張雨萌,牛新湘,鄒 強(qiáng),楊紅梅,楚 敏,史應(yīng)武,4,5,*
(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆 烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所,新疆 烏魯木齊 830091;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830091;5.新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830091)
“玫瑰香”葡萄具有獨(dú)特香氣,常用于鮮食、釀酒等。每年8—9月份為“玫瑰香”葡萄成熟期,由于采收時(shí)正值高溫,且果實(shí)含糖量極高,表皮容易損傷,極易受病原菌的侵害發(fā)生腐爛、變軟、掉粒等現(xiàn)象[1-2],導(dǎo)致貯藏期較短,貯藏品質(zhì)大幅下降。我國(guó)需貯運(yùn)外銷(xiāo)與貯運(yùn)保鮮的葡萄果實(shí)約占80%,每年在采收、包裝、貯藏等環(huán)節(jié)出現(xiàn)的葡萄腐爛損失約占總產(chǎn)量的27%以上,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。如何保持葡萄采后貯藏品質(zhì)是目前亟需解決的問(wèn)題。我國(guó)在葡萄果實(shí)采后貯藏保鮮技術(shù)方面已有不少研究,最常見(jiàn)的是使用SO2熏蒸來(lái)防止葡萄果實(shí)腐爛[4-5],但此方法易使果實(shí)發(fā)生漂白[6],且易腐蝕庫(kù)房金屬設(shè)施,危害人體健康[7]。Pinto等[8]采用UV-C輻射的方法,使葡萄抗氧化活性增加,從而達(dá)到保鮮目的,但果實(shí)經(jīng)輻射處理可能會(huì)引起化學(xué)及生物學(xué)效應(yīng)。因此尋求安全有效的保鮮技術(shù)是維持良好貯藏品質(zhì)的關(guān)鍵。多數(shù)學(xué)者研究表明,拮抗菌對(duì)葡萄采后防腐保鮮有較好的效果,如:芽孢桿菌、酵母菌、假單胞桿菌等[9-11]。
貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種,在2008年被確定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的后期異型體[12]。已經(jīng)命名的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌植物亞種應(yīng)該重新歸為B.velezensis。貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)是目前成功用于實(shí)際生產(chǎn)的生防菌之一,可產(chǎn)生蛋白、多肽、小分子量抗生素等多種抑菌物質(zhì),能有效防治草莓白粉病、蘭花枯萎病等農(nóng)業(yè)病害,對(duì)稻瘟病菌、鏈格孢菌等病菌有較強(qiáng)的拮抗活性[13-14],表現(xiàn)出很好的實(shí)際應(yīng)用效果與前景[15-16],對(duì)葡萄采后病原菌的侵害也有明顯抑制效果。Hamaoka等[17]研究發(fā)現(xiàn),貝萊斯芽孢桿菌KOF112可以抑制灰霉病菌、炭疽菌和晚疫霉的菌絲生長(zhǎng)。B.velezensis這些特性使其在食品行業(yè)中也具有一定的應(yīng)用潛力,但其在葡萄采后保鮮中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。
本試驗(yàn)以玫瑰香葡萄為試材,采用貝萊斯芽孢桿菌TP-1溶液處理葡萄,通過(guò)對(duì)果實(shí)失重率、腐爛率、可溶性固形物含量、相對(duì)電導(dǎo)率、硬度、果皮色度、可滴定酸(TA)含量、VC含量的測(cè)定,研究其對(duì)玫瑰香葡萄常溫和低溫貯藏品質(zhì)的影響,探索葡萄采后保鮮處理的有效方法,以期為葡萄貯藏保鮮技術(shù)研究提供理論參考。
1.1.1 材料與試劑
拮抗菌:貝萊斯芽孢桿菌TP-1,分離自五家渠葡萄園土壤。病原菌:灰葡萄孢PH-23,由變質(zhì)葡萄傷口處分離所得。葡萄:品種為玫瑰香,購(gòu)自烏魯木齊市沙依巴克區(qū)北園春水果市場(chǎng),選取顆粒飽滿(mǎn),果實(shí)顏色較深且鮮艷,無(wú)損傷,大小相似的葡萄開(kāi)展試驗(yàn)。其他材料:0.22μm有機(jī)濾膜、打孔器、玻璃珠、穿刺針、竹簽。
酚酞:上海山浦化工有限公司。1%酚酞指示劑:將0.5 g酚酞用50 mL 95%乙醇充分溶解,得到1%酚酞指示劑,常溫保存?zhèn)溆?。氫氧化鈉:天津永晟精細(xì)化工有限公司。0.1 mol/L NaOH溶液:取2.0 g氫氧化鈉,置于潔凈燒杯中,加入蒸餾水,用玻璃棒攪拌助溶,將溶液全部轉(zhuǎn)至500 mL容量瓶中定容,常溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 儀器與設(shè)備
