梅建鳳,鄭素晶,陳 翔,李 靚,易 喻,應(yīng)國清

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院,浙江 舟山 316021)

舍雷肽酶,又稱沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等,英文名稱有serrapeptase,serratiopeptidase,serralysin和serratia-protease等。它是一種堿性金屬蛋白酶,最初是從黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)E15菌株中分離得到,因其來源而得名[1-3]。舍雷肽酶具有出色的酪蛋白水解和溶纖活性,能水解組織中異常滲出物、變性蛋白質(zhì)和血纖維凝塊,使膿、痰和血凝塊等液化而易于排出,具有良好的抗炎、抗菌、消腫和化痰作用[4-6],舍雷肽酶無論是單獨使用,還是與其他藥物聯(lián)合使用,對動脈粥樣硬化、淀粉樣變性、牙周炎、支氣管炎、鼻竇炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腕管綜合征和其他各種自身免疫性疾病都有較好的治療效果[7-11],該酶還能促進(jìn)抗生素在組織中滲透,從而增強抗生素的治療效果[12]。早在20世紀(jì)60年代,舍雷肽酶就在日本上市,隨后在世界多個國家上市并使用至今。因出色的功效和無副作用的特性,近年來,該酶作為輔助治療藥物和抗心血管疾病的保健食品市場需求旺盛,在電商平臺上的銷售量逐年增長。

目前,國際市場上的舍雷肽酶主要由日本和印度生產(chǎn),國內(nèi)未見有企業(yè)生產(chǎn)。為了開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的舍雷肽酶生產(chǎn)工藝,梅建鳳等[13-14]開展了舍雷肽酶產(chǎn)生菌的分離、誘變育種、酶學(xué)性質(zhì)和發(fā)酵工藝等研究,從家蠶(BombyxmoriL.)的蠶蛹腸道中分離得到一株黏質(zhì)沙雷氏菌LL-413,能產(chǎn)生分子質(zhì)量為52 kDa的舍雷肽酶。有關(guān)菌株的分離、鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究已在文獻(xiàn)[14]中報道,筆者研究報道該菌株產(chǎn)舍雷肽酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化,首先在初始牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,通過單因素設(shè)計法[15]確定發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要成分;然后采用響應(yīng)面分析法[16-17]確定主要成分的較佳濃度;最后考察了培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活力的影響,確定了黏質(zhì)沙雷氏菌LL-413產(chǎn)舍雷肽酶的較佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)時間,黏質(zhì)沙雷氏菌LL-413的發(fā)酵產(chǎn)酶活力得以大幅度提高。

1 材料與方法

1.1 菌種和主要試劑

黏質(zhì)沙雷氏(S.marcescens)LL-413菌株,分離自家蠶的蠶蛹腸道,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號CCTCC M2015780;福林酚試劑(生物試劑),國藥集團化學(xué)試劑有限公司;實驗所用其他試劑均為市售分析純試劑或生物試劑。

1.2 儀器和設(shè)備

GI54DWS型壓力蒸汽滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司;SHP-250D生化培養(yǎng)箱,上海森信實驗儀器有限公司;HZ-9311K恒溫振蕩培養(yǎng)箱,太倉華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司;SW-CJ-2D型超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;SP-752型紫外-可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

種子培養(yǎng)基和初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基均為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,成分包括:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.0。250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基,8層紗布扎口,121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 初始產(chǎn)酶培養(yǎng)

0.5 mL的20%甘油冷凍保藏菌液接入20 mL的種子培養(yǎng)基,于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)12 h后獲得種子液,按1%的體積分?jǐn)?shù)移取種子液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基,于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 酶活的測定

培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心10 min后取上清液,經(jīng)過適當(dāng)倍數(shù)稀釋后測定酶活。1 mL待測酶液和1 mL酪蛋白水溶液(20 g/L,50 mmol/L,pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制)于試管中,振蕩混合后于37 ℃水浴中保溫10 min,再加入2 mL的三氯乙酸終止液(TCA,0.4 mol/L)終止酶解反應(yīng),繼續(xù)水浴保溫20 min,經(jīng)8 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液于另一試管中,加入5 mL的Na2CO3(0.4 mol/L)和1 mL福林酚試劑,37 ℃水浴保溫顯色30 min,以酶解反應(yīng)保溫前加入TCA的相同處理為參比,測定A660,依據(jù)相同實驗方法繪制的酪氨酸濃度—A660標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出酶解體系中酪氨酸的質(zhì)量(μg),舍雷肽酶活力的定義:在pH 8.0、37 ℃反應(yīng)條件下,1 min水解10 g/L酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位U。按上述定義計算發(fā)酵液中舍雷肽酶的活力。

1.3.4 菌體生物量的測定

培養(yǎng)液用去離子水稀釋10倍后,以稀釋相同倍數(shù)未接種的培養(yǎng)基為參比,測定OD600,依據(jù)預(yù)先制作的菌體OD600—菌體干質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算培養(yǎng)液中的菌體干質(zhì)量得率(g/L)。

