王春霞 王 飛 劉 歡

（延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 陜西延安 716000）

馬鈴薯作為世界第4大糧食作物，其地位僅次于玉米、小麥和水稻[1]。從2016年開始，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部就將馬鈴薯主糧化作為推動(dòng)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵策略提上日程，以期解決新形勢(shì)下我國(guó)糧食安全戰(zhàn)略的部署。馬鈴薯因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐旱、抗寒、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，在延安地區(qū)的種植歷史比較悠久。馬鈴薯是延安市僅次于玉米的第2大糧食作物，連年種植面積達(dá)5萬(wàn)hm2，是陜西省種植馬鈴薯的第2大市[2]，且馬鈴薯產(chǎn)業(yè)在陜西省農(nóng)業(yè)發(fā)展中也占有重要地位[3]。近些年，隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，種植面積也越來越大，馬鈴薯各種病蟲害的發(fā)生也逐年增多、加重，真菌性病害馬鈴薯鐮刀菌根腐病普遍發(fā)生在馬鈴薯的生長(zhǎng)期和儲(chǔ)藏期，其為害部位主要為馬鈴薯苗期的根莖部、根部及儲(chǔ)藏期的薯塊，不僅在一定程度上制約著馬鈴薯的產(chǎn)量，影響經(jīng)濟(jì)效益，也對(duì)馬鈴薯儲(chǔ)藏期的品質(zhì)存在一定的影響，已經(jīng)成為限制延安地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一[4]。因此，本研究通過病原菌分離培養(yǎng)、致病性鑒定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，明確了延安市馬鈴薯鐮刀菌根腐病病原菌的種類，以期為該病害的發(fā)生、防治提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年在延安市地區(qū)采集具有典型鐮刀菌根腐病癥狀的馬鈴薯根莖，標(biāo)記好采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、采集人員等基礎(chǔ)信息，帶回實(shí)驗(yàn)室用于病原菌的分離。試驗(yàn)所需試劑包括Biospin真菌基因組DNA提取 試 劑 盒、ddH2O、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker、Gelstain和50×TAE電泳緩沖液等；主要儀器包括恒溫光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、PCR儀、電泳儀、低溫冷凍離心機(jī)等；用于分離病原菌的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 采用組織分離法對(duì)采集到的馬鈴薯患病樣本進(jìn)行分離[5]，將分離到的鐮刀菌用單孢分離法對(duì)其進(jìn)行純化，然后將純化后的菌株轉(zhuǎn)接在PDA培養(yǎng)基上，根據(jù)顯微鏡下病原菌孢子的形態(tài)特征，參考《鐮刀菌屬》[6]一書進(jìn)行病原菌形態(tài)學(xué)的初步鑒定。

1.2.2 致病性測(cè)定 根據(jù)柯赫氏法則[4]，采用馬鈴薯根部切傷接種法檢測(cè)分離到的病原菌的致病性[7]。先將在花盆中長(zhǎng)至高約20cm的馬鈴薯的根基部用消過毒的小刀劃出傷口，然后將配制好的茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的菌懸液澆注到馬鈴薯的傷病處，以澆注清水作為對(duì)照，后期進(jìn)行正常的澆水、施肥管理，待根基部或根部出現(xiàn)明顯病斑時(shí)再分離病原菌，確定其致病性。

1.2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定 分離到的病原菌DNA用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取，后利用鐮刀菌屬特異性引物EF-1α序列[4]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后將擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得最近似的鐮刀菌序列，以及其他種類的鐮刀菌序列，利用MEGA 5.20分析軟件采用NJ法構(gòu)建馬鈴薯鐮刀菌根腐病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析比較分離到的菌株與其他菌株間的親緣關(guān)系，確定菌種類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

2021年起在延安市8個(gè)市縣區(qū)進(jìn)行馬鈴薯鐮刀菌根腐病的調(diào)查及對(duì)病樣的采集，在延安市采集的薯塊上分離到3株病原菌，標(biāo)記為S1-1、S1-2和S1-5；在子長(zhǎng)市的馬鈴薯莖基部分離到5株病原菌，標(biāo)記為S2-1、S2-2、S2-3、S2-4和S2-6；在志丹縣的馬鈴薯根部上分離到2株病原菌S3-1和S3-2，在薯塊上分離得到S3-4和S3-5菌株；在吳起縣的薯塊上分離到S4-1和S4-3菌株；在安塞區(qū)的薯塊上分離到S5-1、S5-2和S5-3菌株；在延長(zhǎng)縣馬鈴薯莖基部分離到S6-1菌株；在延川縣的馬鈴薯莖基部分離到S7-2菌株；在富縣的薯塊上分離到S8-1菌株（附表）。從20株菌株的分離部位上來看，大多數(shù)病原菌是從馬鈴薯患病薯塊和莖基部病斑上分離的，只有2株菌株是從根部的病斑上分離的。

