Mix（A25742，Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行RT-PCR，用相對定量分析法2-△△CT計(jì)算Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ），α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的相對表達(dá)水平。引物序列如表2所示。

表2 RT-PCR所用引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究所得數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，用Graphpad Prism 6進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，若方差不齊則采用校正t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組皮膚生理指標(biāo)改變：與基線相比，CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組及CNCLHA滾針涂抹組在第28天角質(zhì)層含水量及皮膚彈性升高，TEWL降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CNCLHA真皮注射組在第28天與基線相比，皮膚彈性升高，TEWL降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他處理組在第28天與基線相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組皮膚生理指標(biāo)變化 （±s）

表3 各組皮膚生理指標(biāo)變化 （±s）

注：各組皮膚生理指標(biāo)在第28天與實(shí)驗(yàn)前（基線）相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 角質(zhì)層含水量/% 皮膚彈性 TEWL/(g/h·m2)實(shí)驗(yàn)前 第28天 實(shí)驗(yàn)前 第28天 實(shí)驗(yàn)前 第28天CNCLHA真皮注射組 74.27±7.22 74.09±9.43 0.2394±0.0686 0.6025±0.0923*** 11.94±2.23 6.95±2.95**CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組 73.62±7.29 85.31±3.42* 0.2767±0.1170 0.5715±0.1149** 10.79±1.27 7.03±1.75*CNCLHA滾針涂抹組 77.84±4.16 81.75±5.61* 0.4921±0.1460 0.8036±0.0684** 8.88±2.40 5.98±1.78*0.9%生理鹽水滾針涂抹組 76.20±8.16 71.28±2.23 0.4762±0.0736 0.6822±0.1246 11.05±1.91 9.10±3.08 0.9%生理鹽水注射組 77.02±5.55 77.34±5.90 0.6041±0.0873 0.4584±0.1258 10.23±3.45 7.12±1.48空白對照組 81.02±6.73 74.78±3.98 0.6048±0.1125 0.5164±0.0828 12.24±2.03 7.82±1.28*

2.2 各組組織病理學(xué)改變：HE染色（見圖1）示第28天接受滾針治療的處理組（CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組，0.9%生理鹽水滾針涂抹組）可以看到輕度表皮增厚的反應(yīng)，而接受真皮注射的處理組（CNCLHA真皮注射組，0.9%生理鹽水注射組）表皮增厚不明顯。接受CNCLHA治療的處理組（CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組）可見真皮不同程度增厚，真皮內(nèi)膠原更加紅染、致密，其中CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組真皮增厚和膠原合成增加最顯著。

圖1 各組小鼠皮膚組織HE染色（100×）

Masson染色可見相比于空白對照組，接受CNCLHA治療的處理組（CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組）真皮中藍(lán)染的膠原纖維增粗，排列緊密，膠原纖維量CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組＞CNCLHA真皮注射組＞CNCLHA滾針涂抹組。CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組Masson染色結(jié)果見圖2。

圖2 CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組Masson染色結(jié)果（100×）

EVG染色可見相比空白對照組，CNCLHA真皮注射組及CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組真皮內(nèi)不僅膠原纖維數(shù)量增加排列緊密，并且有多數(shù)黑染的彈力纖維分布在真皮的淺中層；CNCLHA滾針涂抹組可以看到少量彈力纖維新生，主要分布在真皮的淺層。CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組EVG染色結(jié)果見圖3。

圖3 CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組EVG染色結(jié)果（100×）

AB-PAS染色中酸性粘多糖物質(zhì)呈藍(lán)色，中性粘多糖物質(zhì)呈紫紅色，混合粘多糖物質(zhì)呈紫藍(lán)色或藍(lán)紫色。透明質(zhì)酸為酸性粘多糖，藍(lán)染物質(zhì)增加說明有新合成的透明質(zhì)酸。第28天可見CNCLHA真皮注射組、CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組藍(lán)染物質(zhì)明顯多于其他生理鹽水處理組及空白對照組，尤其是CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組。CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組AB-PAS染色結(jié)果見圖4。

圖4 CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組AB-PAS染色結(jié)果（100×）

MOVAT染色會(huì)使細(xì)胞核和彈力纖維呈黑色，蛋白聚糖呈綠色，膠原纖維網(wǎng)狀纖維呈黃色。因此可以同時(shí)觀察真皮細(xì)胞外基質(zhì)的三種重要組分（膠原纖維、彈力纖維和透明質(zhì)酸）。MOVAT染色的結(jié)果與上述結(jié)果相符，CNCLHA真皮注射組、CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組在刺激膠原纖維、彈力纖維和透明質(zhì)酸新生方面效果更好，尤其是CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組。CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組MOVAT染色結(jié)果見圖5。

