耿慶鎏, 宋 慧, 胡 敏, 曹樹(shù)青

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,為適應(yīng)復(fù)雜多變的自然環(huán)境進(jìn)化出響應(yīng)不同環(huán)境脅迫的生理代謝反應(yīng)系統(tǒng),這些系統(tǒng)使植物及時(shí)響應(yīng)環(huán)境變化,保障植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[1]。植物面對(duì)的環(huán)境脅迫分為生物脅迫(例如真菌、細(xì)菌感染,動(dòng)物啃食)和非生物脅迫(例如寒冷、干旱、營(yíng)養(yǎng)缺乏、重金屬毒害、土地鹽堿化)[2]。近年來(lái)，環(huán)境污染、氣候變化等問(wèn)題日益突出,植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中更容易受到環(huán)境脅迫影響,因此為保障人類(lèi)糧食生產(chǎn)和食品安全,植物抗逆境研究尤為重要[3]。

鐵元素是土壤中含量最高的4種元素之一[4],作為植物需求量最大的微量元素,鐵元素是許多蛋白酶的組成成分,在植物的生理代謝反應(yīng)(如光合作用、呼吸作用)中起氧化還原反應(yīng)的功能[5]。植物缺鐵一般發(fā)生在pH>7的堿性或石灰質(zhì)土壤上[6],由于堿性土壤條件下游離態(tài)的鐵元素減少,鐵元素難以被植物吸收,使植物出現(xiàn)缺鐵反應(yīng)。植物缺鐵反應(yīng)表現(xiàn)為因葉綠素減少引起的葉片失綠,嚴(yán)重時(shí)可影響植物生長(zhǎng)發(fā)育,并且當(dāng)植物中鐵元素過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量活性氧造成細(xì)胞損傷甚至壞死,植物體內(nèi)的鐵元素含量也受到嚴(yán)格控制[7],因此研究植物的鐵吸收及體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

有研究表明,植物BHLH轉(zhuǎn)錄因子家族MYC1基因可能介導(dǎo)不同植物非生物脅迫反應(yīng)[8],本研究以植物MYC1基因?yàn)檠芯繉?duì)象,構(gòu)建擬南芥ProMYC1-GUS植株材料,研究該基因在植物缺鐵脅迫中的響應(yīng)機(jī)制,為今后的植物非生物脅迫研究和生物技術(shù)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)所用植物材料為模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana),哥倫比亞生態(tài)型(Columbia,col),購(gòu)于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心(TAIR),由合肥工業(yè)大學(xué)植物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)繁殖。

1.1.2 質(zhì)粒載體與菌株

重組載體構(gòu)建所用質(zhì)粒pART27-GUS、轉(zhuǎn)基因植物材料構(gòu)建用菌株農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌DH5α,均購(gòu)買(mǎi)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)用試劑

Ps酶(TaKaRa);San Taq mix、壯觀霉素、慶大霉素、卡納霉素、瓊脂糖、酵母粉、蛋白胨、MES(生工生物工程(上海)股份有限公司);膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(TransGen);T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶(New England Biolabs);MS(Murashige Skoog)培養(yǎng)基(Sangon Biotech);氯化鈉、瓊脂、蔗糖、氯化汞、CTAB、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、苯酚(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司);goldview、Silwet L77(北京索萊寶科技有限公司);GUSBlue組織染色試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 野生型擬南芥種植

營(yíng)養(yǎng)土經(jīng)120 ℃、20 min高溫滅菌后與珍珠鹽、蛭石以3∶1∶9比例混合拌勻,分裝至植物培養(yǎng)用花缽,花缽置于托盤(pán)中。向托盤(pán)加入適量營(yíng)養(yǎng)液,營(yíng)養(yǎng)土完全浸潤(rùn),每缽播種擬南芥種子5～7顆,花缽由保鮮膜包裹放置于植物培養(yǎng)室,22 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng),擬南芥發(fā)芽后3 d去掉保鮮膜。

1.2.2 重組載體構(gòu)建

在TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)查詢(xún)擬南芥MYC1基因啟動(dòng)子區(qū)域序列,通過(guò)Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)該序列上下游引物并合成。上游引物為:

5’-GGGGTACCGAAACATTGTTATTTACTTTGGGACA-3’,

下游引物為:

5’-CCGCTCGAGATCTAGATATCGTGAAGAACTGAATT-3’。

限制性?xún)?nèi)切酶為KpnⅠ、XhoⅠ,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以擬南芥野生型植株基因組DNA為模板對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖電泳并回收,回收片段與待連接空載質(zhì)粒共同進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切,37 ℃、2 h酶切后片段與質(zhì)?；厥蘸?6 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物全部加入預(yù)先制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,混勻,熱激法轉(zhuǎn)化,均勻涂布于壯觀霉素抗性篩選LB固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑選單菌落PCR鑒定,陽(yáng)性克隆送測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司),測(cè)序序列與基因啟動(dòng)子區(qū)域序列比對(duì)成功,重組載體構(gòu)建成功。

