程偉,陳雪峰,陳興杰,周端,付歡,薛錫佳,鹿靜靜,代森

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,陜西 西安,710021)2(安徽金種子酒業(yè)股份有限公司,安徽 阜陽,236023) 3(陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院,陜西 西安,710021)

中國白酒以大曲作為釀造的糖化、發(fā)酵、酒化與生香劑,大曲培養(yǎng)過程中富集的環(huán)境微生物是白酒釀造微生物的重要來源;同時(shí),大曲質(zhì)量對白酒的出酒率及品質(zhì)具有重要影響[1-2]。微生物群落結(jié)構(gòu)對大曲質(zhì)量及原酒的風(fēng)格和品質(zhì)具有重要影響,研究大曲微生物及其與質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)聯(lián),對明確白酒風(fēng)格特點(diǎn)具有重要意義。大曲微生物主要包括細(xì)菌和真菌兩大類,其中真菌在釀酒過程的產(chǎn)酒、產(chǎn)酶、產(chǎn)香等方面起到重要作用[3]。近年來,采用高通量測序?qū)Υ笄⑸镞M(jìn)行了較多研究。如施思等[4]利用高通量測序?qū)庀阈痛笄A藏階段的真菌多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明貯藏階段大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)不斷變化,畢赤酵母屬、根霉屬和恒梗霉屬為最終的優(yōu)勢菌群。關(guān)于大曲微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的研究也有報(bào)道,通過整合宏基因組學(xué)與宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并基于鑒定功能酶的物種注釋分析,有助于建立大曲微生物組與酶系的關(guān)聯(lián)[5]。如柳習(xí)月等[6]采用多組學(xué)解析醬香型大曲風(fēng)味物質(zhì)的形成,結(jié)果表明不同曲種中的微生物、酶和代謝產(chǎn)物之間存在相關(guān)性;其中,芽孢桿菌與糖化酶、蛋白酶和四甲基吡嗪等呈正相關(guān)。絲狀真菌為大曲提供糖化動(dòng)力,并對大曲培養(yǎng)起到關(guān)鍵作用;同時(shí),大曲中的霉菌代謝產(chǎn)生糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶系,此類酶系對降解發(fā)酵原料和產(chǎn)生酒體風(fēng)味物質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)[7]。

當(dāng)前,關(guān)于大曲微生物結(jié)構(gòu)及其與質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性研究逐漸增多[8-9]。如李丹宇[10]研究發(fā)現(xiàn)在制曲過程中,大曲的糖化力、液化力和蛋白分解力等指標(biāo)與大曲中的真菌數(shù)量和種類呈正相關(guān)。然而,關(guān)于不同產(chǎn)區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)及其與質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)聯(lián)研究還鮮有報(bào)道,尤其是曲皮及曲心的真菌群落結(jié)構(gòu)與質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析較少。本實(shí)驗(yàn)通過高通量測序解析不同產(chǎn)區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu),并與大曲質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,旨在為解析濃香型大曲的糖化生香機(jī)理及篩選優(yōu)良釀造功能微生物提供依據(jù),同時(shí)對大曲微生物組信息擴(kuò)充具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品均為培養(yǎng)成熟剛?cè)霂熨A存的濃香型大曲,分別取自四川宜賓(YB)、四川瀘州(LZ)、山東濟(jì)寧(JN)、安徽阜陽(FY)、安徽亳州(BZ)和安徽臨泉(LQ)等地區(qū)。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(均為分析純),天津市永大化學(xué)試劑有限公司;飽和酚、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸-Na2、十六烷基三甲基溴化銨(cetrimonium bromide,CTAB)(均為分析純),北京索萊寶科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷(分析純),美國Sigma-Aldrich公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,美國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20M高速冷凍離心機(jī)、超低溫冰箱,上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;GeneAmp@9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCPO儀,美國ABI公司;MX.S型可調(diào)式混勻儀,美國SCILOGEX公司;QuantiFluor型-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng),美國Promega公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取樣方法

