羅孟亞男 李有強 曾 月 徐鵬翔

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院1 放療科，2 神經(jīng)外科，海南省?？谑?570311)

惡性膠質(zhì)瘤是臨床常見腫瘤，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高及死亡率高的特點[1-2]。目前臨床上主要采取手術(shù)切除結(jié)合放化療的方法進行綜合治療，但是多數(shù)膠質(zhì)瘤的放療敏感性低，故上述治療方案無法有效阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，導(dǎo)致治療效果仍然不理想，嚴重影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[3-4]。從抑制癌基因表達及增強抑癌基因表達的角度研究惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制，可為膠質(zhì)瘤的預(yù)防及治療提供新靶點[5]。

T-鈣黏蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的黏附分子，作為鈣黏蛋白超家族的成員之一，其廣泛存在于多種器官組織中，尤其是心血管組織，能調(diào)節(jié)細胞黏附與細胞極性，并參與細胞識別與信號傳導(dǎo)等生理過程[6-7]。Kuphal等[8]發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤細胞中過表達T-鈣黏蛋白基因可以抑制腫瘤的增殖；Lin等[9]發(fā)現(xiàn)，T-鈣黏蛋白過度表達與胃癌患者的整體存活率提高有關(guān)，其通過體外細胞實驗證實T-鈣黏蛋白可以通過抑制蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路進而抑制胃癌的發(fā)生；Kong等[10]的研究表明，在腋窩淋巴結(jié)陽性的乳腺癌患者中，T-鈣黏蛋白表達陽性患者的預(yù)后更好。以上研究結(jié)果提示，體外上調(diào)T-鈣黏蛋白表達水平能在黑色素瘤、胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。但目前國內(nèi)外尚未有T-鈣黏蛋白與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和放療敏感性的關(guān)系的研究報告。星形細胞瘤是臨床最常見的膠質(zhì)瘤類型，其發(fā)病率高但惡性程度相對較低，而膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病率僅次于星形細胞瘤，但其惡性程度高。因此，本研究除分析膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白表達情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系外，還采用了星形細胞瘤U251細胞與膠質(zhì)母細胞瘤A172細胞兩類常用于膠質(zhì)瘤研究的細胞系作為體外細胞實驗的研究對象，通過檢測T-鈣黏蛋白在膠質(zhì)瘤組織和細胞內(nèi)的表達水平，探討其對膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及放療敏感性等的影響，旨在為臨床上診斷和治療惡性膠質(zhì)瘤提供新的分子靶標。

1 材料與方法

1.1 組織標本、實驗細胞及動物

1.1.1 臨床樣本：選取2017年1月至2019年9月期間在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的37例惡性膠質(zhì)瘤患者作為研究對象，留取其手術(shù)切除的惡性膠質(zhì)瘤組織及距癌組織2 cm的癌旁正常組織。所有患者的臨床資料完整，術(shù)前均未接受過放化療，且均隨訪至術(shù)后12個月以上。本研究已通過海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，且所有患者已簽署知情同意書。于患者出院后，通過電話定期回訪或門診復(fù)查進行隨訪，將患者出現(xiàn)癌癥相關(guān)死亡記為終點事件，隨訪截至2021年3月31日。

1.1.2 細胞系：人腦正常膠質(zhì)細胞株HEB及膠質(zhì)瘤細胞系U251、A172均購自上海北諾生物科技有限公司，均采用含有10%胎牛血清與1%雙抗的DMEM，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞融合度達80%～90%時，用0.25%胰酶消化后傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.1.3 實驗動物：選取12只Balb/c裸鼠(雄性，4周齡，體重20～25 g)作為實驗動物，由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[SYXK(瓊)2022-0013]提供，均在無特定病原體級無菌層流動物房內(nèi)(溫度25 ℃、空氣濕度為50%)進行飼養(yǎng)與實驗。本研究嚴格按照實驗動物倫理要求執(zhí)行。

