李 瑩，劉 強(qiáng)，項(xiàng) 瑋，李倩囡

（徐州工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018）

胞外聚合物（EPS）被公認(rèn)為是造成膜污染的主要物質(zhì)，研究表明可通過抑制生物膜的形成減少其含量〔1〕。目前，研究人員多采取優(yōu)化反應(yīng)器系統(tǒng)運(yùn)行條件、改善膜的性質(zhì)以及投加各種抗生物等措施防止生物膜的形成〔2-3〕，然而這些措施存在運(yùn)行管理復(fù)雜或易導(dǎo)致抗藥性細(xì)菌耐藥性加強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)〔4〕，因此，抑制生物膜形成的便捷、安全的技術(shù)方法亟待開發(fā)。

微生物群體之間存在群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS），其是指同一物種或者不同物種之間廣泛存在由協(xié)調(diào)群落基因表達(dá)和行為的小分子化合物（統(tǒng)稱為信號分子）介導(dǎo)的信息交流，從而在環(huán)境中使得某一或某一類物種產(chǎn)生競爭優(yōu)勢的現(xiàn)象。已有很多學(xué)者從污水處理反應(yīng)器中篩分出了具有分泌和降解信號分子的菌株〔5-6〕，按照對信號分子的作用可以將所得菌株分為4大類：群體感應(yīng)猝滅菌（即信號分子降解菌，QQ 菌）、群體感應(yīng)菌（即信號分子分泌菌，QS 菌）、既能降解信號分子又能分泌信號分子的細(xì)菌（QQ＆QS 菌）和既不能分泌信號分子也不能降解信號分子的細(xì)菌。

復(fù)合式膜生物反應(yīng)器（HMBR）由傳統(tǒng)MBR 和懸浮填料有機(jī)組合而成，兼具活性污泥工藝和MBR工藝的優(yōu)點(diǎn)，并且由于懸浮填料的添加，反應(yīng)器擁有數(shù)量更多、種群更加豐富的微生物。前期研究結(jié)果表明，污泥齡（SRT）能顯著影響HMBR 內(nèi)部去除污染物相關(guān)菌群的群落結(jié)構(gòu)〔7〕，由此推測SRT 也可能影響與信號分子分泌相關(guān)的菌群的分布，從而影響HMBR 中的群體感應(yīng)強(qiáng)度，進(jìn)而調(diào)節(jié)膜污染過程，但到目前為止，與此相關(guān)的研究尚較為缺乏。

本研究旨在保障污水處理效果的前提下，從SRT 對群體感應(yīng)相關(guān)菌群（QQ 菌、QS 菌、QQ＆QS 菌）群落結(jié)構(gòu)的影響出發(fā)，分析SRT 通過干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制EPS 生成的機(jī)理，以期在HMBR 污水處理系統(tǒng)中建立一種新的膜污染控制策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、裝置及運(yùn)行參數(shù)

試驗(yàn)原水為某高校學(xué)生宿舍區(qū)生活污水，接種污泥為某污水廠二沉池的回流污泥。污水原水水質(zhì)為：水溫21.3～29.2 ℃，pH 7.2～7.8，COD-N、TN、TP 分別為（210.1～324.8）、（38.5～78.1）、（35.8～86.7）、（5.5～6.7）mg/L。