圖5 CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組與空白對照組MOVAT染色結(jié)果（100×）

2.3 Western blot分析：使用Western blot分析第28天各組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ、α-SMA的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，第28天所有處理組與空白對照組相比，Collagen Ⅰ均有不同程度的增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組Collagen Ⅰ含量在所有組中最高，CNCLHA真皮注射組高于0.9%生理鹽水注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。除0.9%生理鹽水注射組外，其余處理組α-SMA含量較空白對照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組＞CNCLHA真皮注射組＞0.9%生理鹽水注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6～7。

圖6 Western blot分析第28天各組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表達(dá)

2.4 RT-PCR檢測結(jié)果：使用RT-PCR檢測不同處理組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ和α-SMA的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示在第28天，所有處理組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ相對表達(dá)水平較空白對照組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而CNCLHA真皮注射組、CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組、CNCLHA滾針涂抹組小鼠皮膚中α-SMA表達(dá)量是空白對照組的3倍以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖8。

圖7 第28天各組小鼠皮膚Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表達(dá)的相對定量結(jié)果

圖8 第28天各組小鼠皮膚Collagen Ⅰ、α-SMA基因表達(dá)相對倍數(shù)

3 討論

皮膚老化組織學(xué)上主要表現(xiàn)為表皮萎縮變薄以及真皮中膠原纖維、彈力纖維、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)減少[6]，向皮膚中補(bǔ)充外源性透明質(zhì)酸可以增強(qiáng)皮膚水合能力，提升皮膚體積，改善皮膚老化的表現(xiàn)。由于透明質(zhì)酸分子量大，直接涂抹很難通過角質(zhì)層進(jìn)入皮膚內(nèi)部，因此臨床上會(huì)采用滾針后涂抹或真皮注射的方式將透明質(zhì)酸直接補(bǔ)充到皮膚深層。已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示這些方法可以減輕皺紋，改善皮膚顏色、彈性、光澤度、粗糙度、經(jīng)皮水分丟失、角質(zhì)層含水量等[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單純滾針處理（0.9%生理鹽水滾針涂抹組）可以促進(jìn)表皮增厚，而滾針后涂抹CNCLHA（CNCLHA滾針涂抹組）可以更好地提高角質(zhì)層含水量和降低TEWL，促進(jìn)皮膚屏障的修復(fù)。真皮注射CNCLHA（CNCLHA真皮注射組）則沒有刺激表皮增厚的作用，而聯(lián)合給藥（CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組）表皮增厚和皮膚屏障修復(fù)的效果更明顯。這可能是由于滾針刺破角質(zhì)層，產(chǎn)生微損傷可以啟動(dòng)傷口愈合的進(jìn)程，從而促進(jìn)表皮再生[7]；同時(shí)滾針產(chǎn)生的微通道能夠增加經(jīng)皮藥物輸送（Transdermal drug delivery，TDD），使涂抹的透明質(zhì)酸繞過角質(zhì)層的屏障功能[8]，直接進(jìn)入皮膚，提升其鎖水能力，幫助修復(fù)皮膚屏障。Aust等[9]對小鼠皮膚滾針后涂抹復(fù)合維生素霜，發(fā)現(xiàn)與基線相比，8周后單純滾針處理組表皮厚度增加112%，滾針后涂抹復(fù)合維生素霜組表皮厚度增加140%，HE染色觀察到滾針后涂抹復(fù)合維生素霜組顆粒層增厚，表皮細(xì)胞數(shù)量增加，角質(zhì)層更致密。上述結(jié)果都支持滾針治療本身有刺激表皮再生的作用，而聯(lián)合外涂產(chǎn)品包括本研究中的復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸可以更好地促進(jìn)表皮增厚，修復(fù)皮膚屏障。

本次發(fā)現(xiàn)滾針后涂抹CNCLHA（CNCLHA滾針涂抹組）小鼠皮膚彈性有所增加，組織病理示CNCLHA滾針涂抹組真皮淺層有少量新生膠原纖維和彈力纖維，Western blot示與空白對照組相比，CNCLHA滾針涂抹組Ⅰ型膠原蛋白水平上升（P＜0.05）。這說明滾針后涂抹非交聯(lián)透明質(zhì)酸不僅對于表皮有促進(jìn)增生的作用，還可以通過部分上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白來增加皮膚彈性。相關(guān)研究也顯示[7]，對小鼠皮膚進(jìn)行滾針后涂抹非交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠處理可以增加真皮成纖維細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)生，刺激真皮血管增生，從而促進(jìn)組織再生。

