李佳佳，徐翎清，趙 陽，芮秀麗，石俊婷，劉大麗

（1國家甜菜種質(zhì)中期庫/黑龍江大學，哈爾濱 150080；2黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

植物生長依賴于無機氮，據(jù)報道，全世界每年向土壤中添加約8500萬～9000萬t氮肥[1]。人們試圖通過施加大量的氮肥來實現(xiàn)作物高產(chǎn)，但事實上只有30%～40%的氮素會被植物吸收利用[2]。隨之而來的是，未被利用的釋放到環(huán)境中的含氮化合物會造成環(huán)境污染，如土壤酸化、土壤硬化或水的富營養(yǎng)化等[3]。那么，如何適量施氮，如何提高氮肥的有效利用率，如何在較低的氮水平下維持作物的正常生長，是急需解決的問題。因此，研究農(nóng)作物在低氮脅迫下的響應機制是十分必要的。同時，植物對低氮脅迫氮代謝過程中的響應過程和適應機制也一直是學術研究的熱點領域。提高氮肥的使用效率和限制氮肥的過度使用是保護環(huán)境和改善可持續(xù)生產(chǎn)性農(nóng)業(yè)的一個重要挑戰(zhàn)。

1 氮代謝概述

1.1 氮代謝概念

氮代謝是指氮的吸收、還原、氨基酸的代謝和運輸，以及氮的轉運和再利用等過程。它是植物的基本生理過程之一，也是植物參與地球化學循環(huán)的重要組成部分[4]，對于植物抵抗逆境脅迫具有重要的意義。氮代謝與植物的生長和發(fā)育以及產(chǎn)量密切相關。

1.2 低氮脅迫過程中的氮素同化途徑

氮的吸收、同化和再活化的分子機制已被廣泛研究。植物對氮素的利用，包括吸收、易位、同化等過程，并受到遺傳和環(huán)境因素等多種因素的控制[5]。植物氮的同化取決于谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶循環(huán)(GS/GOGAT)以及可用的能量和碳骨架。當?shù)蛔銜r，植物的光合作用和呼吸作用受阻，植物自身補償機制被相應的激活[6]。CURCI等[2]發(fā)現(xiàn)，在低氮脅迫下，參與小麥光合作用和光呼吸的大多數(shù)基因均被下調(diào)，包括光系統(tǒng)(PSI)、光系統(tǒng)(PSII)、ATP合酶和Rubisco(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygen ase)。研究表明，在低氮脅迫下，由于細胞色素中心吸收的激發(fā)能被耗散，PSII光化學效率隨之降低[6]。低氮水平下，氮通過三羧酸循環(huán)同化進入氨基酸代謝途徑，細胞質(zhì)和線粒體經(jīng)呼吸途徑氧化產(chǎn)生更多的2OG(2-oxoglutarate)[7]，為銨的再同化提供GS/GOGAT循環(huán)[8]，來增強水稻對低氮脅迫的適應能力[9]。LAURENT等[10]也發(fā)現(xiàn)低氮脅迫時，2-OG可以在細胞內(nèi)短暫積累，并作為氮缺乏時的信號。為達到最佳的氮同化速率，植物需要較高的光呼吸速率，通過葉綠體被膜或線粒體的蘋果酸/草酰乙酸循環(huán)加強向細胞膜的氧化還原轉移[7]。研究發(fā)現(xiàn)，呼吸速率與植物氮濃度呈正相關[11]。植物線粒體呼吸作用的底物供應與光合作用產(chǎn)生的碳水化合物有關[11]。硝酸鹽還原酶(NR)和亞硝酸鹽還原酶(NiR)將植物細胞吸收的NO3-還原成NH4+，在質(zhì)體或葉綠體中被GS/GOGAT循環(huán)同化為谷氨酸。PSII還可以與2-OG形成復合物，并通過蛋白-蛋白相互作用相應地調(diào)節(jié)氮的同化[12]。其基本過程如圖1所示。此外，研究還發(fā)現(xiàn)擬南芥和黃瓜在低氮脅迫下，參與光合作用的相關基因顯著下調(diào)，進一步說明了光系統(tǒng)對低氮脅迫十分敏感[13-14]。

圖1 植物體內(nèi)基本氮代謝途徑

2 植物應對低氮脅迫的研究進展

2.1 外部形態(tài)

