范一敏,張利華,陳獻(xiàn)忠,曹鈺

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)

D-阿拉伯糖醇是一種重要的功能性糖醇,被美國能源部評(píng)為12種生物基平臺(tái)化合物之一[1]。D-阿拉伯糖醇具有與木糖醇相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及更低的熱量[2-3],作為具有潛力的糖替代品可用于治療肥胖和預(yù)防齲齒等健康相關(guān)領(lǐng)域[4]。生物法合成D-阿拉伯糖醇與化學(xué)法相比較,不需要昂貴的催化劑和高溫高壓的生產(chǎn)條件,具有綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)[5]。目前根據(jù)研究報(bào)道,能夠合成D-阿拉伯糖醇的酵母菌種類主要有假絲酵母屬[6]、德巴利酵母屬[7]、柯達(dá)酵母屬[8]、漢遜酵母屬[9]、接合酵母屬等[10]。酵母菌利用木糖合成D-阿拉伯糖醇可能經(jīng)過以下代謝途徑:木糖經(jīng)木糖還原酶催化得到木糖醇,木糖醇由木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase,XDH)得到木酮糖,木酮糖經(jīng)D-阿拉伯糖醇脫氫酶合成D-阿拉伯糖醇[11]。

21世紀(jì),利用木質(zhì)纖維素替代淀粉質(zhì)底物用于生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品已進(jìn)行了深入的研究[12]。除了木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生葡萄糖的代謝利用,半纖維素水解產(chǎn)生木糖的代謝利用也備受關(guān)注。然而在木質(zhì)纖維預(yù)處理中還會(huì)形成呋喃醛和酚醛等生物有毒產(chǎn)物,限制和影響了微生物的生長代謝[13]。熱帶假絲酵母具備出色的抗逆性和木糖利用能力,在利用木質(zhì)纖維素水解液合成化學(xué)品具有很大的潛力[14-16]。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建,帶有CRISPR Cas9編輯系統(tǒng)的尿嘧啶缺陷型熱帶假絲酵母CU-208出發(fā)菌株[17],參考文獻(xiàn)[18]的方法,鑒定內(nèi)源D-阿拉伯糖醇脫氫酶(D-arabitol dehydrogenase,ARD)基因功能。進(jìn)行如下代謝改造:敲除了木酮糖激酶(xylukinase,XKS)基因,阻斷木糖流向磷酸戊糖途徑,積累前體物質(zhì)木糖醇;過表達(dá)XDH基因,減少中間產(chǎn)物木糖醇的積累,過表達(dá)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的外源D-阿拉伯糖醇脫氫酶(D-arabitol dehydrogenase,ADH)基因,使D-木酮糖能轉(zhuǎn)化為D-阿拉伯糖醇。過表達(dá)6-磷酸-葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase， ZWF)基因,增強(qiáng)磷酸戊糖途徑,增加輔酶NADPH的積累;探索了一條以葡萄糖為輔助碳源,利用木糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的代謝改造方法(圖1)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和引物

本實(shí)驗(yàn)中所使用的載體pMD19-T Simple購自TaKaRa公司,菌株見表1,ATCC 20336為野生型菌株,CU-208為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建帶有CRISPR Cas9編輯系統(tǒng)的URA3缺陷型熱帶假絲酵母;質(zhì)粒Tm-gda324-URA3、Ts-PGAPDH-GFP-T、Ts-FAOF-gda324-URA3-FAOR、Ts-DLD24F-gda324-URA3-DLD24R、Ts-DLDsgRNA、Ts-sgRNA、Ts-sgURA3由本實(shí)驗(yàn)室保藏;引物M13F,M13R,FAO1-R,FAO1-F,ACT1-F,ACT1-R由本實(shí)驗(yàn)室保藏;PCR引物見表2,基因測序和基因合成由蘇州金唯智生物科技有限公司提供。

圖1 熱帶假絲酵母中D-阿拉伯糖醇的參考代謝途徑Fig.1 Reference metabolic pathway of D-arabitol in C.tropicalis注:XR:木糖還原酶(xylose reductase);EMP:糖酵解途徑(embden-meyerhof-parnas pathway);TCA:三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle);PPP:磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway);:外源途徑

