羅孟亞男 李有強(qiáng) 曾 月 徐鵬翔

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院1 放療科，2 神經(jīng)外科，海南省?？谑?570311)

惡性膠質(zhì)瘤是臨床常見腫瘤，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高及死亡率高的特點[1-2]。目前臨床上主要采取手術(shù)切除結(jié)合放化療的方法進(jìn)行綜合治療，但是多數(shù)膠質(zhì)瘤的放療敏感性低，故上述治療方案無法有效阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，導(dǎo)致治療效果仍然不理想，嚴(yán)重影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[3-4]。從抑制癌基因表達(dá)及增強(qiáng)抑癌基因表達(dá)的角度研究惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，可為膠質(zhì)瘤的預(yù)防及治療提供新靶點[5]。

T-鈣黏蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的黏附分子，作為鈣黏蛋白超家族的成員之一，其廣泛存在于多種器官組織中，尤其是心血管組織，能調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附與細(xì)胞極性，并參與細(xì)胞識別與信號傳導(dǎo)等生理過程[6-7]。Kuphal等[8]發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)T-鈣黏蛋白基因可以抑制腫瘤的增殖；Lin等[9]發(fā)現(xiàn)，T-鈣黏蛋白過度表達(dá)與胃癌患者的整體存活率提高有關(guān)，其通過體外細(xì)胞實驗證實T-鈣黏蛋白可以通過抑制蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路進(jìn)而抑制胃癌的發(fā)生；Kong等[10]的研究表明，在腋窩淋巴結(jié)陽性的乳腺癌患者中，T-鈣黏蛋白表達(dá)陽性患者的預(yù)后更好。以上研究結(jié)果提示，體外上調(diào)T-鈣黏蛋白表達(dá)水平能在黑色素瘤、胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。但目前國內(nèi)外尚未有T-鈣黏蛋白與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和放療敏感性的關(guān)系的研究報告。星形細(xì)胞瘤是臨床最常見的膠質(zhì)瘤類型，其發(fā)病率高但惡性程度相對較低，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病率僅次于星形細(xì)胞瘤，但其惡性程度高。因此，本研究除分析膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系外，還采用了星形細(xì)胞瘤U251細(xì)胞與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A172細(xì)胞兩類常用于膠質(zhì)瘤研究的細(xì)胞系作為體外細(xì)胞實驗的研究對象，通過檢測T-鈣黏蛋白在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，探討其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及放療敏感性等的影響，旨在為臨床上診斷和治療惡性膠質(zhì)瘤提供新的分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、實驗細(xì)胞及動物

1.1.1 臨床樣本：選取2017年1月至2019年9月期間在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的37例惡性膠質(zhì)瘤患者作為研究對象，留取其手術(shù)切除的惡性膠質(zhì)瘤組織及距癌組織2 cm的癌旁正常組織。所有患者的臨床資料完整，術(shù)前均未接受過放化療，且均隨訪至術(shù)后12個月以上。本研究已通過海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，且所有患者已簽署知情同意書。于患者出院后，通過電話定期回訪或門診復(fù)查進(jìn)行隨訪，將患者出現(xiàn)癌癥相關(guān)死亡記為終點事件，隨訪截至2021年3月31日。

1.1.2 細(xì)胞系：人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞株HEB及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、A172均購自上海北諾生物科技有限公司，均采用含有10%胎牛血清與1%雙抗的DMEM，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時，用0.25%胰酶消化后傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.1.3 實驗動物：選取12只Balb/c裸鼠(雄性，4周齡，體重20～25 g)作為實驗動物，由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[SYXK(瓊)2022-0013]提供，均在無特定病原體級無菌層流動物房內(nèi)(溫度25 ℃、空氣濕度為50%)進(jìn)行飼養(yǎng)與實驗。本研究嚴(yán)格按照實驗動物倫理要求執(zhí)行。

