李健，毛可欣，王海榮，安淼，劉光柱，李國(guó)田

摘要：【目的】獼猴桃作為富含維生素的“水果之王”深受群眾喜愛(ài)，但近年來(lái)多地發(fā)生凍害情況，給獼猴桃生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，該研究針對(duì)獼猴桃凍害、生理指標(biāo)、基因表達(dá)進(jìn)行了分析，以便為獼猴桃抗寒性研究提供理論基礎(chǔ)。【方法】對(duì)4年生‘泰山1號(hào)‘ 徐香等10個(gè)獼猴桃品種，于2月17日觀察凍傷切面，于2021年3月15日和2021年3月25日，隨機(jī)選取一個(gè)品種的3個(gè)植株，每個(gè)植株隨機(jī)選取兩個(gè)枝條，統(tǒng)計(jì)萌芽率。同時(shí)對(duì)生理指標(biāo)丙二醛、可溶性糖、脯氨酸、電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶（SOD）進(jìn)行了測(cè)定?！窘Y(jié)果】通過(guò)試驗(yàn)，從分子、表觀層面分析了不同獼猴桃品種間抗寒性的差異，發(fā)現(xiàn)軟棗、中華系獼猴桃抗寒性強(qiáng)于美味系獼猴桃，得到了適于山東泰山地區(qū)生產(chǎn)的‘泰山1號(hào)‘臍紅‘金紅50和‘龍成2號(hào)獼猴桃品種，部分美味系獼猴桃抗寒性太差，不適合山東地區(qū)種植。該研究可以通過(guò)生理指標(biāo)、基因表達(dá)情況選擇更為抗寒的獼猴桃品種，可以開(kāi)發(fā)抗寒性分子標(biāo)記，以快速篩選抗寒品種。

關(guān)鍵詞：山東泰山;獼猴桃;抗寒性分析

文章編號(hào)：2096-8108（2022）02-0021-06中圖分類號(hào)：S663.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Investigation and Analysis of Cold Resistance among Kiwifruit Cultivars in Taishan Area， Shandong Province

LI Jian1， MAO Kexin1，2， WANG Hairong1， AN Miao1， LIU Guangzhu3，LI Guotian1*

（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2.Shandong Agricultural University， Taian 271000，China;

3.Feicheng Peach Industry Development Center，F(xiàn)eicheng 271600，China）

Abstract：【Objective】 Kiwifruit， as the ‘king of fruits， which is rich in vitamins， is loved by the consumers. But in recent years， many reports have been reported about the freezing injury， which has brought great losses to kiwifruit yield. In order to provide theoretical basis for research on cold resistance of Kiwifruit， this study analyzed freezing injury， physiological indexes and gene expression of Kiwifruit.【Method】 Ten kiwifruit varieties， including four-year-old taishan No.1 and Xuxiang， were randomly selected on March 15， 2021 and March 25， 2021 to observe the frostbite section on February 17. Three plants of a variety were randomly selected on March 15， 2021 and two branches of each plant were randomly selected to count the germination rate. At the same time， the physiological indexes malondialdehyde， soluble sugar， proline， electrical conductivity and superoxide dismutase （SOD） were determined.【Results】The differences in cold resistance between different kiwifruit cultivars were analyzed from molecular and apparent levels. It was found that the cold resistance of Actinidia arguta and Actinidia chinensis was stronger than that of Actinidia deliciosa. The kiwifruit cultivars ‘Taishan 1， ‘Qihong， ‘Jinhong 50 and ‘Longcheng 2 suitable for growing in Taishan area of Shandong Province， part of the delicious department of kiwi cold resistance is too poor， not suitable for shandong planting.This study can select more cold-resistant kiwifruit varieties through physiological indicators and gene expression， and develop cold-resistant molecular markers to quickly screen cold-resistant varieties.

Keywords：Taishan area of Shandong; kiwifruit; cold resistance analysis

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.）富含維生素C，被譽(yù)為“水果之王”，屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）藤本植物。原產(chǎn)于中國(guó)，主要分布于N20°至N50°[1]，我國(guó)獼猴桃自然資源豐富，種植廣泛，深受群眾喜愛(ài)。影響獼猴桃產(chǎn)量的因素主要有氣候、病蟲(chóng)害、水肥條件等，其中凍害及早晚霜對(duì)獼猴桃生長(zhǎng)帶來(lái)嚴(yán)峻考驗(yàn)。此外，獼猴桃種間抗寒性參差不齊，同一品種在不同氣候、栽培條件下其抗寒能力也存在差異[2]，加之盲目引種、管理不當(dāng)，南種北引往往造成嚴(yán)重?fù)p失。其中美味、中華獼猴桃兩個(gè)主栽種主要分布在黃河以南，耐寒性較差，最低耐受-10 ℃左右[3]。隨著近年來(lái)極端低溫天氣的增多，全國(guó)每年都有大批獼猴桃種植區(qū)遭受凍害，僅陜西省寶雞市在1991-2016年間的凍害面積就達(dá)3.57萬(wàn)hm2[4]。

