藺寶珺，楊文權(quán)，趙 帥，柴港寧，魚楊華，武燕茹，韓顯忠，李希來，寇建村*

(1.西北農(nóng)林科技大學草業(yè)與草原學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100；3.門源縣草原站，青海 門源 810300；4.青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016)

土壤中的磷以有機和無機的形式存在，其作為植物生長發(fā)育所必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素對植物的生長發(fā)育和品質(zhì)提高具有重要意義[1-2]。然而磷作為一種沉積性礦物，絕大部分與土壤中陽離子等結(jié)合，植物難以吸收利用，所以往往成為植物生長的主要限制因素[3-5]。施用磷肥是提高土壤有效磷常用的方法，但磷肥施入土壤后常會被金屬離子固定形成磷酸鈣等難溶性磷酸鹽，降低了磷肥效果。此外，長期施用磷肥會造成一系列環(huán)境問題如土壤板結(jié)、酸化和水體富營養(yǎng)化等[6]。

溶磷菌可以將難溶無機磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽，或是將有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷，易于植物和土壤微生物的吸收利用，既能緩解土壤速效磷的缺乏問題，又能減少環(huán)境污染，因此，溶磷微生物的開發(fā)利用成為研究熱點[7-10]。土壤中溶磷細菌的種類和磷素來源不同，其溶磷的機制不同，此外土壤結(jié)構(gòu)類型、質(zhì)地、土壤有機質(zhì)和耕作方式對溶磷菌的數(shù)量和分布也有很大影響[11-12]。目前，關(guān)于溶磷菌在水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)等農(nóng)作物上的研究較多[13-18]，而高寒草地等特殊生境下的植物根際溶磷菌的研究也引起了不少關(guān)注，且大部分研究集中在篩選、溶磷能力及作用機理等方面。其中，在川西北高寒草甸植物根際篩選出12株兼具溶磷、固氮和解鉀的多功能菌株[19]；在四川紅原高寒草地篩選出的部分溶磷菌株既分泌吲哚-3-乙酸(IAA)，又能分泌赤霉素(GA3)和玉米素(t-Z)[20]；在西藏阿里的高寒牧草根際篩選出的高效溶磷菌對植物有較好的促生作用[21]。盡管如此，青藏高原高寒地區(qū)的溶磷菌資源的篩選及其應用的研究鮮有報道，挖掘該地區(qū)的溶磷菌用于菌肥開發(fā)和高寒退化草地修復已成為一項具有重要意義的工作。為此，本研究對祁連山國家公園青海片區(qū)的門源縣硫磺溝高寒草甸植物根際土壤中的溶磷細菌進行了分離，并對分離的4株溶磷菌的溶磷特性、促生效果等進行了研究，為青藏高原特殊環(huán)境下的微生物菌肥的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤來源

采樣地點位于祁連山公園青海片區(qū)的青海省門源回族自治縣硫磺溝。選擇生長旺盛的小嵩草(Kobresiamyosuroides(Villars)Foiri)和洽草(Koeleriamacrantha(Ledebour)Schultes)，用鏟子將植物連根挖出，刷掉根際土壤裝于無菌密封袋中并編號，帶回實驗室于4℃冰箱保存。

1.2 溶磷菌株的分離、篩選

溶磷菌采用稀釋平板涂布法在無機磷固體培養(yǎng)基表面進行分離純化[22]。28℃培養(yǎng)3—5 d后，挑選出現(xiàn)透明圈的不同形態(tài)菌落，在無機磷固體培養(yǎng)基上劃線數(shù)次，得到純化的單菌落并編號。將純化后的溶磷菌株保存于裝有已滅菌的LB液體培養(yǎng)基[21,23]和甘油的保菌管中，置于-80℃冰箱備用。

1.3 菌株溶磷能力的測定

1.3.1溶磷圈直徑的測定 采用溶磷圈法對溶磷菌的溶磷性能進行定性測試[24]，用游標卡尺測量D,d值，并計算SI值。D表示透明圈直徑，d表示菌落直徑，單位均為mm。公式如下。