分別取大曲表層1～2 cm的曲料作為曲皮樣品(S組),取曲塊中心2～3 cm3區(qū)域的曲料作為曲心樣品(I組),隨機(jī)取3個(gè)平行樣本,再分別平均分為2份;其中1份在無菌環(huán)境下將每個(gè)曲樣的3個(gè)平行樣品分別單獨(dú)等量混合粉碎后,保存于無菌袋中,置于-80 ℃冰箱準(zhǔn)備真菌群落結(jié)構(gòu)分析;另1份將每個(gè)曲樣的3個(gè)平行樣品分別單獨(dú)等量混合粉碎后,保存于普通樣品袋中,置于4 ℃冰箱準(zhǔn)備進(jìn)行質(zhì)量指標(biāo)檢測。

1.3.2 大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析

大曲微生物DNA提取:采用改良的CTAB法[11]提取大曲微生物總DNA,最后向離心管中加入 200 μL 無菌雙蒸水使DNA沉淀溶解,并貯于-20 ℃冰箱備用,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增定量:以稀釋后的基因組DNA為模板,選擇測序區(qū)域并使用帶Barcode的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer:New England Biolabs)和高效高保真酶進(jìn)行PCR,以確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性;引物對應(yīng)區(qū)域:ITS1區(qū)引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)。

PCR產(chǎn)物的混樣和純化:使用20 g/L的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測;對檢測合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化,采用酶標(biāo)定量并根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,對目的條帶使用凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

文庫構(gòu)建和上機(jī)測試:采用TruSeq?DNA PCR- Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。建庫與測序在蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖:高通量測序完成后,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與序列優(yōu)化[12]。根據(jù)序列的相似性,將序列相似性大于等于97%分歸為同一操作分類單元(opera- tional taxonomic units,OTU),將所有序列與Silva庫(版本SILVA_138.1)比對得到序列的分類學(xué)信息;構(gòu)建稀釋曲線和Shannon曲線,判斷取樣的合理性和測序量、測序深度的有效性;利用生信云平臺、R語言和AI作圖工具繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等[13]。

1.3.3 大曲質(zhì)量指標(biāo)檢測

參照輕工行業(yè)大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》)的相關(guān)方法,分別檢測各樣品的水分、酸度、淀粉和還原糖等理化指標(biāo),以及發(fā)酵力、糖化力和酯化力等生化指標(biāo);其中,酯化力的測定采用酯化72 h作為反應(yīng)時(shí)間,其單位是mg/(g·72 h);各樣品的質(zhì)量指標(biāo)均分別檢測3次取平均值。

1.4 大曲真菌群落結(jié)構(gòu)與質(zhì)量指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析

利用SPSS軟件對曲皮與曲心中的優(yōu)勢真菌屬(相對豐度≥1%)及其質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,以分析兩者之間的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲真菌多樣性分析

2.1.1 序列統(tǒng)計(jì)與有效性分析

對各樣品的DNA進(jìn)行測序,測序序列經(jīng)質(zhì)控過濾后分別得到71 295～91 030條真菌的有效序列,其平均長度為217～269 bp,聚類分析共產(chǎn)生3 379個(gè)OTU分類。稀釋曲線通常用來比較測序數(shù)據(jù)量及物種豐富度,當(dāng)曲線趨向平緩時(shí),更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU,反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[14]。由本實(shí)驗(yàn)的稀釋曲線和Shannon曲線以及表1可知,覆蓋率在99%相似度的OTU水平進(jìn)行Chao1指數(shù)計(jì)算以估計(jì)物種總數(shù),隨著測序深度的增加,Chao1指數(shù)曲線逐步趨于平緩,表明本次實(shí)驗(yàn)的取樣合理,結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況。

2.1.2 Alpha多樣性分析

通過樣品的微生物多樣性分析(Alpha多樣性),可以反映微生物群落的豐度和多樣性[15]。由表1可知,12個(gè)樣品的覆蓋率均大于0.999,表明各樣品文庫的覆蓋率較高,樣品序列基本被完全測出,本測序結(jié)果可靠。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均能表現(xiàn)出樣品中物種的豐富度、均勻度及多樣性。由表1可知,JNS的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于其他樣品,表明JNS中的物種豐富度、均勻度及多樣性均最高。Ace指數(shù)用于計(jì)算群落豐度,其值越大說明樣品中微生物的豐度越高,由表1的Ace指數(shù)可知,BZS的群落豐度高于其他樣品。Chao1指數(shù)能估算樣品中的物種數(shù)目(即OTU數(shù)目),由表1的Chao1指數(shù)可知,BZS和JNI的物種總數(shù)在對應(yīng)樣品組中均高于其他樣品。

