劉慧,涂璇,3*,呂育財(cái),3,任立偉,3,周超,周翰林,陳萍,譚光訊,楊博,龔大春,3

1(湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心(三峽大學(xué)),湖北 宜昌,443002)2(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌,443002) 3(中國(guó)輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué)),湖北 宜昌,443002)4(湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司,湖北 宜昌,443112)

酒曲作為白酒釀造過程中的糖化發(fā)酵劑,是白酒發(fā)酵的源動(dòng)力。白酒酒曲種類豐富多樣,根據(jù)制曲工藝的不同[1],酒曲可分為大曲、小曲、麩曲、麥曲及紅曲五大類,其中大曲應(yīng)用最為廣泛。濃香型白酒釀造主要采用中高溫大曲,依靠自然界帶入的各種野生菌在曲坯上富集生長(zhǎng),以獲得各種有益于發(fā)酵的微生物,起著糖化、產(chǎn)酒精以及產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的作用,是影響白酒產(chǎn)量、品質(zhì)、香型與風(fēng)格的重要因素[2]。

白酒發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程,涉及到不同微生物的生長(zhǎng)代謝以及種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化,其演替過程一直是限制對(duì)白酒釀造進(jìn)行科學(xué)控制的關(guān)鍵瓶頸之一。應(yīng)用于大曲微生物研究的技術(shù)主要有傳統(tǒng)平板分離[3]、BIOLOG微平板分析[4]和聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)[5]等,但傳統(tǒng)的平板分離技術(shù)只能對(duì)大曲中的可培養(yǎng)菌種進(jìn)行研究。BIOLOG 技術(shù)依賴于群體的生理活性,對(duì)于生長(zhǎng)較慢的微生物不適用。PCR-DGGE 技術(shù)只能分離低于500 bp 的較小片段,準(zhǔn)確率低。以上技術(shù)的應(yīng)用存在一定的局限性,不能全面地描述酒曲微生物群落多樣性[6]。高通量測(cè)序技術(shù)成本低、穩(wěn)定性高、可讀量和質(zhì)量高,是目前評(píng)估微生物多樣性的有力工具[7],在菌群分析中,該技術(shù)能快速、準(zhǔn)確的解析微生物菌群結(jié)構(gòu)。YANG等[8]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析大曲發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物,獲得優(yōu)勢(shì)真菌16種,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌18種,為進(jìn)一步研究大曲制備過程中功能微生物奠定了基礎(chǔ)。陳申習(xí)等[9]和沈毅等[10]分別利用Illu- mina Miseq和Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析出高溫大曲中Rhizopus、Aspergillus、Candida、Ther-moascus、Pantoea、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia和Lactococcus作為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。

制曲過程中大曲微生物區(qū)系的組成及變化不僅決定曲塊中物質(zhì)和能量代謝的走向,也決定了該香型白酒風(fēng)格的形成。為全面了解濃香型白酒中高溫大曲在培菌發(fā)酵期、后熟貯藏期間微生物群落的演替規(guī)律及其微生物組成與大曲各項(xiàng)理化、生化特征之間的相關(guān)性,本研究擬用Illumina Novaseq二代測(cè)序技術(shù)對(duì)大曲進(jìn)行全面、系統(tǒng)的研究,揭示在制曲過程中起關(guān)鍵作用的微生物類群,為中高溫大曲制作過程中大曲功能微生物結(jié)構(gòu)組成以及科學(xué)制曲提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所取大曲樣品來自某白酒公司制曲車間。樣品包括制曲過程中所需的原料小麥、曲房稻草、曲房谷殼以及濃香型大曲培菌發(fā)酵期1、7、13、28 d、后熟貯藏期59、346、399 d在內(nèi)的11個(gè)樣品。采取三點(diǎn)取樣法,將同一時(shí)間的樣品混合均勻,每個(gè)樣品分為2份,-80 ℃保存用于高通量測(cè)序,-20 ℃保存用于理化和生化特征測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)所使用的大曲樣品及樣品信息見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所使用大曲樣品信息表Table 1 Basic information of Daqu samples used in the experiment

1.2 大曲樣品理化及生化特征測(cè)定

測(cè)定大曲樣品在制作過程中不同時(shí)間段的理化、生化特征。理化特征測(cè)定包括溫度、含水量、pH值、還原糖含量、淀粉含量;生化特征測(cè)定包括糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力、蛋白酶活力。溫度測(cè)定參照溫度計(jì)法,含水量測(cè)定參照烘干法[11],pH值測(cè)定參照酸度計(jì)法[12];還原糖含量測(cè)定參照二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法[13];淀粉含量、糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力測(cè)定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]。蛋白酶活力測(cè)定參照SB/T 10317—1999 《福林酚法》[15]。

