陳 思 王振宇 楊富國 彭紅軍 曹衛(wèi)樂
(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九九一醫(yī)院麻醉科,湖北省襄陽市 441000)
胃癌是起源于胃黏膜上皮常見的惡性腫瘤,是病死率較高的癌癥之一[1]。多種因素參與胃癌的發(fā)病機(jī)制,如吸煙、遺傳、地域和飲食結(jié)構(gòu)等因素[2]。多數(shù)胃癌患者就診時(shí)病情已經(jīng)處于中晚期,已錯(cuò)過手術(shù)治療的時(shí)機(jī),預(yù)后較差[3]。因此,尋找胃癌的保守治療方法至關(guān)重要。舒芬太尼是一種具有高選擇性的μ受體激動(dòng)劑,屬于阿片類藥物,具有鎮(zhèn)痛效果明顯、起效快等特點(diǎn),在臨床中常作為圍術(shù)期用藥及鎮(zhèn)痛藥物[4]。有研究結(jié)果顯示,阿片類藥物具有抑癌的作用[5]。例如,舒芬太尼能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞周期[6]。但是,舒芬太尼影響胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制尚未明確。目前已有研究表明Notch信號(hào)通路與胃癌的發(fā)展密切相關(guān)[7]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),蘿卜硫素能夠通過激活Notch受體(Notch receptor 1,NOTCH)1/Hes家族BHLH轉(zhuǎn)錄因子(Hes family BHLH transcription factor,HES)1信號(hào)通路來抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。本研究主要分析舒芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,并基于Notch信號(hào)通路初步探討其作用機(jī)制。
1.1 細(xì)胞和主要試劑 胃癌AGS細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;胎牛血清(批號(hào):SH30084)、RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào):SH30027)購自美國HyClone公司;青霉素與鏈霉素雙抗(批號(hào):15140)購自美國Gibco公司;舒芬太尼(批號(hào):SH601879)購自湖北人福醫(yī)藥集團(tuán)股份公司;MTT試劑盒(批號(hào):GM01-500T)購自上海歌凡生物科技有限公司;凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):KGA101)購自江蘇凱基生物公司;增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體(批號(hào):2586)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(批號(hào):15071)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體(批號(hào):89477)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2抗體(批號(hào):40994)、NOTCH1抗體(批號(hào):3608)和GAPDH抗體(批號(hào):5174)購自美國CST公司;MMP14抗體(批號(hào):ab51074)、HES5抗體(批號(hào):ab194111)購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記二抗羊抗鼠IgG抗體(批號(hào):ZB-2305)購自北京中杉金橋公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(批號(hào):PC0020)、電化學(xué)發(fā)光液(批號(hào):PE0010)、TBST(批號(hào):T1085)購自北京索萊寶公司;Transwell小室(批號(hào):3412)購自美國Corning公司;Matrigel基質(zhì)膠(批號(hào):356234)購自美國BD公司;Binding buffer(批號(hào):200-070-505)購自上海恒斐生物科技有限公司;RIPA裂解液(批號(hào):DXT-979006)購自上??泼羯锟萍加邢薰?;脫脂奶粉(批號(hào):A1789)購自北京康瑞納生物科技有限公司。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 從液氮罐內(nèi)取出冷凍的胃癌AGS細(xì)胞,常規(guī)復(fù)蘇后置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,4 ℃ 1 000 r/min離心5 min后除去上清液,接種在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),并放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài),待細(xì)胞貼壁生長且融合度為75%~85%時(shí),加入1 mL 0.25%胰酶消化并傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞,接種至24孔板內(nèi)(5×103個(gè)/mL),然后選取含舒芬太尼(終濃度為0 nmol/L、5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基處理胃癌AGS細(xì)胞并培養(yǎng)48 h。
1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 取胃癌細(xì)胞,接種在96孔細(xì)胞板內(nèi),每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞,每孔200 μL,按1.2的方法進(jìn)行分組和藥物干預(yù),置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后取出細(xì)胞,加入20 μL的MTT試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)基后每孔加入150 μL的二甲基亞砜。應(yīng)用Multiskan SkyHigh型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)各孔在570 nm處的吸光度值,用于計(jì)算細(xì)胞活力,細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取上述1.2中干預(yù)后的各組胃癌細(xì)胞,采用PBS清洗2次,用1×Binding buffer重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞密度調(diào)至1×106個(gè)/mL。按照凋亡試劑盒說明書,取100 μL的細(xì)胞懸液,先加10 μL的Annexin Ⅴ混勻,再加5 μL碘化丙啶染液充分混勻,避光反應(yīng)15 min,在Attune NxT型流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技公司)上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.5 Western blot檢測(cè)PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP14、NOTCH1和HES5的蛋白表達(dá) 取上述1.2中干預(yù)后的各組胃癌細(xì)胞,采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞的總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。在沸水中反應(yīng)5 min后,將蛋白變性,取45 μg蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVEF膜,5%脫脂奶粉封閉膜2 h,分別加入一抗,分別為PCNA抗體(1 ∶500)、Bax抗體(1 ∶500)、Bcl-2抗體(1 ∶500)、MMP2抗體(1 ∶600)、MMP14抗體(1 ∶600)、NOTCH1抗體(1 ∶600)、HES5抗體(1 ∶600)和GAPDH抗體(1 ∶1 500),4 ℃孵育過夜;使用TBST洗膜3次,5 min/次,加入HRP標(biāo)記二抗羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000),37 ℃下孵育2 h,TBST洗膜3次,5 min/次。將電化學(xué)發(fā)光液(比例1 ∶1)加入膜內(nèi)顯影。