SI=D/d

1.3.2溶磷菌磷增量的測定 挑取待測菌株單菌落于LB液體培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)24 h，調(diào)OD700至1，再按1%的接種量將菌液分別接種到無機磷液體培養(yǎng)基中，以未接菌培養(yǎng)基作空白對照(CK)，置于28℃，190 r·min-1搖床震蕩培養(yǎng)7 d后，在4℃，8 000 r·min-1下離心20 min，取上清液用鉬銻抗比色法測定扣除對照后各個菌株有效磷增量[24]，并計算解磷率[25]。同時用酸度計測定上清液的pH值。

式中，ρ為從標準曲線上查得有效磷的濃度(μg·mL-1)，Ts為分取倍數(shù)，V0為測定培養(yǎng)液的體積(mL)，V為顯色時定容體積(mL)。

1.4 菌株分泌有機酸能力的測定

采用不同分析純有機酸標準品(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸)制備不同梯度有機酸標準品混合液。取上述培養(yǎng)液離心后的上清液，參照管國強等人[26]試驗方案進行有機酸測定。

1.5 菌株16S rRNA序列鑒定

將篩選出來的菌株純培養(yǎng)后送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司進行16S rRNA基因測序[27]，并使用MEGA10軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 盆栽試驗

所用營養(yǎng)土來源于品氏托普園藝(上海)有限公司。種植前將營養(yǎng)土置于高溫高壓滅菌鍋中滅菌三次作為培養(yǎng)基質(zhì)，披堿草種子用75%酒精和2%(v/v)次氯酸鈉溶液消毒促生，并用無菌水清洗數(shù)次[27-28]。每盆均勻播種25粒，待披堿草出苗一周后進行接菌試驗。挑取所接菌株單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，在28℃，190 r·min-1搖床上震蕩培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌液OD700=1時接菌，每周接菌一次，共接種4次。試驗設置5個處理，每個處理三個重復，分別為添加25 mL未接菌(CK)和接種了MXSC5，MXSC6，MXSC7及MQC13的LB液體培養(yǎng)基。第一次接菌28 d后測量植株絕對株高，收獲地上部分測定鮮重、干重并計算含水量。參考鮑士旦《農(nóng)化分析第三版》[29]，測定土壤pH值、有機質(zhì)、速效磷和速效氮以及植物全氮、全磷、全鉀。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對菌株溶磷能力、分泌有機酸含量及盆栽試驗數(shù)據(jù)進行整理并處理，SPSS19.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小顯著差異(LSD)檢驗，用Origin2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株溶磷能力測定

從小嵩草和洽草根際土中篩選到具有溶磷效果的菌株4株。源自小嵩草根際土壤的菌株命名為MXSC5，MXSC6和MXSC7，篩選自洽草根際土壤的菌株命名為MQC13。4株溶磷菌均能在固體培養(yǎng)基上良好生長，并可形成肉眼可見的透明圈，隨著培養(yǎng)時間的增加，透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)均在增大(表1)。菌株MXSC5和MXSC7的SI值在第14 d達到最大，菌株MXSC6和MQC13的SI值在第16 d時略有增加。

表1 4株溶磷菌在固體培養(yǎng)條件下的溶磷表現(xiàn)

液體培養(yǎng)條件下，4株菌株在第7 d的溶磷能力測定結(jié)果顯示，有效磷增量在156.17～511.33 μg·mL-1之間，各處理組間差異顯著(P<0.05)，其中MQC13磷增量最大，MXSC7的磷增量最小，解磷率范圍為3.12%～10.23%；與對照組相比，接菌培養(yǎng)液pH值都有所降低(表2)。