1.2.3 電擊法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

電擊杯冰上預(yù)冷,2 μL重組載體質(zhì)粒加入預(yù)先制備農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞混勻,將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至電擊杯中,放入電轉(zhuǎn)儀。電轉(zhuǎn)儀參數(shù)設(shè)置為電壓1 800 V,電脈沖25 μF,啟動(dòng)電脈沖,待電擊結(jié)束后電擊杯中菌液轉(zhuǎn)移至500 μL LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4～6 h,均勻涂布于壯觀霉素和慶大霉素抗性篩選LB固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)48 h,挑選單菌落PCR鑒定,陽(yáng)性克隆菌株甘油保菌-20 ℃保存待用。

1.2.4 浸花法擬南芥侵染

吸取100 μL已鑒定ProMYC1-GUS農(nóng)桿菌菌液接種于3 mL壯觀霉素和慶大霉素抗性LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)活化。取2 mL菌液接種于100 mL壯觀霉素和慶大霉素抗性LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為1.0～1.3,4 000 r/min離心8 min,取上清液保留菌體,用侵染緩沖液重懸洗滌菌體,重復(fù)2次,最后用侵染緩沖液將菌液稀釋至OD600為0.5～0.6,并加入終體積分?jǐn)?shù)為0.02%～0.03%的SilwetL-77,混勻待用。選取6周左右,生長(zhǎng)發(fā)育正常野生型擬南芥植株,提前剪除果莢和已授粉花,花苞浸泡于菌液15～20 s,所有植株完全浸潤(rùn)后保鮮膜包裹并黑暗處理過(guò)夜,除去保鮮膜。1周后再次侵染,2周左右收種,烘干后4 ℃春化待用。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株篩選

配制1/2MS固體培養(yǎng)基,高溫滅菌(120 ℃,20 min)后待其冷卻至50～60 ℃,加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡納霉素,混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿,冷卻待用。超凈臺(tái)內(nèi)0.1%氯化汞溶液洗滌侵染植株子代種子1次,無(wú)菌水洗滌3次。將洗滌后種子均勻?yàn)⒃诳{霉素1/2MS固體培養(yǎng)基,封口膜密封后4 ℃春化3 d,光照培養(yǎng)14 d,選取體型較大,葉子較綠,根系較深植株轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)土繼續(xù)生長(zhǎng),2周后提取基因組DNA,PCR鑒定,去除鑒定陰性植株,4周后單株收種,子代種子點(diǎn)在卡納霉素1/2MS固體培養(yǎng)基進(jìn)行抗性分離,篩選純合體。

1.2.6 GUS染色

將已獲得的ProMYC1-GUS陽(yáng)性植株純合體種子點(diǎn)在MS固體培養(yǎng)基,4 ℃春化3 d,光照培養(yǎng)7 d后將萌發(fā)幼苗轉(zhuǎn)移至MS固體培養(yǎng)基和缺鐵MS固體培養(yǎng)基,分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)3 d后用GUS染色液將ProMYC1-GUS陽(yáng)性植株幼苗染色處理,37 ℃、6 h,75%乙醇溶液脫色后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的啟動(dòng)子區(qū)域片段克隆

為獲得目的基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段,以野生型擬南芥基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增(95 ℃,5 min預(yù)變性;95 ℃,30 s變性,55 ℃,30 s退火,72 ℃,2 min延伸,34個(gè)循環(huán);72 ℃,5 min,50μL體系),瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1 擬南芥MYC1基因啟動(dòng)子片段的克隆

由圖1可知，獲得的目的片段大小在2 000 bp左右,與引物設(shè)計(jì)預(yù)期片段大小相同。

2.2 目的片段與質(zhì)粒雙酶切連接

34 μL目的片段回收產(chǎn)物與pART27-GUS質(zhì)粒置于1.5 mL離心管中加入4 μL CutSmart緩沖液,KpnⅠ和XhoⅠ各添加1 μL,混勻離心后37 ℃金屬浴酶切2 h。酶切后片段和質(zhì)粒瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出,酶切后條帶清晰,大小正常,未見(jiàn)拖帶、彌散、分層等異常結(jié)果,回收酶切片段與質(zhì)粒。使用T4-DNA連接酶連接體系(酶切片段6.5 μL,酶切質(zhì)粒2 μL,T4-DNA連接酶緩沖液1 μL,T4-DNA連接酶0.5 μL)連接回收產(chǎn)物,混勻離心后16 ℃金屬浴連接16 h,獲得連接產(chǎn)物。

圖2 啟動(dòng)子片段與質(zhì)粒雙酶切

2.3 重組載體大腸桿菌轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆鑒定

將10 μL連接產(chǎn)物加入50 μL預(yù)先制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,冰浴30 min,42 ℃熱激1 min,再冰浴2 min,加入500 μL無(wú)抗性LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,均勻涂布于壯觀霉素抗性篩選LB固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單菌落培養(yǎng)并進(jìn)行PCR鑒定,瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3所示，圖3中，1～12代表大腸桿菌的PCR產(chǎn)物。