UV-2550型紫外分光光度計(jì),日本島津自動(dòng)化設(shè)備有限公司;NR10QC型通用色差計(jì),深圳市三恩馳科技有限公司;FiveEasy Plus型pH計(jì),北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;GY-4型水果硬度計(jì),浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司;DDS-307型電導(dǎo)率儀,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;CL20A型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)艾本德股份公司;DH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;RXZ型智能人工氣候箱,寧波江南儀器廠(chǎng);DK-8D型電熱恒溫水槽,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;WYT-A型手持折射儀,成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司。
1.2.1 菌液處理
將拮抗菌和病原菌的菌液分別于室溫條件下,8 000 r/min離心15 min,收集菌體,用0.85%生理鹽水重懸菌體,8 000 r/min離心15 min,收集菌體,重復(fù)操作洗滌菌體至少3次。然后用與菌液等量的生理鹽水重懸菌體。
1.2.2 樣品處理
葡萄表面用清水進(jìn)行沖洗,去除灰塵后用2%次氯酸鈉浸泡1 min,用無(wú)菌水沖洗,晾干。在葡萄果實(shí)表面均勻選取4點(diǎn),用無(wú)菌針頭進(jìn)行打孔,孔深3 mm,將打孔后大小、成熟度均一的葡萄隨機(jī)分為4組。①將葡萄置于無(wú)菌水中浸泡1 min,以此為對(duì)照組(CK),記為T(mén)1。②將葡萄在拮抗菌溶液(TP-1)中浸泡1 min,記為T(mén)2。③將葡萄先在拮抗菌溶液中浸泡1 min,然后在病原菌溶液(PH-23)中浸泡30 s,為(TP-1+PH-23),記為T(mén)3。④將葡萄在病原菌溶液(PH-23)中浸泡30 s,記為T(mén)4。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。將4組處理分別置于相對(duì)濕度為85%條件下貯藏,設(shè)置低溫(4℃)及常溫(25℃)兩組處理,低溫處理在10~50 d進(jìn)行測(cè)定,常溫處理在5~25 d進(jìn)行測(cè)定。
1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法
1.2.3.1 腐爛率
采用計(jì)數(shù)法測(cè)定腐爛率,每個(gè)處理50粒葡萄果實(shí)。計(jì)算公式為:
腐爛率(%)=腐爛果粒數(shù)/總果粒數(shù)×100
1.2.3.2 失重率
采用稱(chēng)重法,具體參照吳帆等[18]的方法。低溫(4℃)貯藏處理組每10 d取樣一次,準(zhǔn)確稱(chēng)重并記錄。常溫(25℃)貯藏處理組每5 d取樣一次,準(zhǔn)確稱(chēng)重并記錄。
1.2.3.3 可溶性固形物(TSS)含量
利用WYT-A手持折射儀進(jìn)行測(cè)定[19]。
1.2.3.4 相對(duì)電導(dǎo)率
使用DDS-307型電導(dǎo)率儀進(jìn)行測(cè)定[20]。
1.2.3.5 硬度
參考葉爽等[21]的方法,采用GY-4型水果硬度計(jì)對(duì)葡萄進(jìn)行穿刺測(cè)試。
1.2.3.6 果皮色度
參考孔祥佳等[22]的方法,使用NR10QC型通用色差計(jì)隨機(jī)測(cè)定葡萄果實(shí)表面L*、a*、b*值,L*表示亮度,a*表示紅綠色度,b*表示黃藍(lán)色度。根據(jù)a*和b*值計(jì)算果皮的色飽和度C值,色飽和度代表果實(shí)色澤的鮮艷程度,該數(shù)值越大果實(shí)色澤越鮮艷。色飽和度C值計(jì)算公式為:C=(a*2+b*2)1/2。
1.2.3.7 可滴定酸(TA)含量
參考曹建康等[23]的方法,采用酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)定,以酒石酸計(jì)。
1.2.3.8 VC含量
參照袁王旬等[24]的方法,在420nm處測(cè)定吸光值。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2010軟件繪圖,采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3次。
