王 穎，吳紅芬，張 穎，汪劉浩，那 威，吳科榜

（海南大學(xué) 動物科技學(xué)院，?？?570228）

文昌雞是海南優(yōu)質(zhì)肉雞品種，具有覓食能力強、耐粗飼、耐熱、早熟等特點[1]，作為海南四大名菜之一，其皮薄滑爽，肉質(zhì)肥美，暢銷于全國各地及東南亞地區(qū)，深受廣大生產(chǎn)者和消費者喜愛。但文昌雞存在腹脂沉積過多的問題，腹脂沉積過多會降低雞的屠宰率和飼料轉(zhuǎn)化率[2]，還影響產(chǎn)蛋率及誘發(fā)疾病[3]，并影響人類健康，同時廢棄的腹脂也給環(huán)境造成污染，因此，如何降低腹脂過度沉積是文昌雞育種需要解決的問題。

脂聯(lián)素是一種脂肪細胞因子，由成熟脂肪細胞大量分泌，其通過與受體結(jié)合，激活下游通路[4]在糖脂代謝、葡萄糖的攝取、脂肪酸氧化等過程中發(fā)揮作用[5]。脂聯(lián)素能夠調(diào)控生物體的脂肪代謝，是至今發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負相關(guān)的脂肪細胞特異性蛋白[6]。脂聯(lián)素受體包括脂聯(lián)素受體R1和脂聯(lián)素受體R2、T-鈣粘蛋白（CDH13）[7]。由于CDH13可以和六聚體及高分子量的脂聯(lián)素結(jié)合而被認(rèn)為是脂聯(lián)素的第三類受體[8]。CDH13與血漿脂聯(lián)素水平、心血管風(fēng)險、糖尿病和脂肪肝[9]等肥胖因素有關(guān)，但關(guān)于其在雞脂質(zhì)代謝中的功能研究還未見報道。因此，本研究利用 RT-qPCR的方法檢測CDH13基因和脂聯(lián)素基因在文昌雞不同組織中及不同時期文昌雞腹部脂肪組織中的表達情況，旨在為后續(xù)深入研究CDH13的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物文昌雞雌雞，由海南省文昌市潭牛文昌雞股份有限公司提供，參照《DB 46/T44—2011，文昌雞飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程》[10]，實施規(guī)范的飼養(yǎng)管理，執(zhí)行正常的免疫程序。從105日齡開始籠養(yǎng)育肥。

1.1.2 組織樣的采取選取27日齡、52日齡、79日齡、105日齡和籠養(yǎng)育肥2周齡、4周齡、6周齡、8周齡8個飼養(yǎng)階段的各6只文昌雌雞，采集腹部脂肪組織裝入5 mL凍存管中，迅速放入液氮中速凍后置于?80 ℃冰箱中待用；采集育肥8周齡的3只（隨機選取3只）文昌雌雞的16種組織，每只個體每種組織分別采樣裝入5 mL凍存管中，迅速放入液氮中速凍后置于?80 ℃中保存。

1.1.3 實驗主要試劑與儀器臺式高速冷凍離心機（德國艾本德股份公司，Centrifuge 5 418 R），常規(guī)離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司，D1008E），微量移液器（德國艾本德股份公司，Research? plus 系列），微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司，Nano-100），熒光定量 PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，Q1000），電泳儀、電泳槽（美國伯樂有限公司，PowerPac 系列），超低溫冰箱（松下電器有限公司，MDF-682）。

TransZol Up（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（南京諾唯贊生物科技有限公司）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixR（南京諾唯贊生物科技有限公司）、氯仿、無水乙醇、異丙醇、DEPC水。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成利用Trizol法提取各種組織的總RNA，測定其濃度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。質(zhì)檢合格的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于 ?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計根據(jù)雞NCBI上脂 聯(lián) 素 基 因mRNA 序 列（NM_206 991），CDH13mRNA序列（NM_001001760.2）設(shè)計表達引物ADIPOQ-F/R、CDH13-F/R。內(nèi)參基因為TBP、HMBS[11]。引物堿基序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）實驗使用SYBR Green熒光染料法，反應(yīng)體系（10 μL）：2 ×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、上下游引物各0.2 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)反應(yīng)；熔解反應(yīng)95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.3 試驗數(shù)據(jù)分析利用SAS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P<0.05差異顯著；用Graphpad Prism 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1CDH13及脂聯(lián)素基因定性表達規(guī)律分析以籠養(yǎng)育肥8周齡文昌雌雞（隨機選取3只）的16種組織為實驗材料，每只個體每種組織分別提取總RNA后，每種組織按照等量RNA進行混合，得到該種組織的混合總RNA樣品后，進行反轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，CDH13基因在各個組織中均有表達，在心臟（H）、回腸（I）、肌胃周圍脂肪（GF）、嗉囊周圍脂肪（CF）、皮下脂肪（SF）、小腦（Cr）、腹部脂肪組織（AF）及肌胃（G）中表達量較高（圖1）。