1.2 主要實驗試劑和儀器 DMEM(批號：8119441)與胎牛血清(批號：1414426)購自美國Gibco公司，TRIzol RNA提取試劑(批號：1392739)、陰性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1，批號：2031251)、 T-鈣黏蛋白過表達質(zhì)粒(pcDNA-T-cadherin，批號：2081112)、DAPI染液(批號：1964785)、Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑(批號：2064785)均購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit與PCR檢測試劑(批號：20200830)均購自上海生工生物；EdU細胞增殖檢測試劑盒(批號：20200711)購自廣州銳博生物公司，兔抗人T-鈣黏蛋白抗體(批號：7074921)、兔抗人波形蛋白抗體(批號：8192743)、兔抗人E-鈣黏蛋白抗體(批號：8078207)、二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(批號：9192543)均購自美國CST公司，Transwell小室(批號：37274012)購自美國Corning公司，Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶染色試劑盒(批號：6589641)購自美國BD公司，RIPA裂解液(批號：020522150604)、吉姆薩染液(批號：022384141258)、CCK-8試劑盒(批號：017421051308)、10% SDS-PAGE(批號：021582510704)、二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒(批號：016153712103)與ECL化學(xué)發(fā)光液(批號：020412301574)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。PCR儀(型號：ABI7500)由美國ABI公司生產(chǎn)，流式細胞儀(型號：CytoFLEX)由美國貝克曼公司生產(chǎn)，酶標儀(型號：FC)由賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)(型號：XRS+)由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，光學(xué)顯微鏡(型號：CX23)由日本Olympus公司生產(chǎn)，熒光顯微鏡(型號：DM2500)由德國徠卡公司生產(chǎn)。鈷60治療機(型號：FCC-8000)由山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR測定T-鈣黏蛋白mRNA表達水平：采用TRIzol RNA提取試劑提取臨床組織樣本和細胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit合成cDNA。配制PCR體系，包括PCR Master Mix 12.5 μL、cDNA模板2 μL、上游引物(50 ng/μL)1 μL、下游引物(50 ng/μL)1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸20 s，40個循環(huán)。各基因的引物由上海生工生物公司合成。T-鈣黏蛋白上游引物序列為5′-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3′，下游引物序列為5′-GTGCATGGACGAACAGAGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GACCCCTTCATTGACCTCAACTAC-3′，下游引物序列為5′-TGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGA-3′。采用2-ΔΔCt法計算T-鈣黏蛋白mRNA相對表達水平。每個待測組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.2 Western blot檢測細胞中T-鈣黏蛋白表達水平：收集待測細胞于EP管中，PBS洗滌后以1 000 r/min離心5 min棄上清液，每1×106個懸浮細胞加入250 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)后冰浴30 min，12 377 r/min離心5 min，收集上清液得到總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定總蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(冰水浴，300 mA,2 h)，使用5%的脫脂牛奶封閉膜1 h，加入一抗(T-鈣黏蛋白及內(nèi)參GAPDH的稀釋比例均為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，濾膜用PBST清洗5次，5 min/次，加入二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫下孵育2 h。孵育結(jié)束使用PBST清洗5次，5 min/次，并用純水沖洗5次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并測定灰度值，以T-鈣黏蛋白的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值的比值作為T-鈣黏蛋白的相對表達水平。每組細胞設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 免疫組化法測定惡性膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白的表達情況：取臨床組織樣本，順序進行4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋保存，檢測時制成5 μm切片，進行脫蠟處理，采用微波爐加熱(高火3 min、中火5 min、低火5 min)進行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后使用PBS沖洗3次，5 min/次，隨后加入3%的H2O2室溫孵育5 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，5 min/次，加入5%山羊血清室溫孵育10 min進行封閉，此時添加一抗(兔抗人T-鈣黏蛋白抗體，稀釋比例為1 ∶100)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，再加入二抗(羊抗兔IgG二抗，稀釋比例為1 ∶100)室溫下孵育30 min,PBS沖洗3次后加入50 μL鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育10 min，使用PBS與蒸餾水分別沖洗3次，每張切片滴加100 μL DAB溶液顯色約5 min，加入蘇木素復(fù)染3 min，自來水沖洗返藍，置入0.5%的鹽酸酒精中分化數(shù)秒，于梯度(由70%逐漸升至100%)酒精中進行脫水，每濃度各5 min，二甲苯脫水至透明后采用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察，根據(jù)染色強度與染色陽性細胞數(shù)判定T-鈣黏蛋白表達情況。T-鈣黏蛋白定位于細胞膜上，染色強度評分為無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；細胞膜呈淡黃色、棕黃色或棕褐色的細胞為染色陽性細胞，染色陽性細胞數(shù)≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，76%～100%記4分；計算染色強度評分與染色陽性細胞數(shù)評分的乘積，乘積為0分則判定為陰性，1～4分為弱陽，5～8分為陽性，9～12分為強陽性。最后將陽性與強陽性視作陽性，其余歸為陰性。