1.2 主要實驗試劑和儀器 DMEM(批號：8119441)與胎牛血清(批號：1414426)購自美國Gibco公司，TRIzol RNA提取試劑(批號：1392739)、陰性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1，批號：2031251)、 T-鈣黏蛋白過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-T-cadherin，批號：2081112)、DAPI染液(批號：1964785)、Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑(批號：2064785)均購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit與PCR檢測試劑(批號：20200830)均購自上海生工生物；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(批號：20200711)購自廣州銳博生物公司，兔抗人T-鈣黏蛋白抗體(批號：7074921)、兔抗人波形蛋白抗體(批號：8192743)、兔抗人E-鈣黏蛋白抗體(批號：8078207)、二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(批號：9192543)均購自美國CST公司，Transwell小室(批號：37274012)購自美國Corning公司，Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶染色試劑盒(批號：6589641)購自美國BD公司，RIPA裂解液(批號：020522150604)、吉姆薩染液(批號：022384141258)、CCK-8試劑盒(批號：017421051308)、10% SDS-PAGE(批號：021582510704)、二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒(批號：016153712103)與ECL化學(xué)發(fā)光液(批號：020412301574)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。PCR儀(型號：ABI7500)由美國ABI公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀(型號：CytoFLEX)由美國貝克曼公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀(型號：FC)由賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)(型號：XRS+)由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，光學(xué)顯微鏡(型號：CX23)由日本Olympus公司生產(chǎn)，熒光顯微鏡(型號：DM2500)由德國徠卡公司生產(chǎn)。鈷60治療機(jī)(型號：FCC-8000)由山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR測定T-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)水平：采用TRIzol RNA提取試劑提取臨床組織樣本和細(xì)胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit合成cDNA。配制PCR體系，包括PCR Master Mix 12.5 μL、cDNA模板2 μL、上游引物(50 ng/μL)1 μL、下游引物(50 ng/μL)1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸20 s，40個循環(huán)。各基因的引物由上海生工生物公司合成。T-鈣黏蛋白上游引物序列為5′-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3′，下游引物序列為5′-GTGCATGGACGAACAGAGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GACCCCTTCATTGACCTCAACTAC-3′，下游引物序列為5′-TGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGA-3′。采用2-ΔΔCt法計算T-鈣黏蛋白mRNA相對表達(dá)水平。每個待測組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.2 Western blot檢測細(xì)胞中T-鈣黏蛋白表達(dá)水平：收集待測細(xì)胞于EP管中，PBS洗滌后以1 000 r/min離心5 min棄上清液，每1×106個懸浮細(xì)胞加入250 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)后冰浴30 min，12 377 r/min離心5 min，收集上清液得到總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定總蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(冰水浴，300 mA,2 h)，使用5%的脫脂牛奶封閉膜1 h，加入一抗(T-鈣黏蛋白及內(nèi)參GAPDH的稀釋比例均為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，濾膜用PBST清洗5次，5 min/次，加入二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫下孵育2 h。孵育結(jié)束使用PBST清洗5次，5 min/次，并用純水沖洗5次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并測定灰度值，以T-鈣黏蛋白的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值的比值作為T-鈣黏蛋白的相對表達(dá)水平。每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 免疫組化法測定惡性膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白的表達(dá)情況：取臨床組織樣本，順序進(jìn)行4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋保存，檢測時制成5 μm切片，進(jìn)行脫蠟處理，采用微波爐加熱(高火3 min、中火5 min、低火5 min)進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后使用PBS沖洗3次，5 min/次，隨后加入3%的H2O2室溫孵育5 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，5 min/次，加入5%山羊血清室溫孵育10 min進(jìn)行封閉，此時添加一抗(兔抗人T-鈣黏蛋白抗體，稀釋比例為1 ∶100)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，再加入二抗(羊抗兔IgG二抗，稀釋比例為1 ∶100)室溫下孵育30 min,PBS沖洗3次后加入50 μL鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育10 min，使用PBS與蒸餾水分別沖洗3次，每張切片滴加100 μL DAB溶液顯色約5 min，加入蘇木素復(fù)染3 min，自來水沖洗返藍(lán)，置入0.5%的鹽酸酒精中分化數(shù)秒，于梯度(由70%逐漸升至100%)酒精中進(jìn)行脫水，每濃度各5 min，二甲苯脫水至透明后采用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度與染色陽性細(xì)胞數(shù)判定T-鈣黏蛋白表達(dá)情況。T-鈣黏蛋白定位于細(xì)胞膜上，染色強(qiáng)度評分為無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；細(xì)胞膜呈淡黃色、棕黃色或棕褐色的細(xì)胞為染色陽性細(xì)胞，染色陽性細(xì)胞數(shù)≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，76%～100%記4分；計算染色強(qiáng)度評分與染色陽性細(xì)胞數(shù)評分的乘積，乘積為0分則判定為陰性，1～4分為弱陽，5～8分為陽性，9～12分為強(qiáng)陽性。最后將陽性與強(qiáng)陽性視作陽性，其余歸為陰性。

