賀競鋒，劉先寶，李博勛，蔡吉苗，馮艷麗，黃貴修

（1. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海口 570228; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

橡膠樹炭疽病是一類由炭疽屬(Colletotrichum)真菌侵染引起的重要葉部病害[1]。該病在橡膠樹不同葉齡期、不同生長階段的多個組織上均能發(fā)生危害，給天然橡膠生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。目前，橡膠樹炭疽病病原菌主要有膠孢炭疽菌(Colletotrichum glocosporioidesPenz.)、尖孢炭疽菌(C. acutalumSimmons)和 博 寧 炭 疽(C.boninense)3個復(fù)合種，每個復(fù)合種內(nèi)又包括多個種。其中，膠孢炭疽復(fù)合種包括暹羅炭疽(C.siamense)、果生刺盤孢(C. fructicola)和樂東炭疽(C.ledongense)等，尖孢炭疽復(fù)合種下包括華南炭疽(C. australisinense)、版納炭疽(C. bannanense)和C. laticiphilum等。暹羅炭疽和華南炭疽是引起我國橡膠樹炭疽病的優(yōu)勢種[2]。由于復(fù)合種間、種間生物學(xué)特性存在較大差異，由此推測不同復(fù)合種對藥劑的敏感性存在差異。目前，化學(xué)防治是橡膠樹炭疽病的主要防治方法。以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑(BMZs)和以咪鮮胺為代表的三唑類(DMIs)殺菌劑是防治橡膠炭疽病的主要藥劑[3]。苯并咪唑類殺菌劑的主要作用機(jī)制是特異性地與病原真菌的β微管蛋白結(jié)合，進(jìn)而干擾微管裝配，抑制病原菌的生長。而三唑類殺菌劑防治病害的機(jī)制是抑制真菌體內(nèi)CytP450單加氧酶的活性，破壞麥角甾醇生物合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷而死亡[4]。印尼、馬來西亞和泰國等國家使用甲基托布津和8-hydroquinone coffer防治橡膠樹炭疽病，國內(nèi)則普遍使用多菌靈。國內(nèi)學(xué)者在復(fù)合種的水平上對橡膠樹膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌進(jìn)行了藥劑敏感性的評價[5?7]，但目前尚未見橡膠樹炭疽菌不同種群對殺菌劑敏感性評價與分析的報(bào)道。為了解橡膠樹不同炭疽菌種群對不同殺菌劑敏感性的差異，筆者開展了不同炭疽菌種群對不同殺菌劑的敏感性研究，旨在為生產(chǎn)上科學(xué)合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及來源供試的17株菌株已經(jīng)明確其分類地位[8]，均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所保存(表1)。

表1 供試菌株及來源

1.2 供試藥劑供試的8種藥劑均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶工業(yè)原料作物病害課題組提供(表2)[9?10]。

表2 供試殺菌劑信息

1.3 帶毒培養(yǎng)基的配置將供試藥劑用二甲基甲酰胺溶解，然后配制為母液備用。向滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基中添加不同體積的母液，配置成不同濃度梯度帶毒培養(yǎng)基。供試藥劑的濃度梯度見表3。

1.4 橡膠炭疽菌的敏感性測定用打孔器從PDA平板培養(yǎng)5 d的炭疽菌落外緣打取直徑為5 mm的菌餅轉(zhuǎn)接在含不同濃度供試藥劑(在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定藥劑合適的濃度梯度，詳見表3)的 PDA平板培養(yǎng)基中，以不含農(nóng)藥的 PDA平板培養(yǎng)基為對照，菌絲朝下置于平板中央，每處理重復(fù)3次[11?12]。膠孢炭疽菌于28 ℃下培養(yǎng)5 d后，尖孢炭疽菌于28 ℃下培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2021數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，求出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值。其中，計(jì)算公式[13?14]如下：

表3 供試藥劑及處理濃度梯度

1.5 殺菌劑復(fù)配設(shè)計(jì)根據(jù)供試殺菌劑單劑對菌絲生長的EC50測定結(jié)果，最終選取咪鮮胺和戊唑醇進(jìn)行復(fù)配，評價藥劑混用后的聯(lián)合作用。將咪鮮胺和 戊唑醇按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2等進(jìn)行復(fù)配，測定復(fù)配劑對供試菌株菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50，同時按Wadley法計(jì)算增效系數(shù)(SR)。SR≤0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。