根系不僅是植物吸收營養(yǎng)和水分的重要器官，也是植物激素和有機酸等許多物質(zhì)的同化、轉化和合成的重要場所[15]。當施入的養(yǎng)分不能滿足植株生長要求時，植株本身會根據(jù)需要的氮量調(diào)整其根系結構，作為生存策略的一部分來應對生境變化[16]。JU等[17]認為氮高效水稻品種的根系生物量更大，根分布更深，更長，根密度更大。輕度缺氮可促進根系生長，有利于根系深層滲透；適當供氮可增加根系數(shù)量、生物量和密度；但過量供氮可抑制根系生長[18-19]。拓撲結構可以將根系分為很多類型，比如人骨類型，其只包含主軸和側根的分支模式[20]。缺氮的幼苗會將其原有拓撲結構轉化為二分體狀根系[21]，具有短、細、高發(fā)育等級的側根[20]。本課題組前期等發(fā)現(xiàn)低氮脅迫會使甜菜植株生長勢弱，不定根數(shù)量增多，葉色黃綠且薄，且推斷甜菜可以通過改變根系構型和根系比例來獲得氮素平衡[22]。

2.2 氮代謝相關酶

（1）硝酸還原酶

硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)是植物氮同化的第一關鍵酶，它可以直接調(diào)控硝酸鹽的還原[23]，其活性高低與植物自身氮同化能力密切相關，因此NR的活性越強，植物的氮素代謝也越旺盛[24]。NR還是光合自養(yǎng)生物體內(nèi)的一種誘導酶[25]，光可誘導NR磷酸化，光度降低會導致NR活性迅速下降，進而降低植物對硝酸氮的吸收和同化[26]。低氮脅迫下，NR活性高的植株其耐低氮的能力較強[27]。高活性NR對植物生長發(fā)育和產(chǎn)量有積極的影響。

（2）谷氨酰胺合成酶

谷氨酰胺合成酶(GS)廣泛存在于所有生物中，它利用ATP水解到ADP釋放的能量催化氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，是生物氮代謝的另一關鍵酶[28]，在低氮脅迫中發(fā)揮重要作用。谷氨酰胺合成酶主要以兩種不同亞細胞定位的同工酶形式存在：細胞質(zhì)GS1和葉綠體/質(zhì)體GS2[29]。GS1對植物正常的生長發(fā)育十分重要[30]，GS2對葉綠體中N的光呼吸代謝十分重要[31]。GS在植物氮代謝途徑中的關鍵作用已得到較為深入的研究，總體表現(xiàn)為不同的同工酶表達類型和生物學功能[32]。大量研究表明，GS可以調(diào)節(jié)植物的含氮量，間接影響光合作用和生理代謝，從而影響生長發(fā)育以及作物產(chǎn)量和品質(zhì)[33]。

（3）谷氨酸合成酶

谷氨酸合成酶(glutamate synthase，GOGAT)是氨同化途徑中的一種關鍵酶，能夠與GS結合，完成氨同化。在高等植物中，主要的GOGAT同工酶是非光合作用組織中的NADH-GOGAT和光合作用組織中的鐵氧化還原蛋白-GOGAT(Fd-GOGAT)[5]。后者占GOGAT總活性的95%，在植株葉片中處于主導地位[32]。Fd-GOGAT存在于葉綠體中，光誘導其生物合成，并同時與光合作用和光呼吸密切相關[34]。研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫時草地早熟禾的NADH-GOGAT基因的表達量會增多[35]。GOGAT基因的表達受氮素、光照、作用部位等多種因素的影響[36]。

（4）谷氨酸脫氫酶

谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)是生物體中的一種多聚酶[37]。由于GDH催化的氨基酸脫氨作用產(chǎn)生2-酮戊二酸進入GS/GOGAT循環(huán)以提供底物，因此GDH在GS/GOGAT循環(huán)中起補償[38]以及緩解銨中毒的作用[39]。GDH可以催化谷氨酸的合成，增加脯氨酸的數(shù)量，來提高植物的耐逆性[40]。