1.3.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：分別將U251與A172兩種細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組和T-鈣黏蛋白過表達(dá)組進(jìn)行實驗?？瞻讓φ战M不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至陰性對照組細(xì)胞，將pcDNA3.1-T-cadherin轉(zhuǎn)染至T-鈣黏蛋白過表達(dá)組細(xì)胞。每2×105個細(xì)胞用500 μL不含抗生素的DMEM重懸，接種于24孔板，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%～95%時可用于轉(zhuǎn)染。采用50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋0.8 μg質(zhì)粒后將其與50 μL轉(zhuǎn)染液混合均勻，室溫靜置20 min，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL上述轉(zhuǎn)染混合液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，采用實時熒光定量PCR檢測T鈣黏蛋白的mRNA表達(dá)水平以驗證轉(zhuǎn)染效果，相比空白對照組或陰性對照組，T-鈣黏蛋白過表達(dá)組T鈣黏蛋白mRNA表達(dá)水平升高且具有統(tǒng)計學(xué)意義，即表示轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實驗。每組均設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.5 EdU法檢測細(xì)胞的增殖能力：將1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251細(xì)胞與A172細(xì)胞接種于含100 μL DMEM的96孔板中(1×105細(xì)胞/孔)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h。隨后每孔細(xì)胞加入100 μL含EdU試劑的培養(yǎng)基(使用DMEM培養(yǎng)液按1 000 ∶1的比例將EdU試劑的濃度稀釋為50 μmol/L)孵育2 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次，5 min/次。使用100 μL含4%多聚甲醛的PBS固定細(xì)胞25 min，棄固定液，每孔加入50 μL甘氨酸(2 mg/mL)孵育5 min中和甲醛，棄去甘氨酸，再加入100 μL PBS搖床孵育5 min后清洗細(xì)胞，棄去PBS，加入100 μL含0.5%聚乙二醇辛基苯基醚的PBS孵育10 min以對細(xì)胞進(jìn)行滲透；使用PBS清洗5 min后，用100 μL Apollo染料溶液在室溫、避光的條件下進(jìn)行染色30 min；使用PBS清洗5 min后用DAPI在避光、室溫的條件下染色30 min；使用PBS清洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察，DAPI將所有細(xì)胞核染成亮藍(lán)色，EdU染色陽性為細(xì)胞核呈亮紅色。用ImageJ軟件計算EdU陽性細(xì)胞的百分率(即EdU陽性率)。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況：取1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251與A172細(xì)胞，使用0.25%胰蛋白酶(不含乙二胺四乙酸)消化2 min，使用1 mL PBS清洗2遍，2 000 r/min室溫離心5 min棄上清液，計數(shù)細(xì)胞后，每1×106個細(xì)胞采用100 μL結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL的Annexin Ⅴ-FITC和5 μL的碘化丙啶，輕晃混勻，于4 ℃避光下放置30 min。染色結(jié)束后加入1 mL PBS，室溫下2 000 r/min離心5 min棄上清液，再使用100 μL PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的凋亡情況。Annexin Ⅴ-FITC與PI標(biāo)記均為陽性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，Annexin Ⅴ-FITC標(biāo)記陽性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率(%)=晚期凋亡細(xì)胞率(%)+早期凋亡細(xì)胞率(%)。

1.3.7 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗：由于A172細(xì)胞不具備成瘤性，故僅選用U251細(xì)胞系進(jìn)行成瘤性檢測。收集1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的3組U251細(xì)胞，胰蛋白酶消化后PBS清洗兩遍，經(jīng)生理鹽水重懸制成單細(xì)胞懸液細(xì)胞(密度為1×106個/mL)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為空白對照組、陰性對照組和T-鈣黏蛋白過表達(dá)組，每組4只裸鼠，于每只裸鼠右側(cè)腋窩處皮下注射相應(yīng)的細(xì)胞懸液0.5 mL，每隔3 d觀察注射部位的成瘤情況，肉眼完全未見肉瘤即舍棄不用。14 d后每組隨機(jī)選用3只成瘤的裸鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死，分離瘤體，計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×瘤體長徑×瘤體短徑2。

1.3.8 Transwell法檢測細(xì)胞的體外遷移能力：收集1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251和A172細(xì)胞，采用新鮮的DMEM將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/mL，吸取100 μL細(xì)胞懸液于Transwell小室上室，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)15 h后取出小室，擦去未穿過膜的細(xì)胞后，使用4%多聚甲醇固定15 min，倒掉甲醇后于空氣中干燥，行吉姆薩染色，蒸餾水沖洗后風(fēng)干，置于顯微鏡下(400倍)觀察，隨機(jī)取5個視野計算遷移細(xì)胞數(shù)，計算平均值。

1.3.9 過表達(dá)T-鈣黏蛋白對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：收集1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251和A172細(xì)胞，按照1.3.2的方法檢測細(xì)胞中T-鈣黏蛋白、波形蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平，一抗的稀釋比例均為1 ∶1 000，二抗稀釋比例為1 ∶5 000。