2.1.1 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對(duì)貯藏期間葡萄果實(shí)的防腐效果
如圖1所示,在整個(gè)貯藏期間葡萄果實(shí)腐爛率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),常溫貯藏15~20 d時(shí),腐爛率顯著上升,但T2處理組的腐爛率始終低于其他處理組。T4處理組腐爛率增加最快,第25天時(shí)已經(jīng)達(dá)到84%,約為T(mén)2組的2倍,T3處理組腐爛率在貯藏后期顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。常溫貯藏條件下,貝萊斯芽孢桿菌防腐效果明顯。低溫貯藏葡萄果實(shí)的腐爛率明顯低于常溫貯藏,貯藏50 d時(shí)腐爛率均不超過(guò)40%,且T2處理組腐爛率最低。貯藏25 d時(shí),常溫貯藏條件T2組的腐爛率為42.4%,貯藏50d時(shí),低溫貯藏條件T2組的腐爛率僅為27.4%。綜上,貝萊斯芽孢桿菌可以有效抑制葡萄果實(shí)的腐爛。
圖1 葡萄果實(shí)貯藏期間腐爛率的變化Fig.1 Changesin rottingrateof grapesduringstorage
2.1.2 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對(duì)貯藏期間葡萄果實(shí)失重率的影響
如圖2所示,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組果實(shí)失重率均呈上升趨勢(shì),且兩種貯藏條件下各貯藏階段水分含量變化趨勢(shì)較為一致。常溫貯藏的葡萄失重率在貯藏15 d以后上升趨勢(shì)顯著,T4組失重率顯著高于其他處理組(P<0.05),而T1、T2組在貯藏10~15 d失重率迅速上升,此后緩慢上升,各處理組間表現(xiàn)出明顯差異。第25天時(shí)T2組失重率為14.38%,顯著低于其他3組(P<0.05),此時(shí)T3組的失重率為25.03%,而T4組的失重率為31.99%,說(shuō)明常溫貯藏條件下貝萊斯芽孢桿菌可以大幅降低葡萄果實(shí)失重率。葡萄在低溫貯藏期間的失重率整體呈均勻上升趨勢(shì),且T4處理組失重率始終顯著高于其他處理組(P<0.05),T2組果實(shí)失重率始終低于T1組(P<0.05),說(shuō)明貝萊斯芽孢桿菌TP-1可有效抑制低溫貯藏下葡萄果實(shí)的失重。
圖2 葡萄果實(shí)貯藏期間失重率的變化Fig.2 Changesin weight lossrate of grapes during storage
2.1.3 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對(duì)貯藏期間葡萄果皮色度的影響
如圖3所示,常溫貯藏過(guò)程中各處理組L*值差異不大,貯藏15 d以后T2組的L*值始終低于其他處理組,貯藏25 d時(shí)T4處理組L*值最高,為31.34。葡萄果實(shí)低溫貯藏50 d時(shí),T1、T2、T3組間L*值無(wú)明顯差異,T4組L*值為33.65,顯著高于其他3組(P<0.05)。常溫貯藏葡萄果實(shí)T1、T2、T3處理組的C值均呈先下降后上升的變化趨勢(shì),T4處理組的C值在貯藏25 d時(shí)顯著上升。低溫貯藏的各處理組C值整體呈上升趨勢(shì),第50天時(shí)T4處理組C值最大。試驗(yàn)結(jié)果表明,不同貯藏條件下葡萄果皮明暗程度無(wú)明顯變化,低溫貯藏的葡萄顏色更為鮮艷。
圖3 葡萄果實(shí)貯藏期間果皮色度的變化Fig.3 Changesin grape skin color duringstorage
2.1.4 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對(duì)貯藏期間葡萄果實(shí)硬度的影響
如圖4所示,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),葡萄果實(shí)硬度呈現(xiàn)下降趨勢(shì),硬度的保持效果為T(mén)2>T1>T3>T4,常溫下貯藏的葡萄果實(shí)硬度下降更快。常溫T4處理組硬度下降最快,第25天時(shí)硬度為0。在低溫貯藏過(guò)程中,果實(shí)硬度呈現(xiàn)均勻下降的趨勢(shì),其中T3組硬度始終高于T4處理,可見(jiàn)低溫貯藏條件下貝萊斯芽孢桿菌可以更好地維持葡萄果實(shí)硬度。上述結(jié)果說(shuō)明貝萊斯芽孢桿菌可以較好地維持果實(shí)細(xì)胞間結(jié)合力和果實(shí)的抗壓力[25]。
圖4 葡萄果實(shí)貯藏期間硬度的變化Fig.4 Changesin thehardnessof grapesduringstorage