以GAPDH作為內(nèi)參,采用凝膠成像系統(tǒng)及Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 (1)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):取上述1.2中干預(yù)后的各組胃癌細(xì)胞,并采用不含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL,在孔徑為8.0 μm的Transwell小室的上室內(nèi)加入100 μL不含血清的細(xì)胞懸液,下室添加500 μL含有10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,取出Transwell小室擦掉未穿過膜的細(xì)胞,采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min后采用1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞10 min。選取視野明亮的區(qū)域置于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)目。(2)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,將Matrigel基質(zhì)膠按3 ∶1比例稀釋,取100 μL的稀釋Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室內(nèi),在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h,其余實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 不同濃度的舒芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與未使用舒芬太尼(0 nmol/L)作用相比,不同濃度的舒芬太尼(5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L)作用后,胃癌細(xì)胞活力、PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平增加(均P<0.05);隨著舒芬太尼濃度的增加,胃癌細(xì)胞活力、PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低,細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平逐漸增加(均P<0.05)。見表1和圖1。
表1 不同濃度舒芬太尼作用下胃癌細(xì)胞活力、凋亡率及相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)
2.2 不同濃度的舒芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與未使用舒芬太尼(0 nmol/L)作用相比,50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼作用后遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目減少,且5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L舒芬太尼干預(yù)后遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目依次減少(均P<0.05);5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼作用后胃癌細(xì)胞的MMP2和MMP14蛋白表達(dá)水平均降低,且隨著舒芬太尼濃度的增加,MMP2和MMP14蛋白表達(dá)水平逐漸降低(均P<0.05)。見表2和圖2。
表2 不同濃度舒芬太尼作用下胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲情況及相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)
2.3 不同濃度的舒芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與未使用舒芬太尼(0 nmol/L)作用相比,不同濃度的舒芬太尼(5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L)作用后,胃癌細(xì)胞的NOTCH1和HES5蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05);隨著舒芬太尼濃度的增加,胃癌細(xì)胞的NOTCH1和HES5蛋白表達(dá)水平逐漸降低(均P<0.05)。見表3和圖3。
表3 不同濃度舒芬太尼作用后胃癌細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)
2020年,胃癌的新發(fā)病例數(shù)在全球癌癥中位居第五,死亡病例數(shù)在全球排名第四[9]。在我國,胃癌的發(fā)病率和病死率較高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命。舒芬太尼是苯哌啶衍生物,為強(qiáng)效麻醉鎮(zhèn)痛藥,其結(jié)構(gòu)和作用與芬太尼相似,具有鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)、毒性較低的優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于晚期癌癥患者的手術(shù)麻醉和術(shù)后鎮(zhèn)痛[10-11]。舒芬太尼在多種腫瘤中起到抑癌的作用:舒芬太尼能夠通過調(diào)控miR-495/Wnt/β-catenin軸抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[12-13];舒芬太尼能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,上調(diào)p53、Bax蛋白的表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)[14];舒芬太尼能夠使細(xì)胞周期停滯,抑制胃癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[15]。本研究采用濃度為0 nmol/L、5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼處理胃癌AGS細(xì)胞,結(jié)果顯示,舒芬太尼可以明顯地抑制細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,下調(diào)增殖相關(guān)蛋白PCNA、抗凋亡蛋白Bcl-2、侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP14的表達(dá),上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá),且上述作用呈濃度依賴性(均P<0.05)。這說明舒芬太尼在胃癌細(xì)胞中具有抑癌的作用。
Notch信號(hào)通路是一種高度保守的細(xì)胞信號(hào)通路,參與多種癌癥中的生物學(xué)效應(yīng),如細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移和侵襲等,在癌癥發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用[16]。目前Notch信號(hào)通路中已經(jīng)明確的配體有5個(gè)(包括DLL-1、DLL-3、DLL-4、Jag-1和Jag-2),與其相應(yīng)的受體有4個(gè),主要包括NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4,當(dāng)配體與受體結(jié)合后,可以啟動(dòng)下游Hes和Hey基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而發(fā)揮其在癌癥中的作用[17-18]。有研究結(jié)果顯示,在胃癌組織中NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4和Jag-2表達(dá)水平上調(diào),其中胃癌組織中NOTCH1蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁組織[19]。沉默環(huán)氧化酶2可通過抑制Notch信號(hào)通路來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[20]。趙恩昊等[21]的研究結(jié)果顯示,NOTCH1 mRNA和蛋白在胃癌細(xì)胞中高表達(dá),利用RNA干擾技術(shù)沉默NOTCH1可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究采用濃度為5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼處理胃癌AGS細(xì)胞后,胃癌細(xì)胞中NOTCH1和HES5蛋白表達(dá)下調(diào),呈濃度依賴性降低(均P<0.05),說明舒芬太尼可能通過調(diào)控Notch信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)揮抗胃癌的作用。
綜上所述,舒芬太尼能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制NOTCH1信號(hào)通路有關(guān),這或可為胃癌的研究提供新的思路和方向。今后,可通過開展過表達(dá)NOTCH1實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證舒芬太尼抗胃癌的作用機(jī)制。