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑和儀器

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10;YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20;MM平板(g/L):YNB 6.7，(NH4)2SO410，葡萄糖20;五氟乳清酸培養(yǎng)基(g/L):YNB 6.7，(NH4)2SO410，葡萄糖20，尿嘧啶0.02，五氟乳清酸2;木糖鑒定培養(yǎng)基(g/L):YNB 6.7,(NH4)2SO410,木糖20 ;葡萄糖鑒定培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖50;木糖發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10,YNB 1.7,(NH4)2SO410,葡萄糖20,木糖80;相應(yīng)的固體培養(yǎng)基在原有培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20 g/L的瓊脂粉。

D-阿拉伯糖醇標(biāo)品,壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;木糖標(biāo)品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司:5-氟乳清酸,上海麥克林生化科技有限公司;酵母RNA提取試劑盒,上海生物工程股份有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司;熒光定量PCR試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;胞內(nèi)NADPH試劑盒,上海維晟生物公司;PR-96EPCR擴(kuò)增儀,杭州米歐儀器有限公司;UV2000紫外可見分光光度計(jì),上海尤尼科有限公司,1260 Infinity高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;SBA-40C生物傳感儀,山東生物研究所。

建立縣、鎮(zhèn)、村三級(jí)實(shí)體化運(yùn)行的土地流轉(zhuǎn)服務(wù)平臺(tái)，承擔(dān)信息發(fā)布、主體引進(jìn)、審核發(fā)證（土地流轉(zhuǎn)經(jīng)營權(quán)證）、合同簽證、檔案管理等職能，三級(jí)服務(wù)組織已對(duì)外發(fā)布流出土地面積信息3.09萬公頃，需求土地面積1.69萬公頃，累計(jì)流轉(zhuǎn)土地面積5.29萬公頃，占總流轉(zhuǎn)面積的71.8%。同時(shí)，依托服務(wù)組織，開發(fā)農(nóng)村土地承包和流轉(zhuǎn)管理信息系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了土地承包和流轉(zhuǎn)的信息化管理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 敲除框的構(gòu)建

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室ATCC 20336基因組測序結(jié)果和NCBI進(jìn)行比對(duì),找到熱帶假絲酵母中D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因ard,用引物ARD-2F和ARD-2R,以熱帶假絲酵母基因組為模板PCR擴(kuò)增得到基因ard,使用連接酶SolutionI連接載體pMD19-T Simple得到質(zhì)粒Ts-ARD,測序驗(yàn)證正確,用UARD-1F和UARD-1R以Ts-ARD為模板,反向PCR得到載體片段ARDF-Ts-ARDR,用PstI和XbaI酶切ARDF-Ts-ARDR,用相同的酶,雙酶切Tm-gda324-URA3,得到片段gda324-URA3,用SolutionI連接片段ARDF-Ts-ARDR和gda324-URA3得到和Ts-ARDF-gda324-URA3-ARDR(圖2-a);同樣采取上述方法構(gòu)建得到質(zhì)粒Ts-XKSF-gda324-URA3-XKSR。

1.2.2 表達(dá)框的構(gòu)建

用引物ARD-1F,ARD-1R,以熱帶假絲酵母基因組為模板,擴(kuò)增基因ard,用Hind Ⅲ和SalⅠ 酶切質(zhì)粒Ts-PGAPDH-GFP-T,得到片段PGAPDH-Ts-T,將PGAPDH-Ts-T與基因ard一步連接,得到Ts-PGAPDH-ARD-T,用引物FAOPGAPDH-F和Termintor-R以Ts-PGAPDH-ARD-T為模板擴(kuò)增得到片段PGAPDH-ARD-T,使用PstⅠ 酶切質(zhì)粒Ts-FAOF-gda324-URA3-FAOR,得到片段FAOF-Ts-gda234-URA3-FAOR,將片段PGAPDH-ARD-T和FAOF-Ts-gda234-URA3-FAOR一步連接得到質(zhì)粒Ts-FAOF-PGAPDH-ARD-T-gda324-URA3-FAOR(圖2-b),同樣采取上述方法構(gòu)建質(zhì)粒Ts-XKSF-PGAPDH-XDH-T-gda324-URA3-XKSR,Ts-DLD24F-PGAPDH-ZWF-T-gda324-URA3-DLD24R。