凍害發(fā)生在早春可以使幼葉、芽、花蕾發(fā)生壞死；凍害發(fā)生在深秋可以造成樹(shù)干及新枝凍傷，降低植株休眠時(shí)對(duì)低溫的耐受力；凍害發(fā)生于冬季能使枝干斷裂、休眠芽?jī)鰝罱K導(dǎo)致其無(wú)法正常萌發(fā)[5]，凍害不僅對(duì)獼猴桃正常生長(zhǎng)造成影響，還會(huì)造成減產(chǎn)，甚至大面積死亡。2021年1月上旬遭遇了近-20 ℃極端低溫天氣，本研究以山東省果樹(shù)研究所泰東試驗(yàn)基地‘泰山1號(hào)‘徐香等北方主栽品種為材料，于2020年11月-2021年4月取材試驗(yàn)和調(diào)查，對(duì)獼猴桃凍害、生理指標(biāo)、基因表達(dá)進(jìn)行了分析，為獼猴桃抗寒性研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試植株為4年生‘泰山1號(hào)‘徐香等共10個(gè)獼猴桃品種，位于山東省果樹(shù)研究所泰東科研基地，東經(jīng)116°20′～117°59′、北緯35°38′～36°28′，年平均降水量697 mm，屬溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，土壤為中性偏酸沙壤土，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)19～43 mg/kg，磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)21～34 mg/kg，鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)32～68 mg/kg。轉(zhuǎn)錄組與生理指標(biāo)測(cè)定為‘泰山1號(hào)‘徐香‘臍紅‘龍成2號(hào)4個(gè)品種，直徑為0.5～0.8 cm的1年生新枝作為樣本，2020年11月15日至2021年4月15日共取6次。

1.2試驗(yàn)方法

極端低溫出現(xiàn)于2021年1月6日-7日，凍傷切面觀察于2月17日。萌芽率統(tǒng)計(jì)于2021年3月15日和2021年3月25日，隨機(jī)選取一個(gè)品種的3個(gè)植株，每個(gè)植株隨機(jī)選取兩個(gè)枝條。萌芽率=萌發(fā)芽數(shù)/總數(shù)×100%。

生理指標(biāo)測(cè)定：將取得的枝條液氮速凍后用磨樣機(jī)磨成粉末，按0.1 g分裝到不同離心管。丙二醛測(cè)定使用TCA法、可溶性糖測(cè)定使用蒽酮法、脯氨酸測(cè)定使用茚三酮法。電導(dǎo)率測(cè)定使用雷磁公司的DDS-307型電導(dǎo)率儀。超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定使用格銳思生物公司的WST法試劑盒，貨號(hào)G0101F。

基因表達(dá)熱圖數(shù)據(jù)來(lái)源于美吉生物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，合同編號(hào)：MJ20201116080。

2結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)地氣溫變化

由試驗(yàn)地氣溫趨勢(shì)圖（見(jiàn)圖1）可以發(fā)現(xiàn)，11月下旬溫度急劇下降，1月6日最低氣溫達(dá)到最低峰-19 ℃，1月7日最高氣溫達(dá)到最低峰-8 ℃，隨后氣溫逐漸升高。采樣時(shí)的日期溫度分別為7～19 ℃、-10～2 ℃、-8～7 ℃、-2～8 ℃、4-16 ℃、7～19 ℃，其中1月15日所取樣品為經(jīng)歷極端低溫后的枝條。

2.2獼猴桃不同品種生理指標(biāo)測(cè)定

通過(guò)對(duì)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)枝條生理指標(biāo)丙二醛、相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖、脯氨酸和SOD酶活的測(cè)定（見(jiàn)圖2），丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1月15-2月15日到達(dá)頂峰隨后下降，相對(duì)電導(dǎo)率總體呈上升趨勢(shì)?？扇苄蕴呛烤徛仙?月15日，隨后一直下降，降至峰值的0.3～0.4，脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3月15日達(dá)到頂峰，隨后下降。SOD酶活在11月15日-1月15日和3月15日-4月15日兩個(gè)時(shí)段內(nèi)都有升高趨勢(shì)?？梢钥闯?，在寒冷的氣溫下，獼猴桃膜損傷程度（丙二醛、相對(duì)電導(dǎo)率）上升，隨著溫度回暖膜損傷程度下降；另外，像可溶性糖、脯氨酸等抗凍性內(nèi)溶物在低溫下含量也有一定升高；過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，在低溫脅迫后SOD酶活升高，提高抗逆性。由不同生理指標(biāo)結(jié)果可以看出，‘泰山1號(hào)與‘龍成2號(hào)抗寒能力最強(qiáng)，其次為‘臍紅，抗寒性最差的是‘徐香。