2.3 低氮脅迫對植物體初級代謝的影響

碳、氮代謝是植物最基本的兩條代謝途徑[41]。植物碳氮代謝的動態(tài)變化直接影響著光合產(chǎn)物的形成和轉化，以及礦質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和蛋白質(zhì)的合成。氮是葉綠素分子的重要組分。氮的減少會導致基質(zhì)蛋白和類囊體蛋白的減少，抑制葉綠素的合成，從而影響光合作用[42]。通過光合作用對氮的吸收和同化[43]，確保了氮的吸收與碳的狀態(tài)相關。碳代謝為氮代謝提供了碳源和能量[44]，而氮代謝為碳代謝提供了酶和光合色素。植物的碳氮代謝彼此密切協(xié)調(diào)[45]，需要共同的還原力、ATP和碳骨架[46]。

維持碳氮代謝的協(xié)調(diào)，以及碳水化合物與氮代謝物的適當平衡，也被稱為“C/N平衡”，對植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)量非常重要[47]。RuBisCo占C3植株葉片中可溶性蛋白總量的50%，占C4植株葉片中總量的20%[48]。在C3植物中，RuBisCo的氧化導致二氧化碳和光呼吸氨的釋放[49]。研究發(fā)現(xiàn)RuBisCo和2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)分別作為碳和氮饑餓信號[10]，它們的濃度比可能間接反映C/N代謝平衡的狀態(tài)[50]。光呼吸和三羧酸循環(huán)(TCA)不僅是重要的代謝途徑，而且在C/N代謝控制的信號傳導中起關鍵作用[50]。XIN等[9]發(fā)現(xiàn)，TCA循環(huán)可以使各種氨基酸的氮分配趨向合理，可提供更多的2-OG為GS/GOGAT循環(huán)提供NH4+，從而增強水稻對低氮脅迫的適應能力。在長時間缺氮條件下，由于RuBisCo的分解，光合活性下降，葉片衰老普遍加速，植物生長最終受到抑制[51]。雙標記(13C/15N)硝酸銨和核磁共振(NMR)分析表明，甘藍型油菜用于白天GS/GOGAT合成的α-酮戊二酸(2-OG)來源于夜間儲存的有機酸（可能是蘋果酸或檸檬酸），因此碳代謝對氮同化具有重要意義[52]。ABC1/OsFd-GOGAT通過調(diào)節(jié)氮同化和C/N平衡，在水稻的生長發(fā)育中發(fā)揮著至關重要的作用[8]。因此，調(diào)控碳氮平衡可以促進含碳、氮營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、同化和代謝效率，對提高低氮水平下作物產(chǎn)量具有指導意義。

2.4 低氮脅迫對植物體次級代謝的影響

當植物受到非生物脅迫時，體內(nèi)會積累活性氧物質(zhì)(ROS)，并對植物細胞造成嚴重損害。然而，植物可以通過非生物脅迫誘導的抗氧化酶系統(tǒng)和次生代謝產(chǎn)物來消除過量的ROS，從而保護植物免受脅迫。苯丙烷代謝途徑是重要的次級代謝途徑之一。苯丙烷代謝物的生物合成和多樣性是通過加氧酶、氧化還原酶、連接酶以及多種轉移酶實現(xiàn)的，這些酶可通過酰化、甲基化、糖基化和羥基化對代謝物的基本骨架進行化學修飾[53]。苯丙氨酸的合成來源于莽草酸，莽草酸是高等植物次生代謝的起始物[54]，合成許多重要的芳香代謝物。因此，苯丙烷代謝途徑跨越初級代謝和次級代謝的邊界，并引導代謝通量從初級代謝轉向次級代謝[55]。苯丙烷類衍生物代謝途徑有兩條重要的子途徑：木質(zhì)素生物合成途徑和類黃酮生物合成途徑[56]。

類黃酮代謝是苯丙素代謝的一個重要分支，產(chǎn)生了最大的一類多酚類代謝物，大約包含6000多個化合物[57-58]，并可受到C代謝誘導[59]。黃酮類化合物是花、果實和種子的主要著色物質(zhì)，在植物生長和植物-環(huán)境相互作用中起著重要作用[60]，且分布廣泛，可作為抗氧化劑、抗菌物質(zhì)、植物與細菌、光受體、色素相互作用中的信號分子[61-62]。研究發(fā)現(xiàn)，在豆科植物中，缺氮可誘導黃酮類化合物和異黃酮類化合物作為信號，抑制Nod因子生物合成相關基因的轉錄[63]。SiWLIM2b基因的表達可以通過增加其次級代謝產(chǎn)物類黃酮的含量來影響苯丙烷次級代謝途徑，從而增強轉基因水稻的抗旱性[64]。在茶和苜蓿中，bHLH35與苯丙氨酸生物合成和類黃酮生物合成途徑中的許多基因表達呈正相關[65-66]。