1.3.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：分別將U251與A172兩種細胞分為空白對照組、陰性對照組和T-鈣黏蛋白過表達組進行實驗?？瞻讓φ战M不進行轉(zhuǎn)染操作，將pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至陰性對照組細胞，將pcDNA3.1-T-cadherin轉(zhuǎn)染至T-鈣黏蛋白過表達組細胞。每2×105個細胞用500 μL不含抗生素的DMEM重懸，接種于24孔板，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，待細胞融合度達到90%～95%時可用于轉(zhuǎn)染。采用50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋0.8 μg質(zhì)粒后將其與50 μL轉(zhuǎn)染液混合均勻，室溫靜置20 min，在24孔細胞培養(yǎng)板中加入100 μL上述轉(zhuǎn)染混合液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，采用實時熒光定量PCR檢測T鈣黏蛋白的mRNA表達水平以驗證轉(zhuǎn)染效果，相比空白對照組或陰性對照組，T-鈣黏蛋白過表達組T鈣黏蛋白mRNA表達水平升高且具有統(tǒng)計學(xué)意義，即表示轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實驗。每組均設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.5 EdU法檢測細胞的增殖能力：將1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251細胞與A172細胞接種于含100 μL DMEM的96孔板中(1×105細胞/孔)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h。隨后每孔細胞加入100 μL含EdU試劑的培養(yǎng)基(使用DMEM培養(yǎng)液按1 000 ∶1的比例將EdU試劑的濃度稀釋為50 μmol/L)孵育2 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗細胞2次，5 min/次。使用100 μL含4%多聚甲醛的PBS固定細胞25 min，棄固定液，每孔加入50 μL甘氨酸(2 mg/mL)孵育5 min中和甲醛，棄去甘氨酸，再加入100 μL PBS搖床孵育5 min后清洗細胞，棄去PBS，加入100 μL含0.5%聚乙二醇辛基苯基醚的PBS孵育10 min以對細胞進行滲透；使用PBS清洗5 min后，用100 μL Apollo染料溶液在室溫、避光的條件下進行染色30 min；使用PBS清洗5 min后用DAPI在避光、室溫的條件下染色30 min；使用PBS清洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察，DAPI將所有細胞核染成亮藍色，EdU染色陽性為細胞核呈亮紅色。用ImageJ軟件計算EdU陽性細胞的百分率(即EdU陽性率)。

1.3.6 流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況：取1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251與A172細胞，使用0.25%胰蛋白酶(不含乙二胺四乙酸)消化2 min，使用1 mL PBS清洗2遍，2 000 r/min室溫離心5 min棄上清液，計數(shù)細胞后，每1×106個細胞采用100 μL結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL的Annexin Ⅴ-FITC和5 μL的碘化丙啶，輕晃混勻，于4 ℃避光下放置30 min。染色結(jié)束后加入1 mL PBS，室溫下2 000 r/min離心5 min棄上清液，再使用100 μL PBS重懸細胞，采用流式細胞儀測定細胞的凋亡情況。Annexin Ⅴ-FITC與PI標記均為陽性的細胞為晚期凋亡細胞，Annexin Ⅴ-FITC標記陽性、PI陰性的細胞為早期凋亡細胞，細胞凋亡率(%)=晚期凋亡細胞率(%)+早期凋亡細胞率(%)。

1.3.7 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗：由于A172細胞不具備成瘤性，故僅選用U251細胞系進行成瘤性檢測。收集1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的3組U251細胞，胰蛋白酶消化后PBS清洗兩遍，經(jīng)生理鹽水重懸制成單細胞懸液細胞(密度為1×106個/mL)。采用隨機數(shù)字表法將裸鼠分為空白對照組、陰性對照組和T-鈣黏蛋白過表達組，每組4只裸鼠，于每只裸鼠右側(cè)腋窩處皮下注射相應(yīng)的細胞懸液0.5 mL，每隔3 d觀察注射部位的成瘤情況，肉眼完全未見肉瘤即舍棄不用。14 d后每組隨機選用3只成瘤的裸鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死，分離瘤體，計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×瘤體長徑×瘤體短徑2。

1.3.8 Transwell法檢測細胞的體外遷移能力：收集1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251和A172細胞，采用新鮮的DMEM將細胞濃度調(diào)整為1×106個/mL，吸取100 μL細胞懸液于Transwell小室上室，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)15 h后取出小室，擦去未穿過膜的細胞后，使用4%多聚甲醇固定15 min，倒掉甲醇后于空氣中干燥，行吉姆薩染色，蒸餾水沖洗后風干，置于顯微鏡下(400倍)觀察，隨機取5個視野計算遷移細胞數(shù)，計算平均值。

1.3.9 過表達T-鈣黏蛋白對EMT相關(guān)蛋白表達的影響：收集1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251和A172細胞，按照1.3.2的方法檢測細胞中T-鈣黏蛋白、波形蛋白、E-鈣黏蛋白的表達水平，一抗的稀釋比例均為1 ∶1 000，二抗稀釋比例為1 ∶5 000。