2.3獼猴桃不同品種抗寒相關(guān)基因表達(dá)分析

對(duì)試驗(yàn)基地內(nèi)4個(gè)獼猴桃品種枝條進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，選取了26個(gè)植物抗寒相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)熱圖繪制（見(jiàn)圖3），1-6列分別表示2020年11月-2021年4月。基因的表達(dá)模式在4個(gè)品種內(nèi)基本一致，其中抗寒基因HT1-2、HT1-3在12月、1月低溫脅迫下表達(dá)量提高，而轉(zhuǎn)錄因子CBF5、CBF6在降溫過(guò)程中表達(dá)量有所下降，這與其低溫下過(guò)多結(jié)合冷誘導(dǎo)基因COR有關(guān)。植物抗氧化系統(tǒng)中SOD2、SOD3、CAT、POD等基因在降溫過(guò)程中表達(dá)量上升，溫度回升后其表達(dá)量隨之下降。乙烯應(yīng)答元件組合蛋白AP2/ERF、參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的PYL9在氣溫降低后表達(dá)量迅速提高，最高可達(dá)12.85倍。個(gè)別基因的表達(dá)模式在不同品種間有差異，調(diào)控維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)的AsA基因在‘泰山1號(hào)‘徐香中低溫下表達(dá)量升高，在‘臍紅中變化較小，而在‘龍成2號(hào)中有降低的趨勢(shì)；MYB44基因在低溫下表達(dá)量提高，而在‘龍成2號(hào)中未檢測(cè)到其表達(dá)，推測(cè)這與品種差異有關(guān)，‘龍成2號(hào)屬于軟棗獼猴桃，較中華、美味獼猴桃差異更大。

2.4極端低溫下獼猴桃不同品種凍害調(diào)查分析由于試驗(yàn)地區(qū)1月6日左右遭遇了-19 ℃極寒溫度，造成了獼猴桃不同程度凍害，于2月中旬進(jìn)行了10個(gè)品種的凍害調(diào)查。用刀片切開(kāi)樹(shù)皮露出形成層進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖4），‘徐香獼猴桃凍害最為嚴(yán)重，下部形成層發(fā)黑褐色，‘泰山1號(hào)和‘金桃受到輕微凍害，其余品種形成層呈現(xiàn)綠色。通過(guò)調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，獼猴桃形成凍害部位主要是離地20 cm以內(nèi)的下部，而地上中部則凍害較輕，頂部枝條受影響最小。

試驗(yàn)基地獼猴桃于2021年3月上旬開(kāi)始萌動(dòng)，3月15日和3月25日分別統(tǒng)計(jì)獼猴桃萌芽率，死亡率調(diào)查于4月30日（見(jiàn)表1）。由結(jié)果可以看出，3月25日較15日萌芽率不同，正常條件下萌芽率應(yīng)升高，但‘農(nóng)大金獼‘米良1號(hào)‘金桃等品種萌芽率下降幅度較大，這與植株受凍傷有關(guān)，導(dǎo)致上部枝條供水供養(yǎng)不足?！煜銉龊ψ顬閲?yán)重，萌芽率只有21.67%，而死亡率卻高達(dá)63.64%，‘金魁凍害情況次之，這兩個(gè)品種都屬于美味系獼猴桃?？箖瞿芰^好的品種為‘泰山1號(hào)‘臍紅‘金紅50和‘龍成2號(hào)，此為中華系和軟棗獼猴桃，適于山東泰山地區(qū)種植。

3討論

從研究結(jié)果不難看出，獼猴桃品種間抗寒性存在明顯差異，總體來(lái)看軟棗、中華系獼猴桃抗寒能力高于美味系獼猴桃，但中華獼猴桃‘農(nóng)大金獼凍害比美味獼猴桃‘米良1號(hào)‘翠香嚴(yán)重。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以一定程度反映植物抗寒能力的強(qiáng)弱[6]。有研究表明，低淀粉高可溶性糖的軟棗獼猴桃抗寒能力高于其他軟棗獼猴桃[7]。本研究中，4個(gè)品種可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都在低溫凍害時(shí)上升，隨溫度回升后又下降，品種間差異不明顯，但受凍害時(shí)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)‘泰山1號(hào)>‘龍成2號(hào)>‘臍紅>‘徐香，確實(shí)反映了品種間抗寒能力。當(dāng)然，丙二醛、相對(duì)電導(dǎo)率、SOD也能一定程度反映膜損傷程度，低溫下植物SOD活性應(yīng)該是先上升后下降，其下降到一定程度O2-會(huì)降低[8-9]。

