陳水齡，李欣，褚文麗，陶方方，周雅琪，李維義，亢澤峰

脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是多種眼底疾病的最終病理表現(xiàn)，如年齡相關(guān)性黃斑病變（age-related macular degeneration，AMD）、病理性近視（pathological myopia，PM）、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變（central exudative choroidal retinopathy，CEC）及組織胞漿菌病等。CNV 的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，通常認(rèn)為與衰老、遺傳、環(huán)境、視網(wǎng)膜慢性光損傷、營(yíng)養(yǎng)、代謝障礙及炎癥等有關(guān)。建立成模率高、重復(fù)性好、成本低的CNV 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)于深入研究CNV 的發(fā)病機(jī)制、病理改變及臨床治療等具有重要意義。本文擬從CNV 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、CNV 動(dòng)物模型的建立方法及評(píng)價(jià)方法等方面進(jìn)行總結(jié)和梳理，為CNV 的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

用于CNV 模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有鼠、猴、兔、豬、羊和貓等，其中較為常見的有挪威棕色（brown norway，BN）大鼠、C57BL小鼠、恒河猴及兔。

BN 大鼠的脈絡(luò)膜組織與人脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)相似[1]，含有大量的色素細(xì)胞，可吸收大量光能量。C57BL小鼠脈絡(luò)膜組織與人的脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)相似[2-3]，有單層立方色素上皮細(xì)胞[4]。BN大鼠和C57BL 小鼠取材方便，存活率高，成熟周期短，成本較低，因此，成為CNV 造模的主要?jiǎng)游飦碓?。但鼠類眼球較小，對(duì)于激光操作難度增加；此外，鼠與人還存在黃斑解剖學(xué)上的差異。

猴CNV模型與人類CNV的改變非常類似[5]，此模型得到了一致的認(rèn)可，但動(dòng)物來源受限，費(fèi)用較高，CNV誘發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)，限制了其廣泛應(yīng)用。兔CNV 模型可見少量報(bào)道[6-7]，因兔CNV 模型在眼底熒光血管造影（fundus fluorescein angiograph,FFA）中不具有熒光素滲漏的特征，且兔眼底血管循環(huán)結(jié)構(gòu)與人類差異較大，目前很少應(yīng)用。羊CNV 模型報(bào)道較少[8]，但羊習(xí)性溫順，實(shí)驗(yàn)眼便于觀察，且羊眼實(shí)驗(yàn)不影響肉用羊的經(jīng)濟(jì)效果，作為大型動(dòng)物模型制備容易，費(fèi)用低，操作難度小，有望成為CNV模型的常用大型動(dòng)物。

2 CNV動(dòng)物模型的建模方法

目前，建立動(dòng)物CNV 模型的方法主要有：激光誘導(dǎo)[9]、視網(wǎng)膜下注射生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)[10-11]、視網(wǎng)膜下注射基質(zhì)膠[12]、手術(shù)及基因工程誘導(dǎo)[13]等，其中激光誘導(dǎo)的CNV模型應(yīng)用最為廣泛。

2.1 激光誘導(dǎo)

激光誘導(dǎo)CNV 模型的主要機(jī)制為選擇性破壞光感受器外節(jié)、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細(xì)胞、Bruch 膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管。其中Bruch 膜的破壞在CNV 的生成中至關(guān)重要，損傷后引發(fā)損傷修復(fù)反應(yīng)，包括損傷區(qū)早期細(xì)胞浸潤(rùn)，繼而形成新生血管等。

2.1.1 激光種類及參數(shù)的選擇 用于CNV 模型制作的激光器包括半導(dǎo)體激光、氬激光、氪激光、染科激光及倍頻激光等。激光參數(shù)主要有激光波長(zhǎng)、光斑直徑、輸出功率及曝光時(shí)間等方面，實(shí)驗(yàn)操作中以光凝處產(chǎn)生氣泡伴輕微爆破聲作為擊穿Bruch 膜的標(biāo)志，若出血或無氣泡出現(xiàn)則視為無效。因此，激光各參數(shù)的選擇對(duì)于成功誘導(dǎo)CNV 模型尤為關(guān)鍵，常見的參數(shù)特征如表所示（表1）。

表1 常見的激光誘導(dǎo)CNV動(dòng)物模型的參數(shù)特征

2.1.2 激光誘導(dǎo)的動(dòng)物CNV 與人類CNV 的異同（1）激光誘導(dǎo)的動(dòng)物CNV 與人類CNV 有許多共同之處，如CNV 中血管內(nèi)皮細(xì)胞主要源于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管，病理基礎(chǔ)相同，即Bruch 膜-RPE-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體損傷，導(dǎo)致促血管生成因子與血管生成抑制因子間平衡的破壞，使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增生、移行和管腔形成等一系列新生血管形成。（2）激光誘導(dǎo)的CNV 模型與人類CNV 的發(fā)病機(jī)制存在差異，前者采用激光擊穿Bruch 膜及RPE 層的方法，誘導(dǎo)脈絡(luò)膜毛細(xì)血管生長(zhǎng)于RPE 層下或神經(jīng)纖維層下，伴有視網(wǎng)膜損傷，屬于機(jī)械性破壞；后者為各種原因?qū)е碌腞PE-Bruch 膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體損傷，使Bruch 膜內(nèi)膠原層增厚以及彈力纖維層斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致脈絡(luò)膜毛細(xì)血管長(zhǎng)入RPE 層下或感覺神經(jīng)纖維層下，與蛋白水解酶表達(dá)水平的改變?nèi)缁|(zhì)金屬蛋白酶抑制因子的低表達(dá)或基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的過度表達(dá)，以及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞有關(guān)。