1.2.3 sgRNA構(gòu)建

Ts-sgRNA為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒,以整合位點(diǎn)PAM前端20 bp的序列替換掉Ts-sgRNA上相應(yīng)的20 bp 序列,即可得到該位點(diǎn)的sgRNA。通過將待整合位點(diǎn)序列導(dǎo)入軟件SgRNACas9 V.3.0設(shè)計(jì)出sgRNA,設(shè)計(jì)SgRNAXKS-F和SgRNAXKS-R,SgRNAARD-F和SgRNAARD-R,SgRNAFAO-F和SgRNAFAO-R,以Ts-sgRNA為模板全質(zhì)粒PCR,用酶DpnI消化2 h消除原質(zhì)粒Ts-sgRNA,將消化完的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109,提質(zhì)粒后測序得到正確替換的質(zhì)粒,使用金唯智公司的通用引物M13 F和M13 R以正確的質(zhì)粒為模板,得到XKS、ARD、FAO位點(diǎn)的sgRNA,在酵母轉(zhuǎn)化時(shí)與敲除框或整合框一同轉(zhuǎn)化,能有效提高轉(zhuǎn)化效率。

a-ard基因敲除框;b-ard基因整合框圖2 ard 基因敲除框和ard 基因整合框的構(gòu)建Fig.2 Construction of ard disruption cassette and ard integration cassette

1.2.4 熱帶假絲酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化

熱帶假絲酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)[19],轉(zhuǎn)化子標(biāo)記基因URA3的彈出方法參考文獻(xiàn)[20]。

使用軟件Beacon Designer 7.9設(shè)計(jì)熒光定量所需要的引物QPCRARD-F和QPCRARD-R。參PCR考文獻(xiàn)[21]測定ARD基因轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.6 測定胞內(nèi)輔酶NADPH

將待測菌株劃線于YPD平板培養(yǎng)2～3 d,接種單菌落于20 mL YPD液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃搖床200 r/min過夜培養(yǎng)。使用上海維晟生物公司試劑盒NADP/NADPH Quantification Colorimetric Kit測定NADPH/NADPt,其中NADPt=NADPH+NADP+。

1.2.7 搖瓶實(shí)驗(yàn)

FYM01生長曲線:將待測菌株在YPD平板上劃線,接種單菌落于20 mL YPD液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃ 搖床中200 r/min過夜培養(yǎng),取1 mL于1.5 mL無菌離心管內(nèi),用無菌水洗凈殘余培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)接于木糖鑒定培養(yǎng)基中,每12 h測定1次OD600值。

重組菌株搖瓶發(fā)酵:將發(fā)酵菌株劃線于YPD平板,接種單菌落于20 mL YPD液體培養(yǎng)基,置于30 ℃,200 r/min搖床過夜培養(yǎng),轉(zhuǎn)接于50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng),隔12 h測OD600值,取樣1 mL存于-20 ℃,待測定發(fā)酵液中成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源D-阿拉伯糖醇脫氫酶的功能鑒定

2.1.1 內(nèi)源D-阿拉伯糖醇酶基因敲除與過表達(dá)

為了研究ARD對(duì)D-阿拉伯糖醇合成的影響,我們以CU-208為出發(fā)菌株,利用CRISPR Cas9敲除了基因組上的ard基因。其中敲除框質(zhì)粒Ts-ARDF-gda324-URA3-ARDR用XbaI、PstI雙酶切,獲得大小為3.3 kb,1.9 kb的片段(圖3-a);用引物ARD-2F和ARD-2R以Ts-ARD-gda324-URA-ARD為模板擴(kuò)增出線性片段ARDF-gda324-URA-ARDR后,用于轉(zhuǎn)化,用同源臂外側(cè)引物VARD-2F和同源臂內(nèi)側(cè)引物ARD-2R驗(yàn)證,正確轉(zhuǎn)化子大小2.6 kb(圖3-b),得到菌株ARDD。

據(jù)野生型熱帶假絲酵母ATCC 20336全基因組測序和NCBI比對(duì)得到D-阿拉伯糖醇脫氫酶序列,以ATCC 20336基因組為模板擴(kuò)增得到0.8 kb的ard基因(圖3-c)，測序正確。以構(gòu)建好的Ts-FAO-PGAPDH-ARD-T-gda324-URA3-FAO為模板,用引物FAO1-F和FAO1-R擴(kuò)增出片段FAO-PGAPDH-ARD-T-gda324-URA3用于轉(zhuǎn)化,獲得的轉(zhuǎn)化子提取基因組,用同源臂外側(cè)引物VFAOF和外側(cè)引物FAO1-R驗(yàn)證,結(jié)果見圖3-d。野生型菌株ATCC 20336的擴(kuò)增片段大小為3.3 kb,過表達(dá)ard基因轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增片段為5.3 kb,得到驗(yàn)證正確菌株ARDO。