植物抗寒性受多基因共同調(diào)控，隨著植物抗寒性研究的不斷深入，抗寒基因被不斷地挖掘[10]。轉(zhuǎn)錄因子CBF是植物抗寒體系重要節(jié)點(diǎn)基因，可調(diào)節(jié)下游COR、BAM[11]基因，過(guò)表達(dá)CBF可使植株SOD活性提高低溫抗性增強(qiáng)，同時(shí)也能影響赤霉素、生長(zhǎng)素、脫落酸調(diào)節(jié)枝條休眠及落葉[12]。本研究中，CBF基因在氣溫降低過(guò)程中表達(dá)量有下降趨勢(shì)，與其結(jié)合并調(diào)控下游抗寒基因密不可分。獼猴桃抗氧化系統(tǒng)SOD2、SOD3、CAT、POD17、AsA等基因在降溫過(guò)程中表達(dá)量升高，與此同時(shí)生理指標(biāo)SOD酶活也升高，抗氧化系統(tǒng)有效降低植物O2-濃度，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性、增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性，保護(hù)植物體正常代謝[13]。植物生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF參與植物生長(zhǎng)發(fā)育各過(guò)程，最近許多研究表明植物ARF在環(huán)境脅迫響應(yīng)也有重要作用[14]，其可參與磷酸鹽脅迫[15]、鹽和干旱脅迫[16]等，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在冷脅迫下ARF7表達(dá)量下降，溫度回升后表達(dá)量提高。擴(kuò)展蛋白（expansin），是一類提高植物細(xì)胞壁韌性的細(xì)胞壁蛋白[17]，廣泛參與植物生長(zhǎng)各階段、多種逆境脅迫[18]，本研究中expansin LA1在低溫過(guò)程中表達(dá)量上升，提高了獼猴桃抗寒性。獼猴桃抗寒是一個(gè)由多基因共同調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，基因表達(dá)的研究有助于抗寒品種的分子篩選工作。

獼猴桃不同品種抗寒性確實(shí)存在差異，結(jié)果顯示，10個(gè)品種中抗寒性最弱的為‘徐香‘金魁‘農(nóng)大金獼，抗寒性最好的品種為‘泰山1號(hào)‘龍成2號(hào)‘金紅50和‘臍紅。相對(duì)而言，山東泰山地區(qū)軟棗、中華系獼猴桃的抗寒性要優(yōu)于美味系獼猴桃，這與2009年鄭州地區(qū)[19]、2016年泰山南麓[3]獼猴桃凍害調(diào)查結(jié)果相一致。雖然‘泰山1號(hào)中華獼猴桃抗寒性較強(qiáng)，但是今年在山東獼猴桃主產(chǎn)區(qū)淄博[20]卻損失慘重，淄博市有近2 000 hm2獼猴桃[21]，主栽品種‘泰山1號(hào)凍害嚴(yán)重，有的果園幾乎全部?jī)鏊?。分析其原因主要有以下幾點(diǎn)：2020年冬季的極端低溫，2021年初遭遇嚴(yán)重倒春寒，果園區(qū)塊不同引起冷氣聚集，地勢(shì)不同受風(fēng)力影響較大以及栽培管理設(shè)施有差別等。降低獼猴桃凍害損失需要一定措施，一是應(yīng)該選育和引進(jìn)抗寒品種；二是要規(guī)范化管理，水肥充足，注意排水，入冬前及時(shí)剪枝；三是由于獼猴桃凍害主要發(fā)生于離地10～20 cm處，在冬季可以進(jìn)行高培土、樹(shù)干刷白、捆扎稻草或秸稈；四是可以立擋風(fēng)墻，一定程度減少冷風(fēng)；五是在設(shè)施大棚中，防倒春寒可噴灑霧化水汽，防止晝夜溫差大可在白天及時(shí)通風(fēng)、夜間焚燒秸稈。

4結(jié)論

‘泰山1號(hào)‘臍紅‘金紅50和‘龍成2號(hào)等獼猴桃品種適宜山東泰山地區(qū)種植，部分美味系獼猴桃抗寒性太差，不適合山東地區(qū)種植。可以通過(guò)生理指標(biāo)、基因表達(dá)情況選擇更為抗寒的獼猴桃品種，可以開(kāi)發(fā)抗寒性分子標(biāo)記，以快速篩選抗寒品種。本研究為山東地區(qū)獼猴桃抗寒品種選育、獼猴桃抗寒性分子研究提供了一定理論基礎(chǔ)。

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