彭家茵 鄧哲君 孟云超 羅文捷 趙 磊 張啟芳

(1 桂林醫(yī)學院研究生學院，廣西桂林市 541004； 2 廣西醫(yī)科大學研究生學院，廣西南寧市 530021；廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院3 消化內科，4 病理科，廣西桂林市 541002)

肝臟緊密連接是由蛋白復合物組成的連續(xù)屏障結構，其將細胞膜分為基底側和頂端側，可限制胞膜內的蛋白運動，并能維持細胞極性。此外，緊密連接可調節(jié)細胞間通透性，限制水和溶質自由通過細胞旁間隙，同時阻止細菌產物、病原體及過敏原等進入組織[1]。肝臟中的緊密連接沿著膽管或肝細胞間分布，以封閉細胞旁間隙，使膽汁在膽管中流動[2]。潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)患者常合并肝損傷[3]。實驗表明，葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)不僅可誘導大鼠出現(xiàn)結腸炎，而且還可使得其肝組織中的緊密連接蛋白表達發(fā)生改變[4-5]。卞晶晶等[6]研究發(fā)現(xiàn)，經靜脈移植的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可遷移至急性肝損傷小鼠模型的肝組織內，減少肝組織炎癥細胞浸潤，改善肝臟組織結構排列。因此，本研究探討B(tài)MSCs對UC合并肝損傷小鼠的肝臟修復作用及對肝臟緊密連接蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 取15只無特定病原體級6～7周齡Balb/c雌性小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCK20070005)用于實驗，體質量19～21 g，將其飼養(yǎng)于清潔級實驗室，室內溫度(20±4)℃，濕度45%～60%，通風良好，光照隨晝夜浮動。另取4只無特定病原體級3周齡Balb/c雄性小鼠用于分離提取BMSCs，體質量9～11 g，來源及喂養(yǎng)要求同上。

1.2 主要實驗試劑和儀器 4% DSS購自美國Sigma公司(批號：31404)，低糖DMEM購自美國Gibco公司(批號：31600034)，12%中性甲醛固定液購自北京雷根生物技術有限公司(批號：DF0113)，TRIzol試劑購自天根生化科技(北京)有限公司(批號：DP424)，反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑購自立陶宛Fermentas公司(批號：K1622)。目的基因claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7、封閉蛋白(occludin)、閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens 1,ZO-1)及內參基因α-actin的引物均由上海銳賽生物科技(集團)有限公司設計合成，引物序列見表1。Chemray240全自動生化分析儀購自美國Rayto公司，BX51光學顯微鏡購自日本Olympus公司，ML4002精密天平購自德國梅特勒-托利多公司，UV2401PC紫外分光光度計購自日本島津公司，7500實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

表1 引物序列

1.3 BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定 按照相關文獻[7]中的方法進行BMSCs分離與培養(yǎng)，主要步驟為：頸離斷處死3周齡Balb/c雄性小鼠，分離股骨，使用注射器抽吸低糖DMEM沖洗骨髓腔，沖洗液中的細胞經重懸后接種于無菌塑料培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后首次更換培養(yǎng)液，此后每2～3 d更換一次培養(yǎng)液。取形態(tài)均一、活性良好的第3～4代細胞進行鑒定，然后用于后續(xù)實驗。根據(jù)國際細胞治療協(xié)會2006年制訂的多功能間充質干細胞的基本定義[8]對培養(yǎng)細胞進行鑒定：(1)貼壁生長；(2)細胞表面表達特異性抗原，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29、CD45、CD90的表達情況；(3)驗證干細胞多向分化潛能，包括采用Von Kossa染色法評估抗壞血酸/甘油磷酸鈉培養(yǎng)3周后BMSCs的成骨情況，以及油紅O染色法評估經地塞米松誘導后BMSCs的成脂情況。

1.4 分組、建模和干預方法 將15只6～7周齡Balb/c雌性小鼠按隨機數(shù)字表法分為陰性對照組、實驗對照組及實驗組，每組5只。陰性對照組小鼠正常飲水，其余兩組小鼠每天自由飲用4% DSS水溶液，連續(xù)3周。造模期間，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、進食、飲水及活動等一般情況，每天定時稱體重1次，記錄小鼠糞便情況[7]。造模結束后第8天，給予陰性對照組和實驗對照組小鼠經尾靜脈注射PBS 0.3 mL，給予實驗組小鼠經尾靜脈注射0.3 mL的BMSCs懸液(含1×106細胞)進行干預1次。