2.2.1 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對(duì)貯藏期間葡萄果實(shí)可溶性固形物含量的影響
如圖5所示,常溫貯藏期間葡萄果實(shí)的可溶性固形物含量整體呈下降趨勢(shì)。其中常溫貯藏條件T4處理組下降幅度更大。常溫貯藏25 d時(shí),可溶性固形物含量由高到低依次為:T2>T3>T1>T4。低溫貯藏條件下前20 d可溶性固形物含量呈下降趨勢(shì),20~50 d有所上升,低溫貯藏50 d時(shí)可溶性固形物含量由大到小為:T2>T1>T3>T4,說(shuō)明葡萄果實(shí)在貯藏過(guò)程中甜度呈下降趨勢(shì),但拮抗菌處理組可延緩果實(shí)代謝活動(dòng)[26],有效維持葡萄的甜度。
圖5 葡萄果實(shí)貯藏期間可溶性固形物含量的變化Fig.5 Changesof soluble solidscontents in grapesduring storage
2.2.2 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對(duì)貯藏期間葡萄果實(shí)VC含量的影響
如圖6所示,常溫貯藏條件下各組葡萄的VC含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),15 d時(shí)下降幅度較大,其中T2處理組對(duì)維持VC含量最有優(yōu)勢(shì),貯藏25 d時(shí),各處理組VC含量由高到低依次為:T2>T3>T1>T4;低溫貯藏葡萄果實(shí)VC含量整體呈下降趨勢(shì),貯藏50 d時(shí),VC含量由高到低依次為:T2>T3>T1>T4。常溫貯藏前期VC含量大于低溫貯藏,但隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),常溫貯藏VC含量下降較快,而低溫貯藏在整個(gè)貯藏期間VC含量下降幅度緩慢,貯藏中后期低溫貯藏條件下VC含量高于常溫貯藏,且T2處理組的VC含量始終最高。表明生物保鮮與低溫保鮮結(jié)合可以較好地維持葡萄果實(shí)中VC含量,有助于葡萄果實(shí)長(zhǎng)期貯藏。
圖6 葡萄果實(shí)貯藏期間VC含量的變化Fig.6 Changesof VCcontentsin grapesduringstorage
2.2.3 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對(duì)貯藏期間葡萄果實(shí)可滴定酸含量的影響
如圖7所示,在整個(gè)貯藏期間葡萄果實(shí)可滴定酸含量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。常溫貯藏25 d時(shí),各處理可滴定酸含量由高到低依次為:T2>T1>T3>T4;低溫貯藏的葡萄果實(shí)可滴定酸含量較常溫貯藏降幅平緩,第50天時(shí),各處理由高到低依次為:T3>T2>T1>T4。由此可見(jiàn),貝萊斯芽孢桿菌TP-1可有效抑制葡萄果實(shí)貯藏期間可滴定酸含量的下降,且低溫貯藏較常溫貯藏更有利于減緩可滴定酸含量的下降。
圖7 葡萄果實(shí)貯藏期間可滴定酸含量的變化Fig.7 Changesin titratableacids contentsin grapes during storage
由于葡萄果實(shí)不斷成熟衰老,其果肉的相對(duì)電導(dǎo)率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升(圖8)。常溫貯藏25 d時(shí),T4處理組的相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于其他3組(P<0.05),而T2處理組顯著低于其他3組(P<0.05)。低溫貯藏50 d時(shí),相對(duì)電導(dǎo)率由大到小依次為:T4>T3>T1>T2,T2處理組顯著低于其他3組(P<0.05)。常溫貯藏果實(shí)的相對(duì)電導(dǎo)率略高于低溫貯藏的果實(shí)。推測(cè)葡萄在貯藏期間相對(duì)電導(dǎo)率迅速增大,破壞了葡萄果實(shí)組織膜結(jié)構(gòu),發(fā)生膜內(nèi)電解質(zhì)外泄。貝萊斯芽孢桿菌TP-1可以顯著抑制細(xì)胞膜的損傷。
圖8 葡萄果實(shí)貯藏期間相對(duì)電導(dǎo)率的變化Fig.8 Changesin the electrical conductivity of grapesduring storage