表1 不同大曲樣品真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of fungal in different Daqu samples

2.1.3 OTU分布的Venn分析

對獲取的OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類,并對樣品之間相對共有及獨(dú)有的OTU數(shù)進(jìn)行疊加,得到OTU分布Venn圖,以比較OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況[16]。如圖1所示,S組的真菌OTU總數(shù)為651個(gè),共有OTU數(shù)為43個(gè),占OTU總數(shù)的6.6%;BZS的OTU數(shù)為150個(gè),占OTU總數(shù)的6.6%。I組的真菌OTU總數(shù)為719個(gè),共有OTU數(shù)為47個(gè),占OTU總數(shù)的6.5%;LQI的OTU數(shù)為175個(gè),占OTU總數(shù)的24.34%;JNI的OTU數(shù)為94個(gè),占OTU總數(shù)的13.07%,LQI和JNI的OTU數(shù)占比均較高。

對S組而言,43個(gè)共有OTU數(shù)占FYS總OTU數(shù)的45.57%,其占比在S組中最高;43個(gè)共有OTU數(shù)占BZS總OTU數(shù)的28.67%,其占比在S組中最低。對I組而言,47個(gè)共有OTU數(shù)占BZI總OTU數(shù)的54.02%,其占比在I組中最高;47個(gè)共有OTU數(shù)占LQI總OTU數(shù)的26.86%,其占比在I組中最低。綜上表明,FYS和BZI在對應(yīng)樣品組中的真菌多樣性最高,BZS和LQI在對應(yīng)樣品組中的真菌多樣性最低,也可以反映出不同地區(qū)的大曲真菌群落結(jié)構(gòu)具有差異性。

a-曲皮樣品(S組);b-曲心樣品(I組)圖1 不同大曲樣品真菌OTU的差異性(花瓣圖)Fig.1 OTU variability of fungal in different Daqu samples(petal diagram)

2.2 大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 大曲微生物真菌門的分類

將各類OTU的代表序列與Unite的真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,得到每個(gè)OTU在不同分類水平的物種分類信息。如圖2-a所示,S組和I組的真菌組成均可歸為子囊菌門(Ascomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)等3個(gè)菌門,其在S組的占比分別為52.52%、41.6%和0.6%,在I組的占比分別為87.41%、9.2%和0.9%;其中,兩個(gè)樣品組的優(yōu)勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota),其豐度均在50%以上,同時(shí)子囊菌門(Ascomycota)在I組中占有絕對優(yōu)勢。張會(huì)敏等[17]利用ITS rDNA克隆文庫法分析古井貢酒大曲(中溫大曲)的真核群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明中溫大曲的真菌組成可歸子囊菌門(Ascomycota)、毛霉亞門(Mucoromycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)等3個(gè)菌門,該研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。

此外,如圖2-b所示,在S組中,BZS和LQS中毛霉菌門(Mucoromycota)的占比分別為5.46%和7.21%,低于其他曲皮樣品;而BZS和LQS中的子囊菌門(Ascomycota)占比分別為90.94%和82.45%,明顯高于其他曲皮樣。在I組中,LQI中子囊菌門(Ascomycota)的占比為63.3%,明顯低于其他曲心樣品;而LQI中毛霉菌門(Mucoromycota)的占比為44.48%,明顯高于其他曲心樣品。

a-不同樣品組;b-不同樣品圖2 不同大曲樣品真菌門水平的相對豐度柱狀圖Fig.2 Column chart of relative abundance at fungal phyla level in different Daqu samples