2.1.3 激光誘導(dǎo)CNV的優(yōu)點(diǎn)

激光誘導(dǎo)的CNV 動(dòng)物模型發(fā)生率較高，大約為60%～70%，在光凝后短期時(shí)間（7 d）內(nèi)即可產(chǎn)生，而且激光斑的熒光素滲漏在10～14 d 達(dá)到高峰，便于進(jìn)行干預(yù)性研究；誘導(dǎo)CNV 的條件也可標(biāo)準(zhǔn)化，價(jià)格相對(duì)便宜，是目前眼科誘導(dǎo)CNV最常用的動(dòng)物模型。

2.2 生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)

生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的CNV動(dòng)物模型[47]，如視網(wǎng)膜下注射載有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的腺相關(guān)病毒載體、重組VEGF 明膠微粒誘導(dǎo)CNV 模型、視網(wǎng)膜下注射堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）凝膠微粒誘導(dǎo)兔CNV 模型、視網(wǎng)膜下注射bFGF/脂多糖誘導(dǎo)兔CNV 模型、脈絡(luò)膜上腔植入bFGF 微滲透泵誘導(dǎo)豬CNV模型等。

2.3 基質(zhì)膠誘導(dǎo)

基質(zhì)膠是一種注入體內(nèi)后能轉(zhuǎn)化為固體并緩慢釋放血管生成因子的蛋白混合物?；|(zhì)膠單獨(dú)注射或聯(lián)合VEGF注射，可以產(chǎn)生100%的CNV 病變，并能成功模擬出人類滲出性AMD 中參與新生血管反應(yīng)的相似細(xì)胞組分。正常SD大鼠視網(wǎng)膜下注射基質(zhì)膠后，可觀察到RPE 層的易位和CNV的形成[48]。

2.4 轉(zhuǎn)基因或基因敲除誘導(dǎo)

轉(zhuǎn)基因和基因敲除建立CNV 模型是一種新興技術(shù)，針對(duì)CNV 發(fā)展的關(guān)鍵因素建立基因工程模型，可從不同角度分析各分子對(duì)CNV 形成的影響，包括：（1）VEGF164RPE65轉(zhuǎn)基因小鼠[49]；（2）雙倍體（Tet/VMD2/VEGF）和三倍體（Tet/VMD2/VEGF/An2）轉(zhuǎn)基因小鼠，視網(wǎng)膜可高表達(dá)VEGF，若同時(shí)視網(wǎng)膜下注射血管生成素2（angiogenin 2，Ang 2），能夠100%形成CNV[50]；（3）趨化因子CC 類受體2（chemokine CC motif receptor 2，CCR2）/趨化因子CC 類配體2（chemokine CC motif ligand 2，CCL2）基因缺失誘導(dǎo)小鼠CNV 模型[51]，其成模率大約25%；（4）載脂蛋白E 基因（apolipoprotein E，ApoE）過表達(dá)小鼠CNV 模型是研究AMD 病變中自發(fā)性CNV形成機(jī)制的重要模型[52]；（5）CCL2 和CX3C 趨化因子受體1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1）基因缺陷小鼠；（6）超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）基因缺陷老化小鼠[53]；（7）極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）定向突變小鼠；（8）視紫紅質(zhì)基因啟動(dòng)子/VEGF過表達(dá)小鼠。

轉(zhuǎn)基因或基因敲除誘導(dǎo)的CNV 模型具有誘導(dǎo)快，發(fā)生時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，與CNV 病理生理學(xué)關(guān)聯(lián)性強(qiáng)，對(duì)CNV 發(fā)生機(jī)制的研究具有針對(duì)性，同時(shí)研究者可根據(jù)不同需求選擇模型并修改參數(shù)；缺點(diǎn)有CNV誘導(dǎo)率低、面積小、價(jià)格貴等問題。

2.5 手術(shù)誘導(dǎo)

采用手術(shù)清除RPE 層后再機(jī)械性破壞Bruch 膜可造成CNV，與人類CNV 類似。如應(yīng)用硅膠鑲管剝離視網(wǎng)膜色素上皮建立CNV 模型，后來研究發(fā)現(xiàn)不剝離視網(wǎng)膜色素上皮而直接穿通Bruch 膜誘導(dǎo)的CNV 模型，具有更厚的薄膜、更多的新生血管，并且FFA 滲漏增加，重復(fù)性更高[54]。雖然手術(shù)誘導(dǎo)的CNV 模型具有神經(jīng)視網(wǎng)膜損害少的優(yōu)點(diǎn)，但成本高，同時(shí)受手術(shù)操作的熟練程度的限制。