1.3 大曲微生物菌群分析

基于Illumina Nova平臺(tái)的測(cè)序由天津諾禾致源科技有限公司完成。真菌采用ITS-rDNA上的ITS2可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、細(xì)菌采用16S rRNA上的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,構(gòu)建小片段文庫(kù),進(jìn)行雙末端測(cè)序(Paired-end)。

采用FLASH軟件[16]對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,將低質(zhì)量的序列利用QIIME軟件[17]進(jìn)行過濾,去除嵌合體,得到最終有效序列。利用Uparse軟件[18]對(duì)樣本進(jìn)行聚類,97%一致性(Identity)將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),將OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列選取為代表性序列。利用Mothur方法與SILVA138的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[19]對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。利用QIIME軟件[17]對(duì)樣品進(jìn)行多樣性分析。使用R軟件進(jìn)行稀釋曲線繪制、主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)、樣本聚類分析、相關(guān)性分析等。

原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(SRA PRJ- NA790492、PRJNA790489)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲樣品理化及生化特征分析

大曲的理化和生化特征是評(píng)價(jià)酒曲品質(zhì)的重要指標(biāo),大曲在制備過程中,從原料到成曲,其理化特征和生化特征都發(fā)生顯著變化,這些特征是決定白酒釀造啟動(dòng)的關(guān)鍵因素。大曲制作過程中理化特征和生化特征測(cè)定結(jié)果如表2所示。大曲發(fā)酵的理化、生化特征隨培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)環(huán)境的變化而變化。溫度是影響大曲微生物數(shù)量和種類的重要因素。在大曲制作過程中,曲房的溫度和曲塊溫度均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。從第1天開始曲塊進(jìn)入曲房進(jìn)行堆積,通過鋪稻草及關(guān)門窗等保溫措施,保證微生物生長(zhǎng),隨后其生理代謝活動(dòng)開始頻繁,大曲品溫迅速增加。在大曲入房7 d時(shí),大曲溫度可達(dá)到60 ℃,即最高品溫。為了避免燒曲,會(huì)對(duì)曲房進(jìn)行通風(fēng)和翻曲處理,7～28 d 期間曲房的溫度和大曲品溫逐漸下降。在該過程中,大曲水分隨微生物發(fā)酵的進(jìn)行而逐漸降低。pH先增高后降低,其主要是微生物通過生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸,發(fā)酵13 d時(shí)pH達(dá)到最高值6.69,發(fā)酵13 d后,pH下降到6.1左右。還原糖含量在發(fā)酵期間逐漸增大,淀粉含量逐漸減少,28 d時(shí)還原糖含量由第1天的49.99 mg/g上升至120.64 mg/g,淀粉含量由最初的614 mg/g降至332 mg/g,主要原因是微生物生長(zhǎng)代謝將大量淀粉分解成為寡糖或還原糖等。28 d后大曲從曲房移入通風(fēng)、干燥的曲庫(kù),進(jìn)入后熟貯藏期,曲塊溫度繼續(xù)下降逐漸接近室溫,pH、含水量、淀粉含量、還原糖含量均逐漸下降達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定。

大曲的品溫和水分為其發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)繁殖與生理代謝提供了條件。大曲在發(fā)酵期間,絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌等微生物大量生長(zhǎng)繁殖。其中絲狀真菌會(huì)產(chǎn)生多種酶系,如液化型淀粉酶和糖化酶,可將原料中的淀粉分解成寡糖和還原糖,致使大曲液化力和糖化力在28 d時(shí)分別增至0.27 U和582.00 U。酵母菌和細(xì)菌在可利用的還原糖進(jìn)行生長(zhǎng)的同時(shí)啟動(dòng)酒精發(fā)酵、酯化反應(yīng),致使發(fā)酵力于7 d時(shí)達(dá)較高水平,即1.60 U,酯化力于13 d達(dá)較高水平,即465.54 U。此外絲狀真菌可產(chǎn)生蛋白酶分解蛋白質(zhì)。在后熟期間(28～399 d),曲中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在培菌期已大量消耗,此時(shí)霉菌、酵母菌和細(xì)菌數(shù)量大大降低,產(chǎn)酶量減少,各類酶活力迅速減弱直至穩(wěn)定。

表2 中高溫大曲制備過程中大曲理化、生化特征的測(cè)定Table 2 Physicochemical and biochemical properties of medium-high-temperature Daqu during the starter-making process

2.2 大曲微生物結(jié)構(gòu)組成與動(dòng)態(tài)演化分析

2.2.1 高通量測(cè)序結(jié)果及Alpha多樣性分析

Alpha-diversity用于分析樣品的微生物群落多樣性[17]。利用Illumina Nova測(cè)序平臺(tái)對(duì)ITS2和16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序,分別得到大曲制備過程中不同時(shí)間的樣品有效序列數(shù)、OTUs及Alpha多樣性分析指數(shù)。如表3所示,這兩項(xiàng)技術(shù)均表明獲得了較為理想