1.5 標本的收集與處理 于BMSCs移植干預后第9天，摘除各組小鼠一側眼球后取血0.7～1.0 mL，立即將血標本在4 ℃下以3 000 r/min離心5 min，取血清行肝功能指標檢測。取血后采用頸椎脫臼法處死所有小鼠，打開腹腔，取出結腸組織和肝臟組織。將肝臟組織呈冠狀位切開分為A、B兩部分，將A部分置于12%中性甲醛中固定24 h后制作病理切片，將B部分放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于實時熒光定量PCR檢測。取結腸病變組織(陰性對照組則取相應部位的結腸組織)置于12%中性甲醛中固定24 h后制作病理切片。進行相應檢測前須確認血清標本無溶血、冰凍肝組織無損毀、標簽無脫落及標記清晰等情況。

1.6 測定肝功能 采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清ALT、AST、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和總膽紅素水平。

1.7 制備組織切片及組織病理學觀察 取固定后的結腸和肝臟組織，由廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院病理?？萍紟熯M行脫水、透明、石蠟包埋，使用輪式切片機制作5 μm切片，貼片后烘片，進行HE染色。制作好的玻片由2名廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院病理?？漆t(yī)師在顯微鏡下觀察并拍照采圖。

1.8 實時熒光定量PCR檢測肝臟組織中緊密連接蛋白的mRNA表達水平 取約100 mg肝臟組織標本置于干凈預冷的研缽中，倒入適量液氮，在全自動研磨儀中將肝臟組織標本研磨成粉末，按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA純度后，將其反轉錄成cDNA，使用實時熒光定量PCR儀進行PCR反應，每個標本重復上樣3次。PCR總體系為20 μL，包括2×SYBR Green Mix 10 μL、引物Mix 1 μL、cDNA模板5 μL、超純水4 μL。 PCR程序： 95.0 ℃預變性5 min；95.0 ℃ 變性10 s，60.0 ℃退火30 s， 72.0 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以α-actin為內參，采用2-ΔΔCt法進行半定量分析，計算目的基因的mRNA相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 25軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs的鑒定情況 流式細胞檢測結果提示CD29(+)、CD45(-)、CD90(+)，Von Kossa染色及油紅O染色結果提示成功誘導BMSCs分化為成骨細胞、脂肪細胞，說明成功分離BMSCs。

2.2 3組小鼠造模期間一般情況及結腸組織病理變化 在造模期間，陰性對照組小鼠一般情況良好，大便成型；實驗對照組小鼠皮毛缺乏光澤，體重下降，反應遲鈍，活動減少，大便呈糊狀或水狀，逐漸出現(xiàn)血便或便血。實驗組小鼠毛色光澤度差于陰性對照組小鼠，小鼠活動度基本正常，部分小鼠出現(xiàn)輕度體重減輕或便中帶血，但癥狀輕于實驗對照組小鼠。陰性對照組小鼠結腸上皮細胞、腺體排列規(guī)則，隱窩形態(tài)正常，未見炎癥細胞浸潤；實驗對照組小鼠結腸黏膜上皮結構破壞明顯，腺體及隱窩結構破壞，可見大量炎癥細胞浸潤黏膜固有層及黏膜下層；實驗組小鼠結腸黏膜上皮結構尚規(guī)整，黏膜固有層腺體、隱窩基本正常，可見少量炎癥細胞浸潤黏膜固有層，程度明顯輕于實驗對照組。

2.3 3組小鼠血清肝功能指標的比較 實驗對照組小鼠的血清ALT、AST、ALP及總膽紅素水平均高于陰性對照組(均P<0.05)；實驗組小鼠的血清ALT、AST、總膽紅素水平均低于實驗對照組(均P<0.05)，而實驗組小鼠的血清ALP水平較實驗對照組有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組小鼠血清肝功能指標的比較(x±s)

2.4 3組小鼠肝臟組織病理學的改變情況 陰性對照組小鼠肝臟結構大致正常。實驗對照組肝小葉結構不完整，肝索結構不清，肝竇變窄，小葉間靜脈及中央靜脈呈瘀血樣改變，可見炎癥細胞浸潤及少量肝細胞壞死。實驗組小鼠肝小葉結構基本完整，肝索放射狀排列欠規(guī)則，肝竇間隙較實驗對照組小鼠增寬，小葉間靜脈瘀血較實驗對照組小鼠減輕，肝細胞未見壞死，僅見少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.5 3組小鼠肝臟組織中緊密連接蛋白mRNA表達水平的比較 實驗對照組小鼠肝臟組織的claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表達水平均低于陰性對照組(均P<0.05)；實驗組小鼠肝臟組織的claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表達水平均高于實驗對照組，而claudin-2 mRNA表達水平低于實驗對照組(均P<0.05)。3組小鼠肝臟組織的occludin mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組小鼠肝臟組織中緊密連接蛋白mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