式中：a、b分別為相應(yīng)單劑在復(fù)配劑中所占比例，A、B分別為咪鮮胺和戊唑醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試殺菌劑對膠孢炭疽復(fù)合種生長的影響從表4可知，咪鮮胺對菌絲生長的抑制效果最佳，其平均EC50為0.079 63 mg·L?1，膠孢復(fù)合種內(nèi)果生刺盤孢敏感性稍差，樂東炭疽和暹羅炭疽的敏感性較為接近，樂東炭疽、果生刺盤孢和暹羅炭疽的 平 均EC50分 別 為0.074 25 mg·L?1、0.089 43 mg·L?1和0.074 98 mg·L?1；對咪鮮胺·三唑酮和多菌靈表現(xiàn)為敏感，其平均EC50分別為0.329 6 mg·L?1和0.414 2 mg·L?1，各種對咪鮮胺·三唑酮的敏感性中，同樣是果生刺盤孢的敏感性較差，樂東炭疽較為敏感。在對多菌靈的敏感性評價中，樂東炭疽菌的敏感性稍差，暹羅炭疽較為敏感；膠孢復(fù)合種對戊唑醇，己唑醇和氟硅唑的平均EC50較為接近，分別為1.164 4 mg·L?1、1.325 7 mg·L?1和1.122 2 mg·L?1；對腈菌唑，粉唑醇表現(xiàn)為不敏感。在相同的種群內(nèi)，不同菌源的菌株對藥劑的敏感性存在一定的差異。果生刺盤孢種內(nèi)，海南的菌株對8種藥劑的EC50最大，云南地區(qū)的菌株除咪鮮胺外的EC50最小。暹羅炭疽種內(nèi)，云南的菌株的對咪鮮胺、氟硅唑、戊唑醇和己唑醇4種藥劑中的EC50最大；海南的菌株對粉唑醇、咪鮮胺·三唑酮和腈菌唑3種藥劑中的EC50最大；廣西的菌株對多菌靈的EC50最大，其他7種藥劑的EC50最小。

表4 膠孢復(fù)合種對供試藥劑的敏感性 mg·L?1

2.2 供試殺菌劑對尖孢炭疽復(fù)合種生長的影響從表5可知，藥劑對尖孢復(fù)合種炭疽菌菌絲生長的影響。咪鮮胺對菌絲生長的抑制效果最佳，其平均EC50為0.091 61 mg·L?1，高于膠孢復(fù)合種。尖孢復(fù)合種內(nèi)又以華南炭疽最為敏感，其平均EC50為0.038 06 mg·L?1，其他3個種的敏感性較為接近，C.laticiphilum、版納炭疽和新類群的EC50分 別 為0.125 2 mg·L?1、0.122 1 mg·L?1和0.124 7 mg·L?1；尖孢復(fù)合種對咪鮮胺·三唑酮、戊唑醇和氟硅唑表現(xiàn)為高度敏感，其平均EC50分別為0.532 2、0.368 8和0.558 6 mg·L?1，各種對咪鮮胺·三唑酮的敏感性中，以C.laticiphilum和新種群較為不敏感，華南炭疽和版納炭疽較為敏感；對戊唑醇的敏感性中，C.laticiphilum最為敏感；對氟硅唑的敏感性中，華南炭疽最為敏感；對腈菌唑，粉唑醇表現(xiàn)為不敏感。從菌源上看，華南炭疽種內(nèi)，廣西的菌株對氟硅唑、粉唑醇、腈菌唑、多菌靈和己唑醇的EC50最小，廣東的菌株對戊唑醇、咪鮮胺、咪鮮胺·三唑酮的EC50最小，整體來看云南的菌株最為不敏感。

表5 尖孢復(fù)合種對供試藥劑的敏感性 mg·L?1

2.3 不同種對供試殺菌劑的敏感性從圖1可知。在對多菌靈的敏感性中，尖孢復(fù)合種的菌株平均EC50顯著大于膠孢復(fù)合種的菌株。此外，在對戊唑醇的敏感性中，膠孢復(fù)合種菌株的平均EC50顯著大于尖孢復(fù)合種的菌株，在對多菌靈、腈菌唑和粉唑醇的敏感性中，尖孢復(fù)合種內(nèi)的新種群的EC50顯著高于其他的種，其他3個種群則沒有表現(xiàn)出顯著差異。

圖1 復(fù)合種對供試藥劑敏感性的平均值

2.4 供試殺菌劑復(fù)配藥劑對橡膠樹炭疽菌的影響從表6和表7可知，復(fù)配藥劑對不同種炭疽菌菌絲生長的影響。選取效果最好的2種單劑進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn)，即咪鮮胺和戊唑醇，分別選取膠孢復(fù)合種和尖孢復(fù)合種內(nèi)的優(yōu)勢種群，即暹羅炭疽YNBN7-4、果生刺盤孢GD1603和華南炭疽GX1655和YNJP162。

表6 膠孢復(fù)合種對復(fù)配藥劑的敏感性

表7 尖孢復(fù)合種對復(fù)配藥劑的敏感性

從增效系數(shù)上來看，對于膠孢炭疽果生刺盤孢1 603來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例為3∶7時增效系數(shù)為0.869 5，表現(xiàn)為相加作用且效果最好；對于膠孢炭疽暹羅炭疽7-4來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例為7∶3時，增效系數(shù)為0.872 8，表現(xiàn)為相加作用且效果最好；對于尖孢炭疽華南炭疽162來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例為4∶6時，表現(xiàn)為增效作用且增效系數(shù)達(dá)到1.788 8；對于尖孢炭疽華南炭疽1 655來說，咪鮮胺∶戊唑醇比例同樣為4∶6時抑菌效果最佳，增效系數(shù)為0.635 9表現(xiàn)為相加作用。