1.3.5 實驗設(shè)計

首先,采用單因素實驗優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源的種類及濃度、氮源的種類及濃度和無機鹽種類;然后,以單因素實驗為基礎(chǔ),采用Box-Benhnken實驗設(shè)計對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)舍雷肽酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析,確定麥芽浸粉、酵母浸粉和牛肉膏的較優(yōu)濃度;最后,考察培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活力的影響。

所有實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)以3次實驗結(jié)果的平均值表示。Box-Behnken實驗采用Design-Expert V12設(shè)計和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗優(yōu)化結(jié)果與分析

2.1.1 碳源種類及濃度對產(chǎn)酶活力的影響

因為初始產(chǎn)酶培養(yǎng)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中無糖類碳源,添加糖類碳源有利于菌體大量生長和產(chǎn)酶,所以在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別添加10 g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、麥芽浸粉和乳糖作為碳源,不同碳源對產(chǎn)酶活力的影響如圖1所示。由圖1可知:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加10 g/L麥芽浸粉時,菌體干質(zhì)量得率和酶活顯著高于其他碳源,達(dá)到301.8 U/mL。

圖1 不同碳源對產(chǎn)舍雷肽酶活力的影響Fig.1 Effect of carbon sources on the production of serrapeptase

麥芽浸粉不僅含有糖類,還含有>4%的蛋白質(zhì)和氨基酸,有利于細(xì)菌的生長,因此麥芽浸粉是黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)舍雷肽酶的合適碳源,進(jìn)而考察其質(zhì)量濃度(4～14 g/L)對酶活的影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:當(dāng)麥芽浸粉質(zhì)量濃度低于10 g/L時,酶活隨其濃度的增加而增加;當(dāng)其達(dá)到12 g/L以上時,酶活則開始有所下降,因此合適的麥芽浸粉質(zhì)量濃度為10 g/L。

圖2 麥芽浸粉質(zhì)量濃度對產(chǎn)舍雷肽酶活力的影響Fig.2 Effect of malt extract concentration on the production of serrapeptase

2.1.2 氮源種類及濃度對產(chǎn)酶活力的影響

以10 g/L的麥芽浸粉作為培養(yǎng)基的碳源,考察不同氮源對產(chǎn)酶活力的影響。培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白、酵母浸粉、脫脂奶粉,以及5 g/L牛肉膏+5 g/L酵母浸粉(簡稱牛+醇)、5 g/L牛肉膏+5 g/L蛋白胨(簡稱牛+蛋),不同氮源對產(chǎn)酶活力的影響如圖3所示。由圖3可知:當(dāng)以5 g/L牛肉膏+5 g/L酵母浸粉作為氮源時,雖然菌體干質(zhì)量得率低于脫脂奶粉為氮源,但酶活顯著高于其他種類的氮源,此時酶活為360.2 U/mL。進(jìn)一步分別考察牛肉膏和酵母浸粉質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶活力的影響。

圖3 不同氮源對產(chǎn)舍雷肽酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on the production of serrapeptase

保持酵母浸粉的質(zhì)量濃度5 g/L不變,考察牛肉膏質(zhì)量濃度(2～14 g/L)對產(chǎn)酶活力的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:提高產(chǎn)酶培養(yǎng)基中牛肉膏質(zhì)量濃度,產(chǎn)酶活力并沒有提高,而當(dāng)其質(zhì)量濃度高于5 g/L時,酶活反而有所降低。

圖4 牛肉膏質(zhì)量濃度對產(chǎn)舍雷肽酶活力的影響Fig.4 Effect of beef extract concentration on the production of serrapeptase

保持牛肉膏質(zhì)量濃度5 g/L不變,考察酵母浸粉質(zhì)量濃度(2.5～15 g/L)對產(chǎn)酶活力的影響,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知:當(dāng)酵母浸粉質(zhì)量濃度低于10 g/L時,酶活隨其質(zhì)量濃度增加而增加,之后酶活開始有所下降。因此合適的酵母浸粉質(zhì)量濃度為10 g/L,此時,酶活為392.0 U/mL。

2.1.3 無機鹽種類對產(chǎn)舍雷肽酶的影響

無機鹽是微生物生長以及合成代謝產(chǎn)物不可缺少的營養(yǎng)成分,選取微生物培養(yǎng)基常用的無機鹽ZnSO4(1 g/L)、MgSO4(1 g/L)、MnSO4(1 g/L)、KH2PO4(5 g/L)和K2HPO4(5 g/L),分別添加到培養(yǎng)基中,它們對產(chǎn)酶活力的影響如圖6所示。由圖6可知:當(dāng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入1 g/L的ZnSO4、1 g/L的MgSO4和5 g/L的K2HPO4時,菌體干質(zhì)量得率和產(chǎn)酶活力均有提高。培養(yǎng)基中同時添加這3種無機鹽的實驗結(jié)果表明酶活達(dá)到564.7 U/mL。

2.2 響應(yīng)面實驗優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 設(shè)計方案和實驗結(jié)果