HMBR 反應(yīng)器結(jié)構(gòu)如圖1 所示，其主要由活性污泥混合液、膜組件和懸浮填料3 個功能單元組成。原水通過原水泵抽吸進(jìn)入系統(tǒng)內(nèi)部，活性污泥混合液和附著在懸浮填料表面的微生物對污染物進(jìn)行生化降解，之后在蠕動泵的抽吸作用下，經(jīng)由膜的微濾過程完成系統(tǒng)出水。該反應(yīng)器主體材質(zhì)為有機(jī)玻璃，有效容積為1.0 m3。懸浮填料投加體積分?jǐn)?shù)為50%。膜組件材料為聚偏氟乙烯，膜孔徑為0.2 μm，膜總面積為1.0 m2，膜通量為10.0 L/（m2·h）。安裝在底部的曝氣頭為整個系統(tǒng)提供DO，同時為膜組件提供切應(yīng)力以減緩生物膜的附著。系統(tǒng)以間歇交替模式運(yùn)行，運(yùn)行4 min 暫停2 min，運(yùn)行過程中實(shí)時監(jiān)測真空表壓力變化，在跨膜壓差（TMP）達(dá)到20 kPa時對膜組件進(jìn)行清洗更換。試驗(yàn)過程中控制該反應(yīng)裝置內(nèi)部環(huán)境pH 為7.5 左右，DO 為4.0 mg/L，溫度為20 ℃，SRT 分別控制在10、20、30 d，水力停留時間控制在10 h。

圖1 HMBR 設(shè)備示意Fig.1 Schematic diagram of HMBR equipment

1.2 檢測項(xiàng)目及方法

1.2.1 常規(guī)指標(biāo)檢測方法

采用哈希HQ30 d 分析儀測定DO、pH；采用快速消解法測定COD；采用納氏試劑分光光度法測定-N；采用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測定TN；采用過硫酸鉀消解-鉬銻抗分光光度法測定TP。

1.2.2 高通量測序方法

采集3 個工況（SRT=10、20、30 d）下HMBR 膜表面、懸浮填料表面及活性污泥混合液中的活性污泥，混勻后置于無菌離心管中于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。送檢時將所有樣本置于盛有足夠干冰的保溫箱中，運(yùn)送到相關(guān)專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行DNA 提取和高通量測序，特異引物為16S V4～V5 序列。

采用二次擴(kuò)增的方法提高目標(biāo)DNA 的純度，PCR 擴(kuò)增體系的方法和參數(shù)同參考文獻(xiàn)〔7〕中要求。

1.2.3 信號分子檢測方法

鑒于信號分子分子質(zhì)量較小，能夠透過膜孔，故而假定HMBR 出水中的信號分子濃度與反應(yīng)器中的信號分子濃度差異可以忽略。采用文獻(xiàn)〔8〕中的方法對HMBR的出水進(jìn)行固相萃?。⊿PE）富集，之后采用Aquity超高效液相色譜（UPLC）串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（Xe?voTMTO MS，美國）檢測反應(yīng)器對信號分子進(jìn)行定量分析，三重四級桿質(zhì)譜需配置電噴霧離子源。

2 結(jié)果與討論

2.1 SRT 對HMBR 去除污染物的效果及運(yùn)行周期的影響

圖2 不同SRT 下各污染物的去除情況Fig.2 Removal of pollutants under different SRT

由圖2 可知，HMBR 在3 個工況下均具有良好的污染物降解效果。3 個工況下的出水COD、-N 均滿足《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 18918—2002）一級A 標(biāo)準(zhǔn)要求（COD≤50，-N≤5），TN、TP滿足二級標(biāo)準(zhǔn)要求（TN 不限制，TP≤5），且SRT=30 d 的工況下出水TN、TP 質(zhì)量濃度最低。綜合4 個指標(biāo)來看，SRT 為30 d 的工況下HMBR 出水效果最佳。

不同工況下TMP 的變化規(guī)律見圖3。

圖3 不同SRT 下TMP 的變化Fig.3 Changes of TMP under different SRT

由圖3 可知，隨著SRT 的延長，TMP 上升到預(yù)設(shè)值20 kPa 的時間逐漸拉長，特別是當(dāng)SRT 為30 d 時，TMP上升到20 kPa 的時間較SRT=10 d 時增加了1.1 倍，表明SRT 確實(shí)能夠調(diào)控HMBR 內(nèi)膜組件的污染狀況，從而影響運(yùn)行周期。先前也有研究表明，EPS 與SRT 緊密相關(guān)〔9〕，適當(dāng)延長SRT 有助于控制EPS 的含量及成分組成〔10〕，從而減輕膜污染，延長運(yùn)行周期。