表2 4株溶磷菌第7 d在液體培養(yǎng)條件下的溶磷能力和培養(yǎng)液的pH值

2.2 菌株分泌有機酸的種類及濃度

4株菌株在溶磷過程中均分泌草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，草酸含量最高?？傆袡C酸量在522.36～986.69 mg·L-1之間，MQC13培養(yǎng)液的總有機酸量最高，MXSC7總有機酸含量最低，且MXSC5的總有機酸量與MXSC6和MXSC7的差異極顯著(P<0.01)，這與MQC13的表現(xiàn)一致(表3)。由此可見，4株溶磷菌分泌的有機酸含量差異較大。

表3 4株溶磷菌分泌的有機酸的含量

2.3 菌株的鑒定

對篩選出的4株溶磷菌株進行16S rRNA基因測序，提交所得序列至EZbiocloud并進行比對，選取了相似度較高的菌株16S rRNA基因序列與所篩選菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示，MXSC6和MQC13分別鑒定為P.brassicacearumsubsp.Neoaurantiaca和P.atacamensis；4株溶磷菌株均為假單胞菌屬。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的4株溶磷菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 盆栽試驗

接菌增加了披堿草的株高和地上部干重(圖2，圖3a，3b)。4組接菌處理植株的株高在44.73～47.43 cm之間，較對照組增加顯著(P<0.05)。5組處理中，披堿草地上部干重在3.05～4.34 g之間，除MXSC6處理外，其余接菌處理較對照組增加顯著(P<0.05)。

圖2 接菌對披堿草生長狀況的影響

5組處理中披堿草地上部全氮、全磷、全鉀含量高低不同(圖3 d，3e，3f)。除MQC13處理外，其余接菌處理全氮含量較對照組增加顯著(P<0.05)。植株地上部全磷含量為MXSC5處理最高，較對照組增加顯著(P<0.05)，MXSC7處理則低于其他處理組及對照。此外4組接菌處理植株地上部全鉀含量較對照組增加顯著(P<0.05)。

圖3 接菌對披堿草生長指標及養(yǎng)分含量的影響

接菌處理后土壤養(yǎng)分發(fā)生不同程度的變化，與對照組相比，接菌處理組的土壤速效氮、速效磷和有機質(zhì)含量均高于對照組(圖4)。其中接菌處理的土壤速效氮含量較對照組增加顯著；除MXSC6處理外，其他接菌處理的土壤速效磷含量增加顯著；而對于土壤有機質(zhì)含量，MXSC5處理較對照組增加顯著(P<0.05)。

圖4 接菌對土壤pH值及養(yǎng)分含量的影響

3 討論

3.1 高寒草甸溶磷菌的篩選鑒定及溶磷能力分析

土壤中的溶磷菌主要有細菌、真菌和放線菌，種類、數(shù)量及實際應用最多的是細菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、歐文氏菌屬(Erwiniasp.)等[2,30]。本研究從高寒草甸篩選出4株可以溶解無機磷的菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，MXSC6和MQC13分別鑒定為P.brassicacearumsubsp.Neoaurantiaca和P.atacamensis，4株溶磷菌株均鑒定為假單胞菌屬。前人針對不同溶磷菌的溶磷特性與適應能力都有較多研究，同時也有將溶磷菌與其他根際促生菌等結(jié)合以促進植物對養(yǎng)分的吸收，為更好地將溶磷菌與實際生產(chǎn)相結(jié)合提供理論基礎(chǔ)[30-32]。本研究中4株溶磷菌在無機磷固體培養(yǎng)基上隨著培養(yǎng)時間增加，溶磷圈直徑也在變化，最后均達到最大或增長幅度趨于平緩，這可能與培養(yǎng)基中難溶性磷酸鹽的含量、菌株代謝產(chǎn)物釋放速度等有關(guān)。4株菌株在無機磷液體培養(yǎng)基中的磷增量在156.17～511.33 μg·mL-1之間，高于楊婉秋[19]、張英等人[21]在高寒草地植物根際篩選的溶磷菌。其原因可能是，一方面不同植物根際促生菌的種類及其產(chǎn)生的有機酸、菌體內(nèi)代謝途徑不同，另一方面培養(yǎng)基或土壤養(yǎng)分也會對溶磷菌的生長狀況和代謝途徑產(chǎn)生影響，進而表現(xiàn)出不同溶磷效果[19]。

