張 瓊，王錦霞,3，孟詩琪，鐘鑫愛，劉大麗，興 旺

（1國家甜菜種質(zhì)中期庫，黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)省高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；3黑龍江大學(xué)省高校生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris L.)不僅是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是世界范圍內(nèi)常用的糖料作物之一，屬二年生草本植物，作為一種喜溫、耐寒、抗旱且耐鹽堿的植物，在中國的黑龍江省、內(nèi)蒙古自治區(qū)以及新疆維吾爾自治區(qū)種植較廣。按其用途可以分為糖用甜菜、飼用甜菜和食用甜菜。糖用甜菜是一種制糖作物，通過榨取甜菜塊根獲取糖分；飼用甜菜營養(yǎng)豐富、適口性好，是飼喂家畜的優(yōu)質(zhì)多汁類飼料，合理飼喂可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和繁殖性能[1]。食用甜菜多為營養(yǎng)豐富的紅甜菜，其葉片中含有較多的纖維、鈉、鎂、類黃酮和較高的維生素C含量，而莖中的鉀含量較高[2]。除此之外，甜菜還具有生產(chǎn)燃料乙醇、甜菜堿等功能，且成本低廉、能量效率化，可以成為規(guī)?；⒐I(yè)化、商業(yè)化的優(yōu)質(zhì)原料。

伴侶蛋白，也稱之為分子伴侶，是一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，他們在細(xì)胞內(nèi)幫助其他含有多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝。在植物生長發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)的合成和修飾導(dǎo)致近三分之一的新生蛋白質(zhì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，特別是細(xì)胞內(nèi)外的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)數(shù)量的增加，從而使細(xì)胞器內(nèi)的穩(wěn)態(tài)失衡。植物遭受鹽分、干旱之類的脅迫和病原體攻擊等，都會(huì)引起細(xì)胞器的應(yīng)激[3]。植物具有專門的應(yīng)激反應(yīng)或未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)信號通路，以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)細(xì)胞器特異性分子伴侶，并減少駐留蛋白質(zhì)折疊機(jī)制上的蛋白質(zhì)折疊負(fù)荷[4]。如，為應(yīng)對功能障礙，線粒體進(jìn)化出了一種被稱為線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(UPRmt)的應(yīng)激機(jī)制，將線粒體蛋白質(zhì)折疊環(huán)境的狀態(tài)與線粒體伴侶基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)合起來，引發(fā)伴侶基因的上調(diào)表達(dá)。其中mtHSP70和HSP60可以有效幫助線粒體蛋白的正確折疊，從而重建細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊時(shí)，UPR會(huì)誘導(dǎo)HSP40、ERdj3、DNAJB11和HSP70伴侶蛋白的表達(dá)，從而修復(fù)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)[6]。

多項(xiàng)研究表明，熱激蛋白家族(heat shock proteins,HSPs)是最為常見的分子伴侶之一，可作用于植物各個(gè)細(xì)胞器，多種應(yīng)激反應(yīng)及植物的不同發(fā)育階段均有相應(yīng)的表達(dá)。水稻在氧化應(yīng)激下，HSP60的過量表達(dá)可以避免Fe/S酶釋放Fe2+，保護(hù)其不被氧化，在植物抵抗氧脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7]。HSP20以ATP依賴的方式阻止非天然蛋白質(zhì)的聚集，并維持其穩(wěn)定[8]。果實(shí)發(fā)育階段的葡萄在H2O2脅迫下，HSP20表達(dá)下降，說明植物在發(fā)育階段也可以誘導(dǎo)分子伴侶的表達(dá)，促進(jìn)植物的種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育等[9]。

熱激蛋白，也叫熱休克蛋白，是一類進(jìn)化保守的多肽，從細(xì)菌到人體中均有表達(dá)[10]。熱休克蛋白根據(jù)其分子量分為兩類，即高分子量熱休克蛋白(HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和HSP40)和低分子量熱休克蛋白(sHSP)[11]。熱激蛋白最早在果蠅幼蟲唾液腺染色體中發(fā)現(xiàn)，并在熱激條件下表達(dá)[12]。TISSIERES等[13]通過設(shè)計(jì)對照試驗(yàn)并采用SDS凝膠電泳技術(shù)從果蠅的唾液腺中將這種蛋白分離出來，并命名為熱激蛋白，也被稱為熱休克蛋白。到了1979年，科學(xué)家BARNETT等[14]在對煙草以及豌豆的組織培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行熱激處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)模式類似動(dòng)物熱激蛋白的分子蛋白存在，為探究植物中的熱激蛋白奠定了一定的基礎(chǔ)。自此，熱激蛋白的研究正式進(jìn)入科研領(lǐng)域，隨后越來越多的研究結(jié)果表明熱激蛋白在高溫、干旱、氧化、重金屬等逆境下均能大量表達(dá)[15]。sHSP作為熱激蛋白家族中最重要的成員之一，廣泛參與生物體應(yīng)激反應(yīng)[16]。sHSP蛋白的特征是具有一條小的多肽鏈(16 k～42 kD)，序列包括保守的C端結(jié)構(gòu)域和差異性較大的N端，C端大約含有90個(gè)氨基酸，又稱α-晶體蛋白域(alpha crystallin domain，ACD)，這一α-晶體蛋白是小分子熱激蛋白發(fā)揮分子伴侶作用的關(guān)鍵[17]；根據(jù)N端氨基酸序列及胞內(nèi)定位可分為6個(gè)亞族，其中classI、classII和classIII可定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，其余3個(gè)亞族定位于質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體[18]。