1.3.10 放療后細胞存活和細胞克隆形成情況：(1)CCK-8法檢測細胞存活率。將1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251與A172細胞以1×103個/孔的細胞密度接種于含100 μL DMEM的96孔板，分別給予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy劑量(細胞源靶距60 cm)進行γ射線照射2 h后，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，72 h后分別加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h，采用酶標儀于450 nm處測定吸光度，并繪制劑量-存活曲線。存活率=(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。(2)克隆形成實驗。取1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251和A172細胞，將其接種至直徑為6 cm的細胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育至細胞完全貼壁，采用細胞源靶距60 cm、劑量6 Gy的γ射線照射2 h，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，采用結(jié)晶紫(10 g/L)染色后進行計數(shù)，50個以上的細胞集落作為1個克隆，計算相對克隆形成數(shù)(實驗組細胞克隆數(shù)/空白對照組平均克隆數(shù))。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析及圖形繪制。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，不同組織間的數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗分析生存曲線間的差異。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 惡性膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白的表達情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系 惡性膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白的mRNA表達水平和蛋白陽性表達率均低于癌旁組織(均P<0.05),見表1、圖1A。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，惡性膠質(zhì)瘤組織T-鈣黏蛋白陰性、陽性的患者中位生存期分別為14.0個月、24.0個月，T-鈣黏蛋白表達陰性患者中位生存期短于T-鈣黏蛋白表達陽性患者(χ2=7.647，P=0.006)，見圖1B。

表1 T-鈣黏蛋白在惡性膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的表達情況比較

2.2 不同細胞中T-鈣黏蛋白的表達情況 與正常細胞系HEB相比，膠質(zhì)瘤細胞系U251和A172中T-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白表達水平均下調(diào)(均P<0.05),見表2和圖2。

表2 T-鈣黏蛋白在正常膠質(zhì)細胞和惡性膠質(zhì)瘤細胞中的表達情況比較(x±s)

2.3 過表達T-鈣黏蛋白對膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡和成瘤的影響 與空白對照組比較，陰性對照組A172與U251細胞的EdU陽性率、細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；而與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達組A172與U251細胞的EdU陽性率均降低，且細胞凋亡率升高(均P<0.05)。見表3、表4和圖3。

表3 3組A172細胞的增殖與凋亡情況比較(x±s,%)

表4 3組U251細胞的增殖、凋亡和成瘤情況比較(x±s)

與空白對照組比較，陰性對照組的腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達組的腫瘤體積縮小(均P<0.05)。見表4和圖3。

2.4 T-鈣黏蛋白對膠質(zhì)瘤細胞系遷移和EMT的影響 與空白對照組比較，陰性對照組A172與 U251細胞的遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.01)；而與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達組A172與 U251細胞的遷移細胞數(shù)減少(均P<0.05)。見表5、表6、圖4A。

與空白對照組比較，陰性對照組A172與 U251細胞的T-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達組A172與 U251細胞的波形蛋白表達水平降低，而T-鈣黏蛋白和E-鈣黏蛋白表達水平均升高(均P<0.05)。見表5、表6、圖4B。

表5 3組A172細胞的遷移能力和EMT相關(guān)蛋白的表達情況比較(x±s)

表6 3組U251細胞的遷移能力和EMT相關(guān)蛋白的表達情況比較(x±s)

2.5 上調(diào)T-鈣黏蛋白對膠質(zhì)瘤細胞放療敏感性的影響 采用4 Gy、6 Gy劑量的γ射線進行照射后，}黏蛋白過表達組U251和A172細胞存活率均低于其他兩組(均P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組細胞存活率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。由于采用6 Gy劑量照射時，3組細胞的存活率相對于其他劑量照射下更低，因此采用6 Gy劑量作為后續(xù)實驗的照射劑量。采用6 Gy劑量的γ射線進行照射后，T-鈣黏蛋白過表達組A172和 U251細胞克隆形成率均低于其他兩組(均P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組細胞克隆形成率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表7、表8、圖5。

表7 γ射線照射后3組A172細胞的存活率和相對克隆數(shù)比較(x±s)

表8 γ射線照射后3組U251細胞的存活率和相對克隆數(shù)比較(x±s)