2.1.2 內(nèi)源D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

以肌動(dòng)蛋白基因(act)為內(nèi)參基因,測定菌株ATCC 20336、ARDD和ARDO的內(nèi)源基因ard轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示,由于菌株ARDD中已敲除ard基因,并未檢測到ard基因轉(zhuǎn)錄信號(hào)(圖4)。而由于菌株ARDO中過表達(dá)ard基因,相對(duì)豐度為對(duì)照的15.7倍。結(jié)果表明ARDD的ard基因成功敲除,且ARDO的ard基因轉(zhuǎn)錄水平較高,成功過表達(dá)ard基因。

a-質(zhì)粒Ts-ARDF-gda324-URA3-ARDR-酶切驗(yàn)證增(M-5 000 bp核酸marker,1-質(zhì)粒酶切);b-ard基因敲除(M-5 000 bp核酸marker,1-ard 敲除基因轉(zhuǎn)化子,2-ATCC 20336對(duì)照);c-基因ard 擴(kuò)增結(jié)果(M-5 000 bp核酸marker,1-ard 基因);d-ard 基因整合(M-10 000 bp核酸marker,1-ATCC 20336對(duì)照,2～3-ard基因整合轉(zhuǎn)化子)圖3 ard基因敲除與ard 基因整合菌株的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR identification of ard gene disruption and ard gene integration strains

圖4 ard基因在不同菌株中的表達(dá)水平Fig.4 Gene expression levels of ard in different strains

2.1.3 敲除或過表達(dá)內(nèi)源D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因?qū)-阿拉伯糖醇產(chǎn)量的影響

將菌株ATCC 20336,ARDD,ARDO轉(zhuǎn)接于 50 mL 葡萄糖鑒定培養(yǎng)基中,放置于30 ℃搖床,轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)108 h后,D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量見圖5,菌株ATCC 20336、ARDD和ARDO的D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量分別為2.293、3.84、1.71 g/L,菌株ARDD的D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量高于野生型菌株,而菌株ARDO的D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量低于野生型菌株,由此分析可知在熱帶假絲酵母中ard基因可能參與分解D-阿拉伯糖醇。

圖5 菌株ATCC 20336、ARDD和ARDO在葡萄糖鑒定培養(yǎng)基中D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量Fig.5 Production of D-arabitol by strains ATCC 20336,ARDD and ARDO in glucose identification medium

2.2 利用木糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的熱帶假絲酵母的構(gòu)建與評(píng)估

2.2.1 木酮糖激酶基因敲除與木糖醇脫氫酶基因過表達(dá)

以CU-208為出發(fā)菌株,敲除木酮糖激酶同時(shí)過表達(dá)木糖醇脫氫酶構(gòu)建FYM01,步驟參考 2.1.1。將菌株FYM01和野生型菌株ATCC 20336分別接種于20 mL木糖鑒定培養(yǎng)基中,每隔12 h測定OD600值,結(jié)果見圖6,FYM01的生長受到了明顯的限制,這是因?yàn)镕YM01敲除了木糖代謝途徑中的木酮糖激酶,阻斷了木糖下游代謝途徑,無法從木糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑,所以在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中,木糖無法作為提供生長的所需的能量,菌株無法生長。

圖6 菌株ATCC 20336和FYM01在木糖鑒定培養(yǎng)基中的生長情況Fig.6 Growth curve of strains ATCC 20336 and FYM01in xylose identification medium

2.2.2 外源D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因adh的過表達(dá)對(duì)D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量的影響

分別以CU-208和FYM02T為出發(fā)菌株,過表達(dá)來源于圓紅冬孢酵母的外源D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因adh,獲得菌株FYM03和FYM04,步驟參考2.1.1。將菌株ATCC 20336,FYM03,FYM04轉(zhuǎn)接至50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基,放置于30 ℃搖床,轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)108 h后,測定D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量,結(jié)果見圖7,過表達(dá)外源D-阿拉伯糖醇脫氫酶后,相對(duì)于野生型菌株ATCC 20336D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量有明顯提升。菌株ATCC 20336、FYM03和FYM04D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量分別為0.92、6.42、4.72 g/L,FYM03和FYM04分別相較于野生型提高了6.97倍和5.13倍,其中ATCC 20336與 FYM03將木糖完全利用,而FYM04發(fā)酵只利用了21.36 g木糖。推測可能是阻斷木糖途徑后,將導(dǎo)致還原力供應(yīng)不足,木糖無法有效的利用[22-23],需增強(qiáng)輔酶的供應(yīng)。

圖7 菌株ATCC 20336、FYM03和FYM04在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量Fig.7 Production of D-arabitol by strains ATCC 20336,FYM03 and FYM04 in xylose fermentation medium