1.3.10 放療后細(xì)胞存活和細(xì)胞克隆形成情況：(1)CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。將1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251與A172細(xì)胞以1×103個/孔的細(xì)胞密度接種于含100 μL DMEM的96孔板，分別給予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy劑量(細(xì)胞源靶距60 cm)進(jìn)行γ射線照射2 h后，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，72 h后分別加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測定吸光度，并繪制劑量-存活曲線。存活率=(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。(2)克隆形成實驗。取1.3.4中轉(zhuǎn)染后且處于對數(shù)生長期的各組U251和A172細(xì)胞，將其接種至直徑為6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞完全貼壁，采用細(xì)胞源靶距60 cm、劑量6 Gy的γ射線照射2 h，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，采用結(jié)晶紫(10 g/L)染色后進(jìn)行計數(shù)，50個以上的細(xì)胞集落作為1個克隆，計算相對克隆形成數(shù)(實驗組細(xì)胞克隆數(shù)/空白對照組平均克隆數(shù))。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及圖形繪制。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，不同組織間的數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗分析生存曲線間的差異。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 惡性膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系 惡性膠質(zhì)瘤組織中T-鈣黏蛋白的mRNA表達(dá)水平和蛋白陽性表達(dá)率均低于癌旁組織(均P<0.05),見表1、圖1A。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，惡性膠質(zhì)瘤組織T-鈣黏蛋白陰性、陽性的患者中位生存期分別為14.0個月、24.0個月，T-鈣黏蛋白表達(dá)陰性患者中位生存期短于T-鈣黏蛋白表達(dá)陽性患者(χ2=7.647，P=0.006)，見圖1B。

表1 T-鈣黏蛋白在惡性膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)情況比較

2.2 不同細(xì)胞中T-鈣黏蛋白的表達(dá)情況 與正常細(xì)胞系HEB相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和A172中T-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(均P<0.05),見表2和圖2。

表2 T-鈣黏蛋白在正常膠質(zhì)細(xì)胞和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況比較(x±s)

2.3 過表達(dá)T-鈣黏蛋白對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和成瘤的影響 與空白對照組比較，陰性對照組A172與U251細(xì)胞的EdU陽性率、細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；而與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達(dá)組A172與U251細(xì)胞的EdU陽性率均降低，且細(xì)胞凋亡率升高(均P<0.05)。見表3、表4和圖3。

表3 3組A172細(xì)胞的增殖與凋亡情況比較(x±s,%)

表4 3組U251細(xì)胞的增殖、凋亡和成瘤情況比較(x±s)

與空白對照組比較，陰性對照組的腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達(dá)組的腫瘤體積縮小(均P<0.05)。見表4和圖3。

2.4 T-鈣黏蛋白對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系遷移和EMT的影響 與空白對照組比較，陰性對照組A172與 U251細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.01)；而與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達(dá)組A172與 U251細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)減少(均P<0.05)。見表5、表6、圖4A。

與空白對照組比較，陰性對照組A172與 U251細(xì)胞的T-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；與空白對照組、陰性對照組比較，T-鈣黏蛋白過表達(dá)組A172與 U251細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)水平降低，而T-鈣黏蛋白和E-鈣黏蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)。見表5、表6、圖4B。

表5 3組A172細(xì)胞的遷移能力和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況比較(x±s)

表6 3組U251細(xì)胞的遷移能力和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況比較(x±s)

2.5 上調(diào)T-鈣黏蛋白對膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療敏感性的影響 采用4 Gy、6 Gy劑量的γ射線進(jìn)行照射后，}黏蛋白過表達(dá)組U251和A172細(xì)胞存活率均低于其他兩組(均P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組細(xì)胞存活率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。由于采用6 Gy劑量照射時，3組細(xì)胞的存活率相對于其他劑量照射下更低，因此采用6 Gy劑量作為后續(xù)實驗的照射劑量。采用6 Gy劑量的γ射線進(jìn)行照射后，T-鈣黏蛋白過表達(dá)組A172和 U251細(xì)胞克隆形成率均低于其他兩組(均P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組細(xì)胞克隆形成率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表7、表8、圖5。

表7 γ射線照射后3組A172細(xì)胞的存活率和相對克隆數(shù)比較(x±s)

表8 γ射線照射后3組U251細(xì)胞的存活率和相對克隆數(shù)比較(x±s)