圖3 大腸桿菌菌落PCR驗(yàn)證

從圖3可以看出,2～7號(hào)泳道有明顯亮帶,并且與Marker比對(duì),條帶大小與目的片段大小一致,選取2號(hào)、3號(hào)單菌落進(jìn)行測(cè)序并于目的片段序列比對(duì),2號(hào)、3號(hào)為陽(yáng)性克隆。

2.4 重組載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與侵染

將5 μL 2號(hào)大腸桿菌測(cè)序質(zhì)粒加入50 μL預(yù)先制備的農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞,電擊法轉(zhuǎn)化后挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定,瓊脂糖電泳結(jié)果如圖4所示,圖4中，1～12代表農(nóng)桿菌的PCR產(chǎn)物。

從圖4可以看出,所有泳道均有明顯亮帶,大小正確,均為陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌單菌落。選取1號(hào)農(nóng)桿菌單菌落接菌,侵染4盆,共計(jì)20棵擬南芥野生型植株。

圖4 農(nóng)桿菌菌落PCR驗(yàn)證

2.5 ProMYC1-GUS陽(yáng)性植株篩選與鑒定

浸花法侵染擬南芥野生型植株子代種子,灑在卡納抗生素抗性1/2MS固體培養(yǎng)基光照培養(yǎng),2周后觀察種子萌發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育情況,如圖5所示,圖5中框選植株生長(zhǎng)發(fā)育較為正常，移至營(yíng)養(yǎng)土繼續(xù)生長(zhǎng),2周后提取植株基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。

圖5 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株抗性篩選

第1代轉(zhuǎn)基因植株成熟收種后繼續(xù)播種,子代植株分株單獨(dú)收種,第3代子代種子每種取20～25顆點(diǎn)在卡納抗生素抗性1/2MS固體培養(yǎng)基上,光照培養(yǎng)2周后觀察種子萌發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育情況如圖6所示。

由圖6可知,3組正常生長(zhǎng)發(fā)育,而1、2、4組部分幼苗發(fā)黃,由遺傳分離定律可知,3組為純和陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因組。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株抗性分離篩選

2.6 缺鐵脅迫轉(zhuǎn)基因材料GUS染色

為探究植物MYC1基因在缺鐵脅迫下基因表達(dá)的變化對(duì)植物缺鐵的響應(yīng),MS培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)7 d后ProMYC1-GUS轉(zhuǎn)基因植株移至MS和缺鐵MS固體培養(yǎng)基,3 d后對(duì)其GUS染色,通過(guò)觀察顏色反應(yīng)的GUS基因表達(dá)量的不同,分析MYC1基因在缺鐵脅迫下轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的變化。GUS染色結(jié)果如圖7所示,從圖7可以看出,缺鐵誘導(dǎo)條件下ProMYC1-GUS轉(zhuǎn)基因植株相較于對(duì)照組染色程度明顯降低,說(shuō)明植物MYC1基因在缺鐵脅迫下表達(dá)被抑制,表達(dá)量明顯下降,該基因可能作為負(fù)調(diào)控因子介導(dǎo)植物缺鐵脅迫反應(yīng)。

圖7 ProMYC1-GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS染色

3 結(jié) 論

由于植物在自然界中和人類(lèi)生產(chǎn)活動(dòng)中扮演著非常重要且不可替代的角色,植物脅迫響應(yīng)的研究與人類(lèi)生活息息相關(guān),通過(guò)對(duì)植物脅迫響應(yīng)基因的功能研究幫助人類(lèi)揭示植物逆境響應(yīng)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路,并且以此為基礎(chǔ)解決環(huán)境保護(hù)、生態(tài)治理以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實(shí)際問(wèn)題。

GUS基因作為一種常見(jiàn)的報(bào)告基因通過(guò)水解底物產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來(lái)指示目的基因轉(zhuǎn)錄水平,由于其幾乎不存在于高等植物中,并且表達(dá)穩(wěn)定、結(jié)果分析簡(jiǎn)單,經(jīng)常作為一種融合基因標(biāo)記來(lái)檢測(cè)植物基因在組織中的表達(dá)量[9]。有報(bào)道指出,擬南芥MYC1基因介導(dǎo)植物激素信號(hào)調(diào)控的非生物脅迫生理過(guò)程[10]。本研究通過(guò)構(gòu)建擬南芥ProMYC1-GUS轉(zhuǎn)基因材料和缺鐵誘導(dǎo)條件下GUS染色,分析該基因誘導(dǎo)前后表達(dá)量的變化,結(jié)果表明MYC1基因在缺鐵條件下被抑制表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因與植物非生物脅迫(缺鐵脅迫)有關(guān),為MYC1基因介導(dǎo)非生物脅迫的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。