3 討 論

近年來，隨著臨床醫(yī)療水平的提高，惡性膠質(zhì)瘤的治療也取得了一定的進展。手術(shù)可以最大范圍地切除腫瘤，能夠緩解惡性膠質(zhì)瘤患者的臨床癥狀；術(shù)后放療可抑制殘余腫瘤細胞的生長，同時輔助化療可以延長患者的生存期[11-12]。但是從目前的實際臨床情況來看，惡性膠質(zhì)瘤患者術(shù)后2年生存率仍然低于30%，預(yù)后情況仍不容樂觀[13]。放療在現(xiàn)有的序貫治療方案中起著主導(dǎo)作用，但是大多數(shù)惡性膠質(zhì)瘤存在放射抗性，導(dǎo)致放療效果較差[14-15]。因此，如何增強惡性膠質(zhì)瘤的放療敏感性，是改善惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后的突破口。

T-鈣黏蛋白基因定位于染色體16q24區(qū)域，該區(qū)域常會受到致癌性修飾。T-鈣黏蛋白基因編碼的蛋白則是負責選擇性細胞識別與黏附的一類細胞表面糖蛋白，近年來其與癌癥的相關(guān)性逐漸受到科研人員的關(guān)注[16]。本研究首先檢測了惡性膠質(zhì)瘤組織及細胞中T-鈣黏蛋白 mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平，發(fā)現(xiàn)其表達水平均低于正常腦組織及正常膠質(zhì)細胞(均P<0.05)，同時免疫組化結(jié)果也提示惡性膠質(zhì)瘤組織的T-鈣黏蛋白陽性率低于正常腦組織(P<0.05)；通過對膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生存情況進行隨訪，還發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤組織T-鈣黏蛋白表達陰性患者的預(yù)后差于T-鈣黏蛋白表達陽性患者(均P<0.05)。以上結(jié)果提示T-鈣黏蛋白表達的缺失可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及預(yù)后有關(guān)。Kong等[17]通過隨訪三陰性乳腺癌患者的無進展生存期與5年整體生存率，亦發(fā)現(xiàn)T-鈣黏蛋白的表達下調(diào)是患者預(yù)后的獨立危險因素。雖然該研究與本研究的癌癥類型不同，但結(jié)果呈現(xiàn)出相似性。

Wang等[18]報告T-鈣黏蛋白可能在口腔鱗癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用，過表達T-鈣黏蛋白可以通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路抑制口腔鱗癌細胞的增殖。Lu等[19]發(fā)現(xiàn)，過表達T-鈣黏蛋白可以抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的遷移、侵襲及EMT行為。Lu等[20]還發(fā)現(xiàn)，T-鈣黏蛋白表達的上調(diào)能阻止膠質(zhì)母細胞瘤的EMT，從而抑制其轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果均表明，上調(diào)T-鈣黏蛋白表達能抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

本研究進一步通過體外轉(zhuǎn)染細胞系實驗發(fā)現(xiàn)，過表達T-鈣黏蛋白后惡性膠質(zhì)瘤細胞增殖活力降低，凋亡率升高，體外成瘤體積減小，遷移能力降低，同時E-鈣黏蛋白表達水平升高，而波形蛋白表達水平降低(均P<0.05)。而E-鈣黏蛋白與波形蛋白是EMT活動的標志蛋白，EMT的特征表現(xiàn)為E-鈣黏蛋白表達減少、波形蛋白表達增加[21-22]。因此本研究的結(jié)果表明T-鈣黏蛋白過表達可抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、EMT行為。

細胞間黏附增強，可以防止癌細胞的擴散與轉(zhuǎn)移，對于抑制癌癥進展和減輕放療抗性有著重要意義[23]。而鈣黏蛋白家族分子可以介導(dǎo)細胞間黏附，其表達水平可能影響癌細胞的脫離與附著，其中T-鈣黏蛋白作為鈣黏蛋白家族中一類非經(jīng)典黏附分子，與E-鈣黏蛋白等經(jīng)典鈣黏蛋白分子不同的是，它不具備可經(jīng)糖基磷脂酰肌醇的跨膜區(qū)，但是仍然能介導(dǎo)細胞間的黏附[24]。最后，本研究分析了T-鈣黏蛋白過表達對膠質(zhì)瘤細胞放療敏感性的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)6 Gy的γ射線照射處理后，T-鈣黏蛋白過表達組的細胞存活率及相對克隆數(shù)亦較空白對照組和陰性對照組降低(均P<0.05)。這表明T-鈣黏蛋白在膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮著抑癌與放射增敏的效果，但具體分子機制仍有待進一步研究。

綜上所述，T-鈣黏蛋白在惡性膠質(zhì)瘤中呈異常低表達狀態(tài)，過表達T-鈣黏蛋白能發(fā)揮抑癌作用，降低惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力，且能增強惡性膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性，使得患者獲得更好的預(yù)后。T-鈣黏蛋白有望成為治療膠質(zhì)瘤的靶點之一，未來需要通過進一步的機制研究來證實本研究結(jié)論。