本研究還發(fā)現(xiàn)接受真皮注射CNCLHA（CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組）小鼠皮膚彈性明顯增加，組織病理結(jié)果顯示不同程度的真皮層增厚，膠原纖維和彈力纖維新生，CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組最明顯；Western blot結(jié)果示CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組Ⅰ型膠原蛋白水平上升，且CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組＞CNCLHA真皮注射組；CNCLHA真皮注射組＞0.9%生理鹽水注射組＞空白對照組，說明單純真皮注射在增加Ⅰ型膠原蛋白水平有一定的作用，但是該作用不足夠產(chǎn)生肉眼可見的結(jié)果以及臨床改善，而真皮注射本身加上復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸產(chǎn)品的作用才可以形成臨床效果。Ⅰ型膠原蛋白是真皮中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由成纖維細(xì)胞生成，對于保持皮膚彈性有重要作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)真皮注射或滾針后外涂復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸或聯(lián)合給藥均可以刺激Ⅰ型膠原蛋白新生，從而提高皮膚彈性。Scarano等[11]通過人體試驗(yàn)得到了與本研究結(jié)果一致的結(jié)論，他們給受試者真皮注射復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸，治療后3個(gè)月病理示表皮和真皮增厚，成纖維細(xì)胞增生，血管數(shù)量增加，Masson染色和Van Gieson染色示膠原纖維增生，說明真皮注射非交聯(lián)透明質(zhì)酸能刺激成纖維細(xì)胞增殖，顯著促進(jìn)膠原蛋白、彈力纖維以及真皮基質(zhì)的合成和血管新生，使真皮增厚、皮膚彈性增加。

研究中還發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，滾針或注射CNCLHA都能增加皮膚中α-SMA水平，Western blot和RTPCR分別證實(shí)了α-SMA在蛋白和基因水平的表達(dá)增加。α-SMA是成纖維細(xì)胞分化為成熟肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志[12]。當(dāng)成纖維細(xì)胞受機(jī)械刺激、炎癥或創(chuàng)傷時(shí)，產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子尤其是TGF-β會(huì)驅(qū)動(dòng)成纖維細(xì)胞分化為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，后者比前者具有更強(qiáng)的合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的能力[13]，某種意義上來說肌成纖維細(xì)胞也被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞的一種活化狀態(tài)。本研究證明滾針或注射復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸可以通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化成為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)的合成。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)真皮注射聯(lián)合滾針后涂抹CNCLHA（CNCLHA真皮注射聯(lián)合滾針涂抹組）在促進(jìn)表皮增厚、改善皮膚屏障功能，以及促進(jìn)真皮再生、提高皮膚彈性等方面在所有組中效果最明顯。組織學(xué)結(jié)果顯示表皮真皮均增厚伴全層大量新生膠原纖維和彈力纖維；Western blot和RT-PCR結(jié)果證實(shí)了聯(lián)合給藥作用最為明顯。也有研究顯示相較于單純真皮注射非交聯(lián)透明質(zhì)酸，真皮注射聯(lián)合滾針后涂抹的治療方式對皮膚皺紋、顏色、毛孔、紋理等方面的改善更明顯，恢復(fù)期短，患者滿意度高[14]。這為臨床設(shè)計(jì)治療方案提出了非常好的指導(dǎo)建議，對于同時(shí)有表皮、真皮改善需求的就醫(yī)者或是老化表現(xiàn)較為明顯，希望短期有較明顯改善者，建議采用真皮注射聯(lián)合滾針后涂抹復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸的方式，可以達(dá)到更好的臨床效果。

綜上所述，通過小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了不同的給藥模式可以通過刺激表皮或真皮再生起到不同的臨床效果。滾針涂抹的給藥方式通過幫助大分子透明質(zhì)酸經(jīng)皮吸收，可以刺激表皮增生，因此在改善皮膚屏障功能和緩解皮膚干燥方面有效，但對于真皮的作用較弱。真皮注射的給藥方式在促進(jìn)真皮膠原纖維、彈力纖維和細(xì)胞外基質(zhì)增生及重塑方面有一定效果，可以使皮膚增厚，提高皮膚彈性。而聯(lián)合真皮注射和滾針后涂抹復(fù)方非交聯(lián)透明質(zhì)酸具備了表皮和真皮的雙重療效，各方面改善最為明顯。