緊密連接封閉膽管并保證膽汁在膽管腔內，構成血液-膽汁屏障；當緊密連接結構被破壞，膽汁返流入肝血竇，機體出現(xiàn)膽汁淤積。緊密連接蛋白在多種肝臟疾病中的表達均發(fā)生改變[9-11]。claudin是緊密連接蛋白的關鍵成分，目前發(fā)現(xiàn)了其至少有27個成員，主要功能包括調節(jié)細胞外通透性、細胞極性、細胞分化和增殖、細胞遷移和凋亡，以及介導細胞信號傳導等[12]。其中，claudin-1基因的功能障礙會導致膽汁滲漏、肝內膽汁淤積和肝細胞損傷，引起新生兒硬化性膽管炎伴魚鱗病[13]。此外，claudin-1在丙型肝炎病毒入侵肝細胞的過程中發(fā)揮著重要作用[14]。敲除claudin-2基因后膽汁中的Na+濃度降低，膽汁酸和脂質成分濃縮，膽汁流速降低，從而促進膽固醇結石的形成[15]。敲除claudin-3基因可導致旁細胞屏障功能降低，增加Ca2+、PO43-經肝膽管上皮的旁細胞轉運，促進膽固醇結石形成[16]。occludin不僅起封閉細胞旁間隙作用，在信號通路的傳導中也起重要作用。occludin高表達可使得緊密連接蛋白數(shù)量及上皮細胞跨膜電阻增加[17]。Miura等[18]的研究表明，claudin-3和occludin等蛋白的低表達水平可使得膽小管的結構破壞甚至消失。Zeisel等[19]研究發(fā)現(xiàn)，occludin在丙型肝炎病毒入侵肝細胞的過程中起重要作用。ZO-1屬于膜連接鳥苷酸激酶蛋白家族，參與調節(jié)細胞內物質的轉運，維持上皮極性，在細胞的增殖分化中發(fā)揮作用[20]。ZO-1的N端有與occludin等蛋白結合的區(qū)域，而C端可結合肌動蛋白，在其他緊密連接蛋白與肌動蛋白間起橋梁作用[21]。

本研究利用DSS構建UC模型，實驗對照組小鼠在建模過程中體重下降，反應遲鈍，活動減少，大便呈糊狀或水狀，逐漸出現(xiàn)血便或便血，結腸組織病理檢查提示結腸黏膜上皮結構破壞明顯，腺體及隱窩結構破壞，可見大量炎癥細胞浸潤黏膜固有層及黏膜下層，這提示成功建立UC模型；實驗對照組小鼠的ALT、AST、ALP及總膽紅素水平均高于陰性對照組(均P<0.05)，肝臟組織發(fā)生肝小葉結構紊亂、炎癥細胞浸潤等改變，這提示成功建立UC合并肝損傷小鼠模型。實驗對照組小鼠肝臟組織中的claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7及ZO-1的mRNA表達水平均低于陰性對照組(P<0.05)，這提示UC可合并肝臟緊密連接受損。而注射BMSCs后，實驗組小鼠的UC癥狀及結腸病理表現(xiàn)均有所減輕，肝功能及肝臟病理損傷均改善，且肝臟組織中的claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表達水平均高于實驗對照組小鼠(均P<0.05)，這表明BMSCs對UC合并肝損傷小鼠模型的結腸及肝臟均具有修復作用，并可提高肝臟緊密連接蛋白mRNA的表達水平。研究表明，BMSCs經尾靜脈注射進入血液循環(huán)后，可在損傷局部微環(huán)境及外周血的趨化作用下遷移至損傷部位，抑制腫瘤壞死因子α和白細胞介素等炎癥因子的表達，并分泌肝細胞生長因子[22]，而腫瘤壞死因子α可抑制claudin-1、occludin和ZO-1表達[23-24]，肝細胞生長因子可刺激claudin-7通過細胞外信號調節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制細胞遷移和侵襲[25]?？梢夿MSCs可能通過抑制腫瘤壞死因子α及分泌肝細胞生長因子等來增強claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1的表達，從而實現(xiàn)對肝臟的修復作用。此外，本實驗中的BMSCs還可能通過修復腸黏膜損傷，減少腸源毒素損傷肝臟。既往研究表明，間充質干細胞對結腸炎有治療作用[26-28]，結合本研究結果，BMSCs或可成為治療UC合并肝損傷的一種新方法。本研究結果還顯示，實驗對照組小鼠肝臟組織中claudin-2、occludin的mRNA表達水平有所下降，但在注射BMSCs后claudin-2、occludin的表達水平未見明顯改善，這可能與機體的修復功能有關，其機制仍需進一步研究。

綜上所述，BMSCs對UC合并肝損傷小鼠模型的肝臟有一定的修復作用，并可提高肝臟緊密連接蛋白mRNA的表達水平，其可能通過影響緊密連接蛋白的表達實現(xiàn)對肝臟的修復作用。