2.6 其他方法

應(yīng)用強(qiáng)化循環(huán)光誘導(dǎo)CNV 大鼠模型[55]，將12 周齡SD 大鼠和Wistar大鼠每日暴露于36瓦熒光燈泡發(fā)出3,000 Lux的冷白光12 h（正常組循環(huán)光強(qiáng)為70 Lux），持續(xù)6個(gè)月，在強(qiáng)化光照1 個(gè)月即可出現(xiàn)CNV，在6 個(gè)月時(shí)CNV 和視網(wǎng)膜血管交聯(lián)，形成新生血管網(wǎng)。此外，還有利用Xenon 燈光凝家豬視網(wǎng)膜誘導(dǎo)CNV 形成、丙烯醛灌胃誘導(dǎo)大鼠CNV 形成[56]等造模方法。

3 CNV動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)方法

觀察和評(píng)價(jià)CNV 的方法主要有活體影像學(xué)檢查和組織樣本病理學(xué)檢查?；铙w的影像學(xué)檢查有FFA、吲哚菁綠血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）及光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）觀察等；組織樣本的病理學(xué)檢查主要有蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、免疫組織化學(xué)染色及脈絡(luò)膜鋪片等。

3.1 FFA和ICGA

FFA 和ICGA 可動(dòng)態(tài)觀察CNV 的形成過程，是較為快速和簡(jiǎn)便的觀察方法。新生血管在FFA 造影早期出現(xiàn)熒光，F(xiàn)FA 晚期光凝區(qū)圓盤狀熒光素滲漏，根據(jù)熒光素滲漏程度可判斷CNV 形成的程度[57]。但應(yīng)注意的是FFA 上的熒光素滲漏與真正的血管滲漏之間的關(guān)系還不清楚，只能作為間接反映CNV 滲漏的指標(biāo)，F(xiàn)FA 熒光素滲漏不一定都有CNV 形成。吲哚菁綠是大分子物質(zhì)，可滲透進(jìn)入脈絡(luò)膜血管，但不能穿透RPE層視網(wǎng)膜血管滲漏，因此，ICGA呈現(xiàn)充盈狀態(tài)的光凝斑一定有CNV 形成，ICGA 能更清晰地顯示CNV 的輪廓，但熒光效應(yīng)弱，為熒光素鈉的1/25，顯示的圖像不如FFA 清晰。FFA 與ICGA 聯(lián)合應(yīng)用，可提高CNV 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，排除非CNV原因所導(dǎo)致的高熒光結(jié)果。

3.2 OCT

OCT利用光干涉原理可清晰地觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確地顯示眼底病變的深淺位置及黃斑區(qū)厚度，對(duì)視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管的診斷具有重要價(jià)值，且為無創(chuàng)性檢查。但是由于CNV 實(shí)驗(yàn)?zāi)壳按蠖嗖捎檬笞鳛閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，鼠眼較小，缺乏配套的機(jī)器，故還未普遍用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CNV的觀察。

3.3 HE染色

組織切片HE 染色后，可利用光鏡及電鏡大體觀察實(shí)驗(yàn)性CNV 的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)變化、CNV 周圍的細(xì)胞構(gòu)成，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，實(shí)驗(yàn)廣泛采用。

3.4 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色采用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織內(nèi)抗原的分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測(cè)，檢測(cè)相應(yīng)的目的抗原，并進(jìn)行定位、定性和定量分析；免疫組織化學(xué)檢查可半定量觀察CNV 組織的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果更具有客觀性。如采用免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記CNV 組織中內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)作為CNV生成的標(biāo)志[58]。

3.5 脈絡(luò)膜血管鋪片

脈絡(luò)膜血管鋪片利用了熒光素標(biāo)記的大分子右旋糖酐，它具有標(biāo)記血管容積的特性，從而標(biāo)記CNV。此方法可較好保持CNV 的固有形態(tài)，CNV 呈現(xiàn)的強(qiáng)熒光區(qū)與周圍組織對(duì)比強(qiáng)烈，易于觀察，且通過計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量強(qiáng)熒光區(qū)域，能夠客觀地對(duì)CNV進(jìn)行半定量分析[59]。

4 小結(jié)

目前實(shí)驗(yàn)性CNV 動(dòng)物模型的理論基礎(chǔ)主要建立于擊破Bruch 膜或產(chǎn)生過量的VEGF，建模方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。在眾多建立CNV 模型的方法中，激光誘導(dǎo)CNV 模型條件較成熟，研究歷史久，可靠性高，應(yīng)用廣泛。由于動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境不同于人體內(nèi)環(huán)境，各種方法誘導(dǎo)的CNV 動(dòng)物模型也僅能模擬人類CNV，不能完全代替人類CNV 發(fā)展的自然過程，因此，研究結(jié)果僅能為CNV發(fā)病和機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。