貝萊斯芽孢桿菌含有多種菌肽基因組,大量研究報(bào)道了其生防潛力,但在果實(shí)貯藏保鮮方面應(yīng)用很少。潘夢(mèng)詩(shī)等[27]研究了貝萊斯芽孢桿菌對(duì)花生白絹病的生防機(jī)理,結(jié)果表明,貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和嗜鐵素可抑制病原菌的生長(zhǎng)。有研究表明,貝萊斯芽孢桿菌可以抑制厚皮甜瓜上尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng),有效抑制甜瓜腐爛[28]。本研究中,貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理后葡萄果實(shí)腐爛率在整個(gè)貯藏期都處于較低水平,這可能是由于貝萊斯芽孢桿菌抑制了病原菌的生長(zhǎng),從而延緩了發(fā)病時(shí)間。
果實(shí)的失重率、硬度和色度是保鮮研究中常用的感官指標(biāo)[29],可以反映葡萄果實(shí)的衰老程度、果實(shí)品質(zhì)以及顏色變化。本研究中貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理能夠有效減少葡萄果實(shí)水分的散失,且常溫貯藏條件下效果更顯著。硬度可以表征果實(shí)抗壓能力的強(qiáng)弱,在果實(shí)成熟的過(guò)程中其組織結(jié)構(gòu)變得松弛,硬度下降[30]。有研究表明,貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1可以顯著降低乙烯釋放量,有效控制番茄采后軟化,維持較好的硬度[31]。本研究中,貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理在整個(gè)貯藏期間硬度呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì),常溫貯藏25 d時(shí),貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理的硬度是對(duì)照組的1.42倍,低溫貯藏條件下貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理與對(duì)照組硬度均無(wú)大幅下降。整個(gè)貯藏期間果實(shí)表面亮度小幅上升,色澤逐漸變淺,低溫貯藏較常溫貯藏相比,葡萄果實(shí)顏色更為鮮艷,這與在梨[32]、獼猴桃[33]、蘋(píng)果[34]等水果的研究結(jié)果大體一致。果實(shí)組織的相對(duì)電導(dǎo)率反映了組織細(xì)胞膜的完整性與衰老程度[35]。本研究中,在整個(gè)貯藏期間葡萄果實(shí)組織的相對(duì)電導(dǎo)率保持上升趨勢(shì),且貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理組始終低于其他處理組。導(dǎo)致果實(shí)相對(duì)電導(dǎo)率上升的原因可能是離子的滲透率增加,致使細(xì)胞膜的組織結(jié)構(gòu)被破壞[36]。本研究中,兩種貯藏溫度條件下果實(shí)可溶性固形物含量均有不同程度的下降,低溫貯藏條件可以延緩果實(shí)可溶性固形物含量的下降,可溶性固形物含量的變化可能與貯藏期間葡萄果實(shí)內(nèi)部糖的轉(zhuǎn)化有關(guān)[37]。
孫思勝等[38]研究表明,對(duì)于低溫貯藏的“夏黑”葡萄,采用不同濃度復(fù)方中藥提取物可以有效抑制可滴定酸含量的下降,該結(jié)論與本研究結(jié)果一致。VC是衡量果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中,整個(gè)常溫貯藏期間果實(shí)VC含量大幅下降,貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理組VC含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理可以延緩VC的降解,有效維持果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)。低溫貯藏條件下VC含量無(wú)明顯變化,推測(cè)可能是由于低溫抑制了抗壞血酸酶的活性,進(jìn)而減緩了VC含量的下降[39]。
貝萊斯芽孢桿菌TP-1在常溫貯藏條件下維持葡萄果實(shí)品質(zhì)效果更明顯,低溫貯藏條件下有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌貯藏保鮮的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。
貝萊斯芽孢桿菌TP-1可以有效抑制采后葡萄果實(shí)腐爛率、失重率和相對(duì)電導(dǎo)率的上升,并且結(jié)合低溫貯藏條件可以有效延緩葡萄果實(shí)硬度、可滴定酸含量、可溶性固形物含量和VC含量的下降,使葡萄果實(shí)保持良好的色度。常溫貯藏較低溫貯藏防腐和維持果實(shí)品質(zhì)的效果更明顯,但低溫貯藏條件可以延長(zhǎng)葡萄果實(shí)的貯藏期。貝萊斯芽孢桿菌TP-1結(jié)合低溫貯藏的方法可以有效改善“玫瑰香”葡萄果實(shí)的貯藏品質(zhì)。