近年來，由于全基因組序列測序的完成，已從多種植物中鑒定出小分子熱激蛋白，如擬南芥[19]、番茄[20]、水稻[21]和大豆[22]，但關(guān)于BvHSP18.2的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)試圖通過克隆BvHSP18.2，并對其進(jìn)行了相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步推測BvHSP18.2基因的生物學(xué)功能，為之后進(jìn)行甜菜小分子熱激蛋白的功能分析奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 甜菜品種為‘780016B/12優(yōu)’，由國家甜菜種質(zhì)資源中期庫提供。

1.1.2 引物序列 根據(jù)甜菜BvHSP18.2基因(LOC104 903994)的堿基序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的上下游擴(kuò)增引物。

上游：5’-ATGTCGCTAATTCCAAGCTT-3’；

下游：5’-TTAAGCAGAGATATCAATAGACTTG ACTTC-3’。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 取1 g甜菜葉片，置于已通過液氮充分預(yù)冷的研缽中，快速研磨，待研至粉末狀后使用Easypure Plant RNA Kit(TransGen)提 取 總 RNA。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量，通過超微量分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度。

1.2.2 BvHSP18.2基因的克隆 取1μg總RNA，以其為模板，利用TransScript ONE-Step gDNA Removal RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA（反轉(zhuǎn)錄條件為30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；4℃保存）。以cDNA為模板，利用BvHSP18.2基因的堿基序列設(shè)計(jì)上下游引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過反應(yīng)的條件為94℃，2 min；94℃，30 s；55℃，35 s；72℃，1 min；72℃，10 min；共30個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進(jìn)一步確定其濃度及純度。按照BvHSP18.2:pEASY-Blunt=2:1的摩爾比構(gòu)成的反應(yīng)體系，在25℃下連接，將目的基因連接到pEASY-Blunt載體上，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1中。利用X-gal以及Amp雙重篩選出陽性重組子。挑選陽性克隆提質(zhì)粒，利用BamHI和XhoI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。酶切鑒定的陽性結(jié)果送上海生工進(jìn)行測序鑒定，進(jìn)一步確定其正確性。

1.2.3 BvHSP18.2基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站中的ORF Finder、Blastp分別進(jìn)行開放閱讀框及編碼氨基酸分析及BvHSP18.2基因同源序列搜索。利用GSDS2.0分析BvHSP18.2基因外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。利用ProtParam tool、ProtScale分析BvHSP18.2的分子量、等電點(diǎn)等相關(guān)理化性質(zhì)及親疏水性。利用SOPMA、SWISS-MODEL分別對BvHSP18.2蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。利用SignalP-5.0 Server、TMpred預(yù)測BvHSP18.2信號肽的位置及跨膜結(jié)構(gòu)域。

利用NetPhos 3.1 server、Cell-PLoc2.0預(yù)測該蛋白的磷酸化位點(diǎn)及進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。整合BvHSP18.2的多序列比對結(jié)果，并利用MEGA11進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。利用PlantCARE在線工具分析該基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvHSP18.2基因的克隆

利用TRIZOL法提取甜菜葉片總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，28 S rRNA的亮度與寬度為18 S rRNA的兩倍左右（圖1A），說明提取的RNA較完整。以此RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因BvHSP18.2。取2μL PCR產(chǎn)物加6×loading buffer，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1B），結(jié)果表明：該擴(kuò)增片段與Genbank中的目的基因大小一致的位置上，且無雜質(zhì)拖帶現(xiàn)象，特異性擴(kuò)增效果較好。

將目的基因BvHSP18.2的擴(kuò)增片段與克隆載體pEASY-Blunt連接并獲取質(zhì)粒后，用BamHI與XhoI這兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，其酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在載體(3963 bp)和目的基因(962 bp)響應(yīng)的位置出現(xiàn)了條帶（圖1C）。陽性質(zhì)粒pEASY-Blunt-BvHSP18.2進(jìn)一步測序，確定了重組質(zhì)粒的正確性。