由單因素實驗結(jié)果可知:麥芽浸粉、酵母浸粉與牛肉膏的質(zhì)量濃度對舍雷肽酶的酶活Y的影響較大。微生物培養(yǎng)基中的碳源和氮源往往存在交互作用,因此采用Box-Behnken中心組合設(shè)計的響應(yīng)面實驗優(yōu)化它們的質(zhì)量濃度,因素水平以及編碼設(shè)計如表1所示,實驗結(jié)果如表2所示。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計的因素和水平及編碼Table 1 Factors and levels for Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應(yīng)面模型及顯著性分析

運用Design-Expert V12對表2中的實驗結(jié)果進(jìn)行二次多項式回歸擬合,得到以編碼因素表示的回歸模型方程:Y=568.8+48.0A+15.4B+43.6C+4.05AB+7.95AC+26.4BC-71.3A2-62.4B2-45.9C2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variances of the regression model

由Design-Expert V12軟件得到的麥芽浸粉質(zhì)量濃度、酵母浸粉質(zhì)量濃度和牛肉膏質(zhì)量濃度3個因素之間的模型響應(yīng)面圖如圖7所示。由圖7可以直觀地看出各因素對酶活影響的變化趨勢,其中麥芽浸粉質(zhì)量濃度對酶活的影響較大,隨著其質(zhì)量濃度的增加,酶活先有提高后降低,其次是牛肉膏濃度,雖然酵母浸粉質(zhì)量濃度對酶活的影響相對較小,但是也達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

圖7 各因素交互作用對產(chǎn)舍雷肽酶活力影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surfaces showing the effects of factors on the production of serrapeptase

2.2.3 優(yōu)化結(jié)果驗證

依據(jù)Design-Expert V12給出的最佳產(chǎn)酶條件:A=0.38,B=0.26,C=0.58,即麥芽浸粉質(zhì)量濃度為11.9 g/L,酵母浸粉質(zhì)量濃度為11.3 g/L,牛肉膏質(zhì)量濃度為6.45 g/L,酶活最大預(yù)測值為592.5 U/mL。依據(jù)上述優(yōu)化值做驗證實驗,3次實驗的平均值為596.4 U/mL,與最大預(yù)測值基本相符,說明該模型有較高的準(zhǔn)確性和實用性。經(jīng)響應(yīng)面分析實驗優(yōu)化,黏質(zhì)沙雷氏菌LL-413發(fā)酵產(chǎn)酶活力從564.7 U/mL增加到596.4 U/mL,提高了5.67%。

2.3 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)舍雷肽酶的影響

合適的培養(yǎng)基初始pH有利于菌體生長及產(chǎn)酶活力的提高,在確定培養(yǎng)基成分后,考察培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶活力的影響,結(jié)果如圖8所示。由圖8可知:當(dāng)培養(yǎng)基初始pH低于8.0時,隨著pH增加,酶活也隨之增加；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為8.0時,舍雷肽酶活力最高,這說明因舍雷肽酶屬于堿性蛋白酶,偏堿性的培養(yǎng)環(huán)境有利于產(chǎn)酶活力的提高。

圖8 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)舍雷肽酶活力的影響Fig.8 Effect of the medium initial pH on the production of serrapeptase

2.4 產(chǎn)酶培養(yǎng)的時間曲線

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)時間為24 h,經(jīng)過培養(yǎng)基組成優(yōu)化后,營養(yǎng)成分的質(zhì)量濃度都有提高,24 h的培養(yǎng)時間可能不足,為此考察培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活力的影響,產(chǎn)酶培養(yǎng)的時間曲線如圖9所示。由圖9可知:產(chǎn)酶培養(yǎng)基接種后,菌體很快進(jìn)入對數(shù)生長期;28 h后,雖然菌體生長達(dá)到平穩(wěn)期,但是酶活還在繼續(xù)增加;36 h時達(dá)到最大值,此時酶活為1 121 U/mL,菌體干質(zhì)量得率為5.33 g/L。綜上,合適的產(chǎn)酶培養(yǎng)時間為36 h。

圖9 培養(yǎng)時間對產(chǎn)舍雷肽酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation time on the production of serrapeptase

3 結(jié) 論

通過單因素實驗,發(fā)現(xiàn)麥芽浸粉、酵母浸粉與牛肉膏的質(zhì)量濃度對舍雷肽酶的酶活的影響較大,因此采用Box-Behnken中心組合設(shè)計和Design-Expert V12軟件對麥芽浸粉、酵母浸粉與牛肉膏的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化,得到優(yōu)選產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成,在此基礎(chǔ)上考察培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活力的影響,最終得到較優(yōu)培養(yǎng)條件:麥芽浸粉11.9 g/L,酵母浸粉11.3 g/L,牛肉膏6.45 g/L,MnSO41 g/L,ZnSO41 g/L,K2HPO45 g/L,NaCl 5 g/L,初始pH 8.0,溫度30 ℃,振蕩轉(zhuǎn)速200 r/min,接種量1%,培養(yǎng)時間36 h。在此條件下,黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)舍雷肽酶活力達(dá)到1 121 U/mL,較優(yōu)化前提高了3.89倍。筆者的研究結(jié)果為黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)舍雷肽酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了參考。