2.2.2 大曲微生物真菌屬的分類

如圖3-a所示,S組中總體豐度較高的有根霉屬(Rhizopus,19.91%)、根毛霉屬(Rhizomucor,19.4%)、布氏白粉菌屬(Blumeria,17.57%)和散囊菌屬(Eurotium,12.8%),其中根霉屬(Rhizopus)的占比最高;I組中總體豐度較高的有嗜熱真菌屬(Thermomyces,26.04%)、散囊菌屬(Eurotium,21.69%)和嗜熱子囊菌屬(Thermoascus,19.37%),其中嗜熱真菌屬(Thermomyces)的占比最高。綜上可知,S組中的霉菌占比較高,霉菌分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等實(shí)現(xiàn)對制曲原料中大分子物質(zhì)的降解,為其他微生物的生長提供可利用的小分子營養(yǎng)物質(zhì)[18]。嗜熱真菌屬(Thermomyces)在I組中的占比明顯高于S組,這可能是因?yàn)闈庀阈痛笄嗲^程中的最高品溫一般在50 ℃以上,且曲心的溫度普遍高于曲皮的溫度,而大多數(shù)真菌的最適生長溫度在20～30 ℃左右,致死溫度在50～60 ℃左右;同時(shí),溫度是影響大曲微生物菌群形成的內(nèi)源性動(dòng)力[19];因此,部分耐熱和嗜熱真菌屬可以在曲心中存活。

此外,酵母菌屬(Saccharomyces)在S組和I組中的占比分別為0.36%和0.05%,S組中酵母菌屬(Saccharomyces)的占比明顯高于I組,這可能與培曲過程中曲皮與曲心的溫度差異有關(guān);同時(shí),培曲過程中曲皮與曲心在濕度、通風(fēng)及含氧等方面均存在差異,也是導(dǎo)致酵母菌屬(Saccharomyces)占比差異的重要因素。制曲過程可以富集釀酒酵母和生香酵母等多種類型的酵母菌,在白酒發(fā)酵過程中酵母菌代謝產(chǎn)生醇類和酯類等風(fēng)味物質(zhì),酵母類群對白酒發(fā)酵具有重要作用[20]。

如圖3-b所示,對S組而言,FYS中的根霉屬(Rhizopus,62.77%)占比最高,其次是YBS中的根霉屬(Rhizopus,24.2%)和JNS中的根霉屬(Rhizopus,21.02%),這可能與阜陽地區(qū)大曲(LZ)的培曲溫度低于其他5個(gè)地區(qū)有關(guān),其溫度適宜于根霉屬(Rhi-zopus)等真菌的生長。根霉屬(Rhizopus)具有重要的工業(yè)應(yīng)用,如米根霉(R.oryzae)代謝產(chǎn)生的淀粉酶可用于制曲與釀酒,華根霉(R.chinensis)和少根根霉(R.arrhizus)等可代謝產(chǎn)生乳酸,匐枝根霉(R.stoloni-fer)還能轉(zhuǎn)化甾族化合物,也可應(yīng)用于甾體激素、延胡索酸和酶制劑的生產(chǎn)[21]。

值得注意的是,根毛霉屬(Rhizomucor)在LZS、YBS和JNS中的占比分別是55.5%、48.86%和11.78%,高于其他曲皮樣品。對I組而言,LZI中的嗜熱真菌屬(Thermomyces,86.66%)占比最高,其次是FYI中的嗜熱真菌屬(Thermomyces,44.61%)和BZI中的嗜熱真菌屬(Thermomyces,17.38%)。曲心中嗜熱真菌屬(Thermomyces)占比的差異可能是由于不同產(chǎn)區(qū)大曲的培曲過程中曲心頂溫的差異,進(jìn)而對嗜熱真菌屬(Thermomyces)的生長產(chǎn)生不同影響。同樣,LZS中嗜熱真菌屬(Thermomyces,7.86%)的占比在S組中最高;因此,可以推斷瀘州地區(qū)大曲(LZ)的培曲溫度高于其他5個(gè)地區(qū)。夏玙等[22]采用高通量測序分析瀘州某企業(yè)大曲的真菌群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、曲霉菌屬(Aspergillus)等霉菌是大曲中的優(yōu)勢真菌類群,這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。