圖1 甜菜BvHSP18.2基因的克隆

2.2 BvHSP18.2基因結(jié)構(gòu)特征分析及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

ORF Finder分析結(jié)果顯示，BvHSP18.2基因序列全長為962 bp，編碼區(qū)長度477 bp，共編碼158個(gè)氨基酸。BvHSP18.2基因?yàn)檎蛐蛄?，位?號染色體上，含有1個(gè)外顯子，不含內(nèi)顯子。

運(yùn)用ProtParam可以計(jì)算蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，包括分子量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成、原子組成、消光系數(shù)、體內(nèi)半衰期、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)和總平均親水性等。BvHSP18.2蛋白分子式為C928H1466N266O284S6、分子量為21085.82 Da；理論等電點(diǎn)(Theoretical pI)為6.99，數(shù)值接近7，推測其為中性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為59.86，數(shù)值大于40，推測其為不穩(wěn)定性蛋白；X消光系數(shù)為0.783；其半衰期在酵母體內(nèi)大于20 h，大腸桿菌體內(nèi)大于10 h；脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為65.14；平均親/疏水系數(shù)為-0.906，推測其為親水蛋白。

2.3 BvHSP18.2的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SOPMA預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)顯示，BvHSP18.2蛋白的組成包含20.99%的α-螺旋，16.57%的延伸鏈，4.97%的β-轉(zhuǎn)角和57.46%的無規(guī)則卷曲，因此α-螺旋和無規(guī)則卷曲為該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。

為了驗(yàn)證上述BvHSP18.2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，利用SWISS-MODEL軟件對BvHSP18.2蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模（圖2），從圖中可以得知BvHSP18.2的主要結(jié)構(gòu)為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，與上述的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

圖2 BvHSP18.2的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 BvHSP18.2的親/疏水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)以及亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過分析蛋白質(zhì)序列的親疏水性輪廓，可以得到蛋白質(zhì)的抗原表位分析，同時(shí)也可以分析蛋白質(zhì)的折疊情況。如圖3所示，BvHSP18.2在118、119位點(diǎn)親水性最強(qiáng)，為-3.767，在第27位疏水性最強(qiáng)，數(shù)值為1.322；且整體親水性位點(diǎn)多于疏水性位點(diǎn)，因此親/疏水性預(yù)測結(jié)果表明該蛋白為親水蛋白。該蛋白無信號肽，不存在跨膜區(qū)域。NetPhos3.1Server磷酸化位點(diǎn)預(yù)測BvHSP18.2結(jié)果表明，該蛋白共有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，10個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。使用Cell-PLoc2.0對甜菜BvHSP18.2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示其生命活動(dòng)的主要場所在細(xì)胞質(zhì)。

圖3 BvHSP18.2親/疏水性預(yù)測

2.5 BvHSP18.2的多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析、進(jìn)化樹分析

多序列比對可以分析和確定目的基因的氨基酸序列中是否含有重要的功能位點(diǎn)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp同源檢索發(fā)現(xiàn)，BvHSP18.2的氨基酸序列與其他12種植物，分別是菠菜(Spinacea oleracea L.)、藜 麥 (Chenopodium quinoa W.)、冬 瓜 (Benincasa hispida(Thunb.)Cogn.)、甘薯(Ipomoea triloba(Lour.)Burkill.)、煙 草 (Nicotiana attenuata L.)、西 葫 蘆(Cucurbita pepo subsp.Pepo L.)、黃瓜(Cucumis sativus L.)、甜 瓜 (Cucumis melo L.)、苦 瓜 (Momordica charantia L.)、芙 蕖 (Nelumbo nucifera G.)、筍 瓜(Cucurbita Maxima D.)、油 橄 欖 (Olea europaea var.Sylvestris L.)的序列同源性較高（圖4）。

圖4 BvHSP18.2的多序列比對

利用MEGA11，采用最大似然法進(jìn)一步分析甜菜BvHSP18.2的進(jìn)化關(guān)系。通過比對可以發(fā)現(xiàn)甜菜BvHSP18.2與藜科的藜麥CqHSP17.8、菠菜SoHSP17.8的親緣關(guān)系最為相近（圖5）。與上述氨基酸序列同源性分析結(jié)果一致。

圖5 BvHSP18.2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.6 BvHSP18.2基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析

為探究BvHSP18.2基因的調(diào)控機(jī)制，通過NCBI獲取該基因起始密碼子上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，通過PlantCARE來預(yù)測其順式作用元件。預(yù)測結(jié)果顯示（表1），該基因上游調(diào)控序列中含有36個(gè)CAAT-box和34個(gè)TATA box，說明該區(qū)域是典型的真核生物核心啟動(dòng)子元件，且該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性較高。同時(shí)啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果顯示BvHSP18.2與光響應(yīng)相關(guān)的作用元件，如：AE-Box、AT1-motif、ERE、GT1-motif、TCCC-motif和TCT-motif等；同時(shí)還具有與MYB結(jié)合元件，可參與水楊酸和防御和應(yīng)激反應(yīng)等。