2.2 HMBR 中群體感應(yīng)相關(guān)菌群對SRT 的響應(yīng)機(jī)制

已有研究表明EPS 及生物膜的形成受到群體感應(yīng)的影響，下面將從與群體感應(yīng)相關(guān)的菌群（QQ 菌、QS 菌、QQ＆QS 菌）角度對SRT 調(diào)控膜污染的機(jī)理進(jìn)行分析探討。

對3 個工況下（A 工況SRT=10 d，B 工況SRT=20 d，C 工況SRT=30 d）HMBR 反應(yīng)器內(nèi)部鑒別出的QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS 菌的相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖4。對圖4 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，即將各樣品中和群體感應(yīng)相關(guān)的微生物分類求和得到總的QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS 菌的相對豐度及其序列數(shù)，結(jié)果見圖5。

由圖4（a）可知，HMBR 反應(yīng)器中檢測到的QQ 菌主要有Anaerolineaceae（厭氧繩菌科）、Comamonas（從單胞菌科）、Xanthomonadaceae（黃單胞菌科）、Cloaci?bacterium（梭狀芽胞桿菌屬）、Chryseobacterium（金黃桿菌屬）、Flavobacterium（黃桿菌屬）、Pedobacter（土壤桿菌屬）、Mesorhizobium（中慢生根瘤菌屬）等。其中Comamonas、Xanthomonadacea 和Anaerolineaceae 相對豐度較大，隨著SRT 的延長三者的相對豐度呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。結(jié)合圖5 所示的QQ 菌的相對豐度和序列數(shù)綜合分析后發(fā)現(xiàn)，隨著SRT 的延長，QQ 菌總數(shù)呈現(xiàn)先降低后上升的規(guī)律，即便當(dāng)SRT=20 d 時QQ 菌相對豐度達(dá)到最低，但也到了10%以上，總序列數(shù)達(dá)到了55 350，說明HMBR 內(nèi)部含有豐富的QQ 菌。QQ 菌分泌的qsdA 酶可以將N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯類化合物（AHLs）的內(nèi)酯環(huán)水解以實(shí)現(xiàn)對AHL 的降解，由此可以推測HMBR 具有良好的猝滅信號分子能力，即具有良好的膜污染控制潛力。

圖4（b）中的數(shù)據(jù)表明，HMBR 反應(yīng)器內(nèi)還含有豐富的QS 菌群，主要包括Rhodocyclaceae（紅環(huán)菌屬）、Nitrosomonadaceae_unclassified（未分類的亞硝化單胞菌科）和Thermomonas（熱單胞菌屬）等。隨著SRT 的延長，Rhodocyclaceae的相對豐度呈現(xiàn)先降低又急劇升高的規(guī)律，而Nitrosomonadaceae_unclassified 的豐度出現(xiàn)明顯下降的趨勢。值得注意的是，Thermomonas雖然未被嚴(yán)格證實(shí)能夠分泌或者降解信號分子，但是其對生物膜的形成亦有重大貢獻(xiàn)，相對豐度隨著SRT 的延長急劇下降。結(jié)合圖5 可知反應(yīng)器內(nèi)部檢測到的QS 菌總體相對豐度在SRT=20 d 時達(dá)到最低值5.6%，繼續(xù)延長SRT 至30 d 時恢復(fù)到13.09%，但也低于同工況下QQ 菌的相對豐度（22.64%），同時，其與QQ 菌的序列數(shù)比也從0.707 降到0.579。這表明SRT 的延長雖然能同時促進(jìn)QQ 菌和QS 菌的富集，但對于QQ菌的富集更具優(yōu)勢，因此可以認(rèn)為延長SRT 有利于緩解膜污染。

圖4 不同SRT 下群體感應(yīng)相關(guān)菌群的相對豐度分布Fig.4 Relative abundances of quorum sensing related bacteria under different SRT