此外,酵母菌屬(Saccharomyces)在FYS中的占比達(dá)到17.1%,而在JNS和BZS中的占比分別為2.12%和2.01%,在其他曲皮樣品中的占比均低于1.00%;同時(shí),酵母菌屬(Saccharomyces)在LQI中的占比達(dá)到1.83%,而在其他曲心樣品中占比均低于1.00%。綜上可知,酵母菌屬(Saccharomyces)在FYS中的占比明顯高于其他樣品,這可能與阜陽地區(qū)的曲樣(FY)采用強(qiáng)化制曲工藝有關(guān),其原因還有待于進(jìn)一步分析。地域環(huán)境、制曲工藝和培曲環(huán)境等是造成釀酒微生物群落結(jié)構(gòu)差異的重要原因[23-24],綜上可知,不同地區(qū)濃香型大曲曲皮中的優(yōu)勢菌屬為根霉屬,曲心中的優(yōu)勢菌屬為嗜熱真菌屬;同時(shí),可以推斷濃香型大曲培曲溫度的控制和選擇對大曲真菌群落結(jié)構(gòu)具有重要影響。

a-不同樣品組;b-不同樣品圖3 不同大曲樣品真菌屬水平的相對豐度柱狀圖Fig.3 Column chart of relative abundance at fungal genus level in different Daqu samples

2.3 大曲質(zhì)量指標(biāo)分析

酒曲微生物代謝產(chǎn)生豐富的酶類,對白酒發(fā)酵過程的糖化和風(fēng)味代謝具有重要影響[25]。大曲的水分、酸度等理化指標(biāo)在一定程度上能夠反映大曲的質(zhì)量;同時(shí),大曲的糖化力、酯化力等生化指標(biāo)反映了大曲酶系的功能組成及微生物的生長代謝情況,也可作為大曲質(zhì)量評價(jià)的重要依據(jù)。如表2所示,曲心樣品的水分、酸度、還原糖和酯化力均普遍高于曲皮樣品,曲皮樣品的淀粉、發(fā)酵力和糖化力均普遍高于曲心樣品。

糖化力反映了大曲中糖化酶的酶活力,其主要由霉菌和芽孢桿菌產(chǎn)生,研究表明絲狀真菌能夠提高大曲的糖化力[26]。由表2可知,JNS的糖化力最高[972 mg/(g·h)],可以推測JNS中絲狀真菌的豐度占比可能也較高。由圖3可知,JNS中的根霉屬(Rhizopus)和根毛霉屬(Rhizomucor)占比分別為21.02%和11.78%,其豐度占比均較高。酯化力反映了大曲中酯化酶催化酸類和醇類生成酯類物質(zhì)的能力,發(fā)酵力則體現(xiàn)了大曲微生物發(fā)酵產(chǎn)酒的能力。由表2可知,BZI的發(fā)酵力和酯化力均最高,分別為0.22 U和13 mg/(g·72 h);FYS的發(fā)酵力和酯化力分別為0.21U和12 mg/(g·72 h),均處于較高水平,這可能與FYS中的酵母菌屬(Saccharo-myces,17.1%)占比明顯高于其他樣品有關(guān)。綜上可知,不同地區(qū)大曲的真菌群落組成與質(zhì)量指標(biāo)均存在差異。

表2 不同大曲樣品質(zhì)量指標(biāo)的檢測結(jié)果Table 2 Detection results of quality indicators of different Daqu samples

2.4 大曲真菌群落結(jié)構(gòu)與質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

濃香型大曲培養(yǎng)過程中,其曲皮和曲心的微環(huán)境差異是導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)差異的重要原因,如曲心的溫度高于曲皮可能導(dǎo)致嗜熱菌在曲心中更具優(yōu)勢;同樣,微生物的群落代謝也會(huì)影響環(huán)境因子,如水分、酸度、淀粉和還原糖等;同時(shí),大曲的發(fā)酵力、糖化力和酯化力等生化指標(biāo)也受到微生物群落代謝的影響。為解析大曲質(zhì)量指標(biāo)與真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián),利用SPSS軟件對曲皮與曲心的優(yōu)勢真菌屬(相對豐度≥1%)及質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析(圖4),采用Spearman秩相關(guān)研究質(zhì)量指標(biāo)與物種豐富度(Alpha多樣性)之間的關(guān)系,得到兩者之間的相關(guān)性和顯著性P值[27]。