表1 BvHSP18.2基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

3 討論

本研究從甜菜體內(nèi)克隆獲得小分子熱激蛋白BvHSP18.2，其氨基酸大小為20.1 kDa，與GenBank數(shù)據(jù)大小一致，且該基因無內(nèi)含子。前人在對水稻、擬南芥的RNA進(jìn)行序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，無內(nèi)含子的基因在干旱脅迫、鹽脅迫中更敏感，且有可能參與到植物的表觀遺傳和發(fā)育過程[23]。BvHSP18.2不穩(wěn)定系數(shù)為59.86，數(shù)值大于40，推測其為不穩(wěn)定性蛋白，而不穩(wěn)定性被認(rèn)為是應(yīng)激蛋白共同的特征，也可反映BvHSP18.2基因的快速誘導(dǎo)特性。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示BvHSP18.2主要在細(xì)胞質(zhì)中行使其功能，與孫愛清等[24]通過試驗(yàn)分析出的玉米ZmHSP17.7定位一致，但藍(lán)莓VcHSP17.7經(jīng)亞細(xì)胞定位預(yù)測位于細(xì)胞核[25]，甘蔗SoHSP20位于葉綠體[26]，黃瓜CsHSP20位于線粒體[27]。

BvHSP18.2與其他sHSP的多序列比對結(jié)果表明，該基因具有高保守的ACD結(jié)構(gòu)域，與番茄、擬南芥等多種植物的sHSP的相關(guān)報(bào)道具有一致性。ACD結(jié)構(gòu)域可能與一種多聚復(fù)合物的形成相關(guān)，這些復(fù)合物被認(rèn)為與sHSP的分子伴侶活性具有重要的關(guān)系[28]。系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果顯示，BvHSP18.2與藜科植物的親緣關(guān)系更為親近，藜麥[29]、菠菜[30]的熱休克蛋白在熱處理過程中都表現(xiàn)出顯著的上調(diào)，推測BvHSP18.2可能在植物遭受熱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

sHSP基因家族在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)中起著重要作用。至今，已在多種植物中成功擴(kuò)增獲得sHSP基因，如擬南芥中存在有19個(gè)小分子熱激蛋白基因，水稻基因組中則有23個(gè)小分子熱激蛋白基因。sHSP基因可作用于植物生長的各個(gè)時(shí)期以及不同的環(huán)境脅迫中[31]，如，在熱脅迫、鹽脅迫和干旱等非生物脅迫條件下，馬鈴薯sHSP基因亞家族表現(xiàn)出異質(zhì)性表達(dá)模式[32]；在鹽脅迫中sHSP基因也表現(xiàn)出了一定的作用，位于紫花苜蓿線粒體中的小分子熱激蛋白基因(MsHSP23)在真核和原核模型系統(tǒng)中的過度表達(dá)增強(qiáng)了紫花苜蓿對鹽和砷脅迫的耐受性[33]；玉米ZmHSP17.7基因可受高溫快速誘導(dǎo)[24]；在番茄不同發(fā)育階段sHSP基因均發(fā)揮作用，尤其番茄小分子熱激蛋白(SlsHSP)在生殖器官中的表達(dá)要大于在營養(yǎng)器官[34]。根據(jù)以上報(bào)道，筆者發(fā)現(xiàn)sHSP基因家族在非生物脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。而本研究通過對BvHSP18.2的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、順式作用元件等分析，發(fā)現(xiàn)該基因可能參與甜菜生長發(fā)育的調(diào)控和脅迫等應(yīng)激反應(yīng)。

為了進(jìn)一步明確BvHSP18.2基因的生物學(xué)功能，根據(jù)本文的研究結(jié)果，可進(jìn)一步體內(nèi)體外驗(yàn)證和探究BvHSP18.2在非生物逆境脅迫下的表達(dá)及在甜菜生長發(fā)育過程中的作用。研究結(jié)果也將為利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源的優(yōu)化提供優(yōu)良基因。

4 結(jié)論

本研究成功擴(kuò)增得到了甜菜熱休克蛋白BvHSP18.2基因的序列全長為962 bp，編碼區(qū)長度477 bp，編碼158個(gè)氨基酸。通過對BvHSP18.2基因啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件的分析，BvHSP18.2包含植物激素反應(yīng)、非生物和生物脅迫反應(yīng)以及與植物發(fā)育相關(guān)的順式元件，可以參與眾多生物過程。該基因的克隆為下一步深入細(xì)致研究BvHSP18.2在甜菜生長發(fā)育過程中發(fā)揮的作用及在非生物逆境脅迫下的表達(dá)特性奠定了基礎(chǔ)。