3.2 菌株分泌有機酸及溶磷能力相關(guān)性研究

溶磷菌分泌的有機酸可以跟陽離子形成螯合物，釋放磷酸根離子，菌種不同，其產(chǎn)酸的種類、含量和溶磷能力也不相同[33-36]。本試驗所篩選的4株菌均可分泌草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸7種有機酸，各菌株均為草酸含量最高，在溶磷過程中發(fā)揮主要作用。同時有效磷增量最高的菌株MQC13，其總有機酸量最高。各菌株在固體培養(yǎng)基上的SI值大小比較為MQC13>MXSC5>MXSC6>MXSC7，這與總有機酸量的表現(xiàn)一致，而在液體培養(yǎng)條件下的磷增量大小為MQC13>MXSC6>MXSC5>MXSC7。對總有機酸量與磷增量之間相關(guān)性進行研究，發(fā)現(xiàn)兩者之間并無相關(guān)性，這可能是由于金屬離子與不同種類的有機酸的結(jié)合能力不同，因此單一的總有機酸量并不能完全代表菌株的溶磷效果；也有可能是因為菌株在溶磷過程中自身吸收利用了一部分磷元素，或是以無機磷酸鹽的形式貯藏在溶磷菌株細胞內(nèi)，使得該菌株的溶磷能力被低估[4,37]。有研究認為溶磷菌溶磷量與pH值呈負相關(guān)[38-39]，然而也有研究指出微生物的溶磷量與pH值之間不存在顯著的相關(guān)性[40]。本試驗中接菌處理的培養(yǎng)液的pH值與CK培養(yǎng)液相比有所降低。這與馬文文等人在東祁連山高寒地區(qū)分離的溶磷菌在液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH值變化情況相一致[24]。相關(guān)性分析顯示培養(yǎng)液pH值與總有機酸量相關(guān)性顯著(P<0.05)，與磷增量之間無顯著相關(guān)性，說明本試驗中有機酸降低了培養(yǎng)液pH值，但pH值的降低對菌株的溶磷能力作用較微弱。

3.3 菌株對披堿草促生效果研究

諸多研究表明溶磷微生物可以增加土壤養(yǎng)分，提高作物產(chǎn)量[41-42]。本試驗盆栽結(jié)果顯示，從高寒草甸根際土中所篩選出的4株溶磷菌株均可顯著提高披堿草的株高和地上部干重(P<0.05)，這與張英在高寒草原分離出的溶磷菌在披堿草盆栽接種試驗的結(jié)果一致[21]。此外，菌株培養(yǎng)液提高了土壤速效養(yǎng)分，這與Kurek、Wu等人分別接種溶磷菌于蘋果樹(MalusdomesticaBorkh.)幼苗和油茶(CamelliaoleiferaAbel)的盆栽試驗中，溶磷菌對土壤速效氮和速效磷有正向影響的結(jié)果相似[43-44]。接種溶磷菌使得植物生長和土壤養(yǎng)分發(fā)生變化，可能是由于溶磷菌株通過產(chǎn)生有機酸和胞外磷酸酶溶解土壤中的不溶性磷酸鹽，緩解土壤中磷素的限制，從而促進植物的生長[45-46]；另一方面可能與其代謝有關(guān)，溶磷菌通過分泌多種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、維生素，對解磷以及植物生長具有雙重促進效果[47]。此外，本試驗所用營養(yǎng)土有機質(zhì)含量較高，為溶磷菌提供足夠有機碳源，促進其生命活動，也進一步提高了土壤速效養(yǎng)分[48]。

4 結(jié)論

本研究從青海高寒草甸洽草和小嵩草根際土壤中分離篩選出4株優(yōu)良溶磷菌，均屬于假單胞菌屬；4株優(yōu)良溶磷菌能有效促進植物生長，在高寒地區(qū)植物促生和微生物菌肥開發(fā)利用方面具有良好的潛力。