M-水分;A-酸度;S1-淀粉;Rs-還原糖;Fa-發(fā)酵力;Sa-糖化力;Ea-酯化力圖4 基于屬水平的大曲真菌群落結(jié)構(gòu)與質(zhì)量指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析Fig.4 Spearman correlation analysis of fungal community structure and physicochemical indexes based on genus level注:縱向?yàn)榄h(huán)境因子信息,橫向?yàn)槲锓N信息,熱圖對應(yīng)的值為Spearman相關(guān)系數(shù)r,-10為正相關(guān);*表示顯著性檢驗(yàn)P<0.05,**表示顯著性檢驗(yàn)P<0.01

由圖4可知,嗜熱真菌屬(Thermomyces)與水分呈極顯著正相關(guān),被孢霉屬(Mortierella)與還原糖呈極顯著正相關(guān),根霉屬(Rhizopus)、匍柄霉屬(Stem-phylium)和鏈格孢屬(Alternaria)與糖化力呈顯著正相關(guān),羅薩氏菌屬(Rasamsonia)與酯化力呈極顯著正相關(guān)。值得關(guān)注的是與質(zhì)量指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)的真菌群落,如根霉屬(Rhizopus)與水分呈顯著負(fù)相關(guān),匍柄霉屬(Stemphylium)與酸度呈顯著負(fù)相關(guān),羅薩氏菌屬(Rasamsonia)與淀粉呈顯著負(fù)相關(guān),克魯維酵母屬(Kluyveromyces)與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān),曲霉屬(As-peigillus)與發(fā)酵力呈顯著負(fù)相關(guān),根霉屬(Rhizopus)、酵母菌屬(Saccharomyces)、盤菌屬(Peziza)和牛肝菌屬(Retiboletus)與酯化力呈顯著負(fù)相關(guān)。確定與大曲質(zhì)量指標(biāo)相關(guān)性顯著的真菌菌屬,并通過篩選純化等技術(shù)獲得單菌株,再應(yīng)用于強(qiáng)化制曲過程中,對提高大曲質(zhì)量具有重要意義,這也是未來的研究方向。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過高通量測序解析不同地區(qū)濃香型大曲中的真菌群落結(jié)構(gòu),并采用Spearman相關(guān)性分析真菌群落結(jié)構(gòu)及其與質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)聯(lián),得到的結(jié)論有:(1)不同地區(qū)濃香型大曲的曲皮共有真菌OTU為43個(gè)、曲心共有真菌OTU為47個(gè),曲皮主要真菌類群為子囊菌門(Ascomycota,52.52%),毛霉菌門(Mu- coromycota,41.60%),曲心主要真菌類群為子囊菌門(Ascomycota,87.41%);其中,曲皮中的根霉屬(Rhi-zopus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、布氏白粉菌屬(Blumeria)和散囊菌屬(Eurotium)為優(yōu)勢菌屬,曲心中的嗜熱真菌屬(Thermomyces),散囊菌屬(Euroti-um)和嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)為優(yōu)勢菌屬,其豐度均在10%以上;(2)質(zhì)量指標(biāo)與真菌群落的Spearman相關(guān)性分析表明,嗜熱真菌屬(Thermomy-ces)與水分呈極顯著正相關(guān),被孢霉屬(Mortierella)與還原糖呈極顯著正相關(guān),根霉屬(Rhizopus)、匍柄霉屬(Stemphylium)和鏈格孢屬(Alternaria)與糖化力呈顯著正相關(guān),羅薩氏菌屬(Rasamsonia)與酯化力呈極顯著正相關(guān)。本研究為進(jìn)一步解析濃香型大曲的糖化生香機(jī)理及篩選優(yōu)良釀造功能微生物提供依據(jù),同時(shí)對大曲微生物組信息擴(kuò)充具有一定的參考價(jià)值。