圖5 不同SRT 下QQ 菌、QS 菌、QQ＆QS 菌的相對豐度分布及序列數(shù)Fig.5 Relative abundances and numbers of QQ bacteria，QS bacteria，QQ＆QS bacteria under different SRT

圖4（c）給出了同時具有分泌和降解信號分子作用的菌群及其相對豐度的變化。由圖4（c）可知，在HMBR 反應(yīng)器內(nèi)Thiothrix（發(fā)硫菌屬）占據(jù)QQ＆QS 菌的絕對優(yōu)勢，其相對豐度的變化決定了QQ＆QS 菌的多寡。Thiothrix相對豐度在SRT=20 d 時達(dá)到了峰值14.76%，此時，其序列數(shù)為61 388，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A、C 工況下的值，可知SRT 對QQ＆QS 菌的數(shù)量亦能夠產(chǎn)生顯著影響。

對圖5 作進(jìn)一步分析可知，QQ 菌和QS 菌的相對豐度及序列數(shù)均隨著SRT 的延長先降低后增加，但QQ 菌的相對豐度始終高于QS 菌的相對豐度，特別是SRT=30 d 時二者的差值高達(dá)9.5%，QQ 菌與QS菌的序列數(shù)差值在SRT 為20 d 時最大，為32 134。因此，可以得知在HMBR 中，SRT 對這3 類細(xì)菌均能夠產(chǎn)生顯著影響，且在較長的SRT 下，QQ 菌的相對優(yōu)勢更加明顯。

2.3 HMBR 中信號分子濃度對SRT 的響應(yīng)機(jī)制

對各工況下處于穩(wěn)定運(yùn)行的HMBR 中的信號分子質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，結(jié)果見圖6。

圖6 不同SRT 下HMBR 中信號分子的濃度Fig.6 Concentrations of signal molecules in HMBR under different SRT

由圖6 可知，各工況下反應(yīng)器中僅檢測到C4-HSL、C6-HSL 和C8-HSL 這3 種短鏈信號分子，而長鏈信號分子由于比較容易被活性污泥降解，在HMBR 內(nèi)未被檢出。這3 種信號分子中，C4-HSL 和C8-HSL 2 種信號分子的質(zhì)量濃度明顯低于C6-HSL的質(zhì)量濃度，C8-HSL 信號分子質(zhì)量濃度最低，而且C4-HSL 和C8-HSL 濃度均呈現(xiàn)隨著SRT 的延長逐漸降低的趨勢，與QQ 菌相對豐度的變化規(guī)律一致；而C6-HSL 則隨SRT 的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與QQ＆QS 菌變化規(guī)律一致。因此可以認(rèn)為，SRT 可以顯著影響HMBR 反應(yīng)器內(nèi)QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS 菌的群落結(jié)構(gòu)，以此促進(jìn)對C8-HSL 的降解，進(jìn)而減緩生物膜的形成，最終達(dá)到控制膜污染、延長膜組件運(yùn)行周期的目的。

3 結(jié)論

本研究對比分析了SRT 分別為10、20、30 d 條件下HMBR 對某高校學(xué)生宿舍區(qū)生活污水的處理效果，并探究了SRT 對群體感應(yīng)相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)以及信號分子濃度的影響，得出以下結(jié)論：

（1）當(dāng)SRT 分別為10、20、30 d 時，HMBR 均具有良好的污染物去除能力，且在SRT=30 d 的條件下HMBR 運(yùn)行效果最佳。

（2）SRT 不僅影響污染物的去除效果，也能顯著影響膜組件的運(yùn)行周期，在研究范圍內(nèi)，較長SRT（30 d）工況下膜組件更替周期較長，具有更優(yōu)良的操作潛力。

（3）SRT 能夠顯著影響QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS菌的相對豐度，從而調(diào)控HMBR 系統(tǒng)內(nèi)部信號分子的濃度，特別是較長的SRT 條件下，系統(tǒng)菌群能夠有效降解C8-HSL 信號分子，進(jìn)而降低生物膜的形成速率，通過非殺菌機(jī)制有效控制膜污染。