苯丙素代謝途徑與木質(zhì)素的合成密切相關[67]，而木質(zhì)素的生物合成途徑與光合碳的利用密切相關[68]。木質(zhì)素等苯丙類聚合物是植物生長的機械支撐，促進水和營養(yǎng)物質(zhì)的長距離運輸[69]。它們還有助于植物對非生物和生物脅迫的應答，并促進昆蟲作為授粉和種子傳播媒介的吸引[70]。在低氮條件下，光合作用中的碳可以通過糖酵解或磷酸戊糖途徑(PPP)轉移到木質(zhì)素的合成中[9]。因此，苯丙烷代謝物對植物的生長發(fā)育至關重要。

2.5 氮代謝相關基因參與低氮脅迫的研究進展

WRKY是水稻中對氮缺乏反應最強烈的轉錄因子家族之一，研究發(fā)現(xiàn)，水稻中有12個WRKY家族成員在葉鞘中誘導表達[71]。而低氮脅迫下，WRKY在馬鈴薯幼芽中卻呈現(xiàn)下調(diào)表達[72]。因此WRKY作為傳遞氮脅迫耐受的關鍵因子，其參與的信號網(wǎng)絡十分復雜，并在植物脅迫反應中起著重要的調(diào)節(jié)作用。LIANG等[73]發(fā)現(xiàn)，在缺氮水平下，參與苯丙烷生物合成和谷胱甘肽代謝途徑的相關基因發(fā)生顯著變化，如氮 轉 運 體（NRT2.1、NRT2.2、NRT2.3、NRT2.4、NAR2.1、AMT1.3、AMT1.2和推測的AMT3.3）和氮同化體（NR2、GS1.1、GS1.2、GS1.3、NADH-GOGAT2和AS2）。SULTANA等[74]研究發(fā)現(xiàn)，小麥在氮脅迫下，下調(diào)的差異表達基因DEGs主要與碳水化合物代謝過程、光合作用、光捕獲和防御反應有關，而上調(diào)的DEGs與核苷酸代謝、蛋白質(zhì)水解和跨膜轉運有關。氮饑餓條件導致根系總氮含量顯著降低，在高親和力的NRTs中，與擬南芥NRT2.5同源的基因在硬粒小麥中顯著上調(diào)[2]。作為基因表達的調(diào)控元件，轉錄因子在外部環(huán)境中的氮濃度感知、氮信號轉導和氮代謝的調(diào)控途徑中發(fā)揮著重要作用。

3 展望

本研究綜述了植物在應對低氮脅迫過程中所表現(xiàn)的形態(tài)、生理以及分子等方面的響應機制。為了提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)性，適量的氮肥可以改善寒冷地區(qū)鹽堿地土壤的理化性質(zhì)，促進土壤微生物的生長，從而改善土壤質(zhì)量。這種高效的“資源利用效率”需要對植物生理、植物吸收能力、植物代謝、植物對脅迫的響應以及土壤物理和化學性質(zhì)等方面進行深入的研究。隨著高通量測序技術、高分辨率質(zhì)譜技術和信息處理技術的發(fā)展和應用，系統(tǒng)生物學研究已占據(jù)探索重要生物現(xiàn)象的主導地位。因此，本研究提出幾點植物面臨缺氮條件下未來的研究方向：（1）植物在低氮條件下的代謝網(wǎng)絡不僅錯綜復雜，而且在植物之間、同一植物的不同生長期都存在著顯著的差異；（2）轉錄組學已成為后基因組時代研究植物抗性最主要的學科之一。轉錄組學研究已經(jīng)鑒定出大量基因在低氮脅迫下mRNA表達水平發(fā)生改變，但這些基因的表達產(chǎn)物之間的關系有待進一步研究；（3）科學家們可以從轉錄組學、功能基因組學、遺傳學、生態(tài)生理學和土壤科學等角度來突破，系統(tǒng)研究植物對逆境脅迫后各種指標的變化，以期全面了解植物對低氮脅迫的分子響應機制。