3 討 論

本研究選用8種殺菌劑對橡膠樹炭疽菌進(jìn)行了菌絲生長抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明，咪鮮胺、多菌靈、氟硅唑、戊唑醇、己唑醇、咪鮮胺·三唑酮6種藥劑對橡膠樹炭疽菌菌絲生長有顯著抑制活性，腈菌唑和粉唑醇對病原菌菌絲抑制效果較差，多數(shù)以三唑類為代表的麥角甾醇生物抑制劑對病原菌菌絲生長有明顯的抑制效果，這與麥角甾醇生物合成抑制劑的作用機(jī)理相關(guān)。有研究認(rèn)為麥角甾醇生物抑制劑對菌絲生長有顯著影響，但在本研究中，同為三唑類殺菌劑的粉唑醇和腈菌唑效果不佳，特別時尖孢復(fù)合種的EC50較大，抑制效果不明顯，且遠(yuǎn)不及其他三唑類殺菌劑。

蔡志英等[5]于2008年對采自云南的1株膠孢炭疽菌和1株尖孢炭疽菌進(jìn)行了6種藥劑的敏感性測定并進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，膠孢炭疽菌與尖孢炭疽菌均對咪鮮胺最為敏感。曹學(xué)仁等[6]檢測了從海南省4個市縣分離獲得的23株橡膠膠孢炭疽菌和20株尖孢炭疽菌對咪鮮胺和多菌靈的敏感性，結(jié)果表明，供試菌株對多菌靈的EC50值分布在0.332 3～7.425 6 mg·L?1范圍內(nèi)，平均值為1.714 1 mg·L?1；對咪鮮胺的EC50值分布在0.009 1～0.113 3 mg·L?1范圍內(nèi)，平均值為0.036 8 mg·L?1。林春花等[7]測定了來自海南、云南、廣東和廣西4省22株橡膠樹膠孢炭疽菌和15株尖孢炭疽菌對咪鮮胺的敏感性，結(jié)果表明，供試的37株橡膠炭疽病菌菌株對咪鮮胺的EC50值為0.022 0～0.272 1 mg·L?1，平均為(0.061 7±0.055 4) mg·L?1。本研究中，尖孢炭疽菌對多菌靈的敏感性要顯著低于膠孢炭疽病菌，對咪鮮胺的敏感性與前人研究結(jié)果基本一致。此外，不同復(fù)合種對藥劑的敏感性存在一定的差異。例如，樂東炭疽、果生刺盤孢、暹羅炭疽和尖孢炭疽對多菌靈的平均EC50分別為0.528 7、0.426 0、0.348 2、1.131 5 mg·L?1。尖孢炭疽對戊唑醇、腈菌唑和氟硅唑的敏感性均顯著高于膠孢炭疽復(fù)合種。在同一中群內(nèi)，來自不同菌源地的菌株在對同一種藥劑的敏感性上，也會有一定的差異。本研究中，測定了來自海南、云南、廣東和廣西省膠孢炭疽和尖孢炭疽2個復(fù)合種內(nèi)7個種群對8種藥劑的敏感性，在前人的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確了不同種群炭疽病菌的藥劑敏感性。

咪鮮胺和戊唑醇均為高效、廣譜﹑低毒的殺菌劑。筆者選擇這2種藥劑進(jìn)行復(fù)配，研究其單劑和復(fù)配劑對病原菌菌絲生長的影響，采用Wadley法計(jì)算復(fù)配藥劑的增效系數(shù)，最終獲得了對橡膠樹炭疽菌菌絲生長表現(xiàn)出相加作用最優(yōu)復(fù)配組合。

橡膠樹炭疽病是常年流行在橡膠產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，對膠乳的產(chǎn)量造成了嚴(yán)重的影響，多種殺菌劑交替使用可以緩解由于長期施用單一殺菌劑產(chǎn)生的抗藥性問題，延長殺菌劑的使用壽命。另外，戊唑醇的價格遠(yuǎn)低于咪鮮胺，二者復(fù)配能降低田間施藥成本。在使用化學(xué)藥劑開展田間橡膠炭疽病防治前，應(yīng)首先明確膠園中病原菌的種類及其比例，選擇合適的使用藥劑種類和使用濃度。本研究為橡膠樹炭疽病的科學(xué)用藥提供了理論支持，但在自然條件下﹐由于氣候、施藥時期和方式、藥劑與病原菌的接觸程度等因素，室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)的結(jié)果往往與田間試驗(yàn)獲得的結(jié)果有一定偏差。因此，本研究篩選的單劑及復(fù)配藥劑組合還需田間試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。