附表 病原菌菌株編號(hào)及分離部位

2.2 病原菌株的形態(tài)特征

通過觀察PDA培養(yǎng)基上各個(gè)菌落的形態(tài)特征，初步將分離到的菌株分為2類，進(jìn)一步通過顯微觀察其小型分生孢子、大型分生孢子及產(chǎn)孢梗等的形態(tài)特征，以編號(hào)為S5-2的一類菌株，小型分生孢子較多，形狀多為卵形或橢圓形，具分隔，但大多數(shù)無隔；大型分生孢子整體偏平直，中間稍彎曲，頂胞比較尖，基胞足跟相對(duì)明顯，具分隔，多為5隔。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步將具有此類特征的菌株鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）（圖1左為尖孢鐮刀菌的大型分生孢子）。其次，以編號(hào)為S7-2的一類菌株，小型分生孢子普遍多，易產(chǎn)孢，以橢圓形和腎形為主，具有分隔；大型分生孢子普遍較少，形狀多為馬特形，兩端較圓，略微彎曲，具分隔，多為3隔。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步將具有此類特征的鐮刀菌鑒定為茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）（圖1右為茄病鐮刀菌的大型分生孢子和產(chǎn)孢梗）。

2.3 致病性鑒定

通過致病性測(cè)定結(jié)果，從接種后發(fā)病的馬鈴薯苗莖基部的病健交界處重新分離得到的鐮刀菌菌株，其菌株形態(tài)與接種鐮刀菌的形態(tài)相符，因此得以證明實(shí)驗(yàn)初從所采集的病樣上分離到尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌菌株都具有致病性。

2.4 分子鑒定

通過EF-1α引物對(duì)分離到的20株鐮刀菌進(jìn)行序列測(cè)定，獲得長(zhǎng)度721～752 bp之間的序列，后用NJ法構(gòu)建馬鈴薯鐮刀菌根腐病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。通過圖2可以看出，編號(hào)為S5-2、S4-3、S3-4、S8-1等6個(gè)菌株與尖孢鐮刀菌 （Fusariumoxysporum）KJ647280.1和JQ965436.1的同源性達(dá)到97%，又與編號(hào)為S1-1、S3-1、S2-4、S1-5等8個(gè)菌株同源性達(dá)到96%，說明這一類的14株鐮刀菌均為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）。編號(hào)為S7-2的菌株與茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）KP143718.1的同源性為98%，與編號(hào)為S6-1、S3-2、S5-1等5個(gè)菌株的同源性為97%，說明這一類的6株鐮刀菌為茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）。因此認(rèn)為，分離到的20株鐮刀菌，14株鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum），6株鑒定為茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）。分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果同形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致，說明在鐮刀菌的鑒定上形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)能夠很好的將鐮刀菌鑒定到種的水平上。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯作為我國(guó)的第4大糧食作物，具有糧蔬飼兼用的特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)發(fā)展中有著很高的經(jīng)濟(jì)效益[8]。延安市作為陜西省馬鈴薯種植的主產(chǎn)區(qū)之一，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)正朝著高質(zhì)量的方向飛速發(fā)展，但隨著種植面積的增加，不輪作、不倒茬成為馬鈴薯種植者種植馬鈴薯的常態(tài)化運(yùn)作，導(dǎo)致土傳病害在馬鈴薯上發(fā)生越來越重，防治越來越難。

根據(jù)相關(guān)調(diào)查，馬鈴薯鐮刀菌根腐類病在陜西省也呈現(xiàn)逐年加重的態(tài)勢(shì)，如何高效防治鐮刀菌根腐類病害的發(fā)生，首先是要明確引起該類病害的致病病原菌種類，因此病原菌的分離鑒定成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)上亟需解決的關(guān)鍵技術(shù)問題，有關(guān)引起馬鈴薯鐮刀菌根腐類病的研究報(bào)道較多，楊波等[9]對(duì)引起青海地區(qū)馬鈴薯鐮刀菌根腐病的病原菌進(jìn)行了分離鑒定研究，認(rèn)為三線鐮刀菌（Fusariumtricinctum）、尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）等6種鐮刀菌是主要的致病病原菌；王喜剛等[7]的研究認(rèn)為，引起寧夏地區(qū)馬鈴薯根腐病的主要病原鐮刀菌為接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）和茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）；李金花等[10]的研究表明，接骨木鐮刀菌（Fusariumsambucinum）和茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）同樣是引起甘肅省馬鈴薯根腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌。不同地區(qū)由于地理環(huán)境等的差異導(dǎo)致引起該病害的病原菌也不同，本試驗(yàn)通過對(duì)延安馬鈴薯產(chǎn)區(qū)鐮刀菌根腐病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定、分子學(xué)鑒定及致病性測(cè)定，初步認(rèn)定了尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）和茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）是引起該病害的主要致病病原菌。延安市馬鈴薯產(chǎn)區(qū)尚未報(bào)道有由真菌鐮刀菌引起的馬鈴薯根腐病的病原鑒定，通過本試驗(yàn)首次確定了引起延安馬鈴薯產(chǎn)區(qū)鐮刀菌根腐病的致病病原菌的種類，為后期防治馬鈴薯鐮刀菌根腐病提供科學(xué)依據(jù)，能夠做到有針對(duì)性的防、有的放矢的治。