2.2.3 過表達(dá)內(nèi)源葡萄糖-6-磷酸脫氫酶對(duì)的胞內(nèi)NADPH濃度的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道文獻(xiàn)[22],過表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf可以增加代謝路徑中NADPH的供應(yīng)。在FYM04T的基礎(chǔ)上過表達(dá)zwf構(gòu)建FYM05,步驟參考2.1.1,將菌株接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中置于30 ℃搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min培養(yǎng)24 h后,使用NADP/NADPH Quantification Colorimetric Kit試劑盒測定過表達(dá)zwf的FYM05和野生菌株ATCC 20336胞內(nèi)NADPH/NADPt,結(jié)果見圖8,在過表達(dá)了內(nèi)源基因zwf后,NADPH/NADPt的比值達(dá)到了0.445。說明過表達(dá)zwf基因有效增強(qiáng)了胞內(nèi)的磷酸戊糖途徑,積累更多了的NADPH,使得細(xì)胞獲得了更多的還原力。

圖8 菌株ATCC 20336和FYM05胞內(nèi)NADPH/NADPt比例Fig.8 The intracellular NADPH/NADPt ratio in strains ATCC 20336 and FYM05

2.3 重組菌株FYM05發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇

將菌株ATCC 20336和FYM05轉(zhuǎn)接50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min發(fā)酵108 h,測定發(fā)酵過程中的OD600值、木糖、葡萄糖、D-阿拉伯糖醇濃度變化,結(jié)果如圖9所示,圖9-a是ATCC 20336和FYM05在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長情況,菌株FYM05在36 h之后生長變得緩慢,結(jié)合圖9-b,在36 h后,葡萄糖耗盡,因?yàn)榫闒YM05敲除了木酮糖激酶基因xks,無法利用木糖生長,所以生長進(jìn)入穩(wěn)定期,而野生型菌株ATCC 20336能繼續(xù)以木糖作為生長碳源,圖9-b反應(yīng)培養(yǎng)基中木糖和葡萄糖的濃度,FYM05在葡萄糖利用完之后,繼續(xù)了利用34.17 g/L木糖,仍有45.83 g/L木糖沒有被利用,這可能與發(fā)酵后期菌體生長受到限制有關(guān),而野生型菌株ATCC 20336能夠在葡萄糖耗盡后將木糖利用完。圖9-c反映D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量,FYM05在96 h時(shí)達(dá)到最高產(chǎn)量11.35 g/L,相較于野生型菌株ATCC 20336在84 h達(dá)到的最高產(chǎn)量0.97 g/L提高了11.7倍。

a-ATCC 20336和FYM05生長曲線;b-發(fā)酵液中木糖和葡萄糖的濃度;c-發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量圖9 菌株ATCC 20336和FYM05在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果Fig.9 Fermentation results of strains ATCC 20336 and FYM05 in xylose fermentation medium

3 結(jié)論與討論

本研究從熱帶假絲酵母木糖代謝途徑出發(fā),鑒定了熱帶假絲酵母內(nèi)源基因ard參與了D-阿拉伯糖醇的分解;并開發(fā)了以木糖為底物生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的代謝途徑改造策略,通過敲除木酮糖激酶并過表達(dá)木糖醇脫氫酶,阻斷了木糖利用途徑并強(qiáng)化木糖合成D-阿拉伯糖醇上游途徑,使菌株不能利用木糖生長,敲除內(nèi)源基因ard,減少D-阿拉伯糖醇的消耗,表達(dá)外源基因adh,使熱帶假絲酵母可以利用木糖合成D-阿拉伯糖醇。而在阻斷木糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑后,菌體還原力不足,導(dǎo)致木糖利用受抑制,過表達(dá)內(nèi)源基因zwf,增強(qiáng)了磷酸戊糖途徑,提供了更多的NADPH。經(jīng)過上述改造后,獲得了1株以木糖為底物生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的菌株FYM05,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,其產(chǎn)D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量較野生型菌株ATCC 20336提高了11.7倍。但是目前仍然存在一些問題,比如在敲除木酮糖激酶后,木糖不能完全被用于生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇,以及D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量還有較大的提升空間等。

本研究探索了熱帶假絲酵母利用木糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇代謝改造方法,得到1株D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量為11.35 g/L的菌株,為針對(duì)酵母利用木糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的代謝改造和進(jìn)一步研究酵母利用半纖維素生成D-阿拉伯糖醇提供了參考。