3 討 論

近年來，隨著臨床醫(yī)療水平的提高，惡性膠質(zhì)瘤的治療也取得了一定的進(jìn)展。手術(shù)可以最大范圍地切除腫瘤，能夠緩解惡性膠質(zhì)瘤患者的臨床癥狀；術(shù)后放療可抑制殘余腫瘤細(xì)胞的生長，同時輔助化療可以延長患者的生存期[11-12]。但是從目前的實際臨床情況來看，惡性膠質(zhì)瘤患者術(shù)后2年生存率仍然低于30%，預(yù)后情況仍不容樂觀[13]。放療在現(xiàn)有的序貫治療方案中起著主導(dǎo)作用，但是大多數(shù)惡性膠質(zhì)瘤存在放射抗性，導(dǎo)致放療效果較差[14-15]。因此，如何增強(qiáng)惡性膠質(zhì)瘤的放療敏感性，是改善惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后的突破口。

T-鈣黏蛋白基因定位于染色體16q24區(qū)域，該區(qū)域常會受到致癌性修飾。T-鈣黏蛋白基因編碼的蛋白則是負(fù)責(zé)選擇性細(xì)胞識別與黏附的一類細(xì)胞表面糖蛋白，近年來其與癌癥的相關(guān)性逐漸受到科研人員的關(guān)注[16]。本研究首先檢測了惡性膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中T-鈣黏蛋白 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平均低于正常腦組織及正常膠質(zhì)細(xì)胞(均P<0.05)，同時免疫組化結(jié)果也提示惡性膠質(zhì)瘤組織的T-鈣黏蛋白陽性率低于正常腦組織(P<0.05)；通過對膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生存情況進(jìn)行隨訪，還發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤組織T-鈣黏蛋白表達(dá)陰性患者的預(yù)后差于T-鈣黏蛋白表達(dá)陽性患者(均P<0.05)。以上結(jié)果提示T-鈣黏蛋白表達(dá)的缺失可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及預(yù)后有關(guān)。Kong等[17]通過隨訪三陰性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存期與5年整體生存率，亦發(fā)現(xiàn)T-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)是患者預(yù)后的獨立危險因素。雖然該研究與本研究的癌癥類型不同，但結(jié)果呈現(xiàn)出相似性。

Wang等[18]報告T-鈣黏蛋白可能在口腔鱗癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用，過表達(dá)T-鈣黏蛋白可以通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖。Lu等[19]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)T-鈣黏蛋白可以抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的遷移、侵襲及EMT行為。Lu等[20]還發(fā)現(xiàn)，T-鈣黏蛋白表達(dá)的上調(diào)能阻止膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的EMT，從而抑制其轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果均表明，上調(diào)T-鈣黏蛋白表達(dá)能抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

本研究進(jìn)一步通過體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞系實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)T-鈣黏蛋白后惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力降低，凋亡率升高，體外成瘤體積減小，遷移能力降低，同時E-鈣黏蛋白表達(dá)水平升高，而波形蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)。而E-鈣黏蛋白與波形蛋白是EMT活動的標(biāo)志蛋白，EMT的特征表現(xiàn)為E-鈣黏蛋白表達(dá)減少、波形蛋白表達(dá)增加[21-22]。因此本研究的結(jié)果表明T-鈣黏蛋白過表達(dá)可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、EMT行為。

細(xì)胞間黏附增強(qiáng)，可以防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，對于抑制癌癥進(jìn)展和減輕放療抗性有著重要意義[23]。而鈣黏蛋白家族分子可以介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，其表達(dá)水平可能影響癌細(xì)胞的脫離與附著，其中T-鈣黏蛋白作為鈣黏蛋白家族中一類非經(jīng)典黏附分子，與E-鈣黏蛋白等經(jīng)典鈣黏蛋白分子不同的是，它不具備可經(jīng)糖基磷脂酰肌醇的跨膜區(qū)，但是仍然能介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附[24]。最后，本研究分析了T-鈣黏蛋白過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療敏感性的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)6 Gy的γ射線照射處理后，T-鈣黏蛋白過表達(dá)組的細(xì)胞存活率及相對克隆數(shù)亦較空白對照組和陰性對照組降低(均P<0.05)。這表明T-鈣黏蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮著抑癌與放射增敏的效果，但具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，T-鈣黏蛋白在惡性膠質(zhì)瘤中呈異常低表達(dá)狀態(tài)，過表達(dá)T-鈣黏蛋白能發(fā)揮抑癌作用，降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力，且能增強(qiáng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性，使得患者獲得更好的預(yù)后。T-鈣黏蛋白有望成為治療膠質(zhì)瘤的靶點之一，未來需要通過進(jìn)一步的機(jī)制研究來證實本研究結(jié)論。