圖1 CDH13基因在文昌雞16種組織中的表達情況

脂聯(lián)素基因在空腸（J）、心臟（H）、回腸（I）、肌胃周圍脂肪（GF）、嗉囊周圍脂肪（CF）、皮下脂肪（SF）、腹部脂肪組織（AF）、及肌胃（G）中表達量較高（圖2），與CDH13定性表達結(jié)果相似。

圖2 脂聯(lián)素基因在文昌雞16種組織中的表達情況

2.2CDH13及脂聯(lián)素在文昌雞腹部脂肪組織生長發(fā)育過程中的表達規(guī)律檢測27日齡、52日齡、79日齡、105日齡和籠養(yǎng)育肥2周齡、4周齡、6周齡、8周齡每個時期隨機選取6只文昌雌雞，采取腹部脂肪組織提取總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR實驗結(jié)果（圖3）顯示，CDH13在文昌雞腹部脂肪組織生長發(fā)育各個時期中均穩(wěn)定高表達，并育肥4周齡時，表達量達到最高。

圖3 CDH13和脂聯(lián)素基因在各個時期文昌雞腹部脂肪組織中的表達情況

3 討 論

脂肪組織作為一種內(nèi)分泌器官，能夠分泌多種細胞因子。脂聯(lián)素是機體的脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子。CDH13是脂聯(lián)素的受體之一。CDH13和脂聯(lián)素基因定性表達結(jié)果顯示，CDH13基因在文昌雞各個組織中廣泛表達；其在心臟、回腸、小腦、脂肪組織及肌胃中表達量較高。脂聯(lián)素在空腸、心臟、回腸、脂肪組織及肌胃中表達量較高，這與前人的研究結(jié)果一致。YUAN等[12]的研究結(jié)果顯示脂聯(lián)素在脂肪組織、胃、皮膚和心臟中高度表達。鵝脂聯(lián)素在脂肪、心臟和肌胃中高度表達，在小腸、腺胃、腎等組織中度表達，而在肝臟、脾臟和卵巢等組織低表達[13]。MADDINENI等[14]研究發(fā)現(xiàn)雞脂聯(lián)素在脂肪組織、肝臟、垂體前葉、間腦、骨骼肌、腎臟、卵巢和脾臟均表達，并在脂肪組織中表達最高，其次是肝臟、間腦、腎和骨骼肌。

本研究中CDH13和脂聯(lián)素基因定量表達結(jié)果顯示，脂聯(lián)素在育肥后文昌雞腹部脂肪組織中的表達量均低于育肥前。在人、猴子、小鼠中，脂肪組織脂聯(lián)素基因表達量隨脂肪過度沉積而下降，隨體重下降而上升[15]。育肥期是文昌雞脂肪快速沉積的時期，育肥期的脂肪含量顯著高于育肥前，這可能也是育肥后腹部脂肪組織中脂聯(lián)素的表達量低于育肥前的原因。CDH13是脂聯(lián)素的受體，CDH13定量表達結(jié)果和脂聯(lián)素相似，均在脂肪組織中高表達，暗示在脂肪組織中，CDH13基因可能發(fā)揮一定的作用，但作用機制尚不明確，有待深入研究。目前關(guān)于CDH13的研究較少，因此本研究檢測CDH13在文昌雞多種組織和腹部脂肪組織生長發(fā)育過程中的表達情況，可為今后CDH13基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

脂聯(lián)素受體CDH13在文昌雞各個組織中均有表達，在心臟、回腸、脂肪組織、小腦及肌胃組織中高度表達。在文昌雞腹部脂肪組織生長發(fā)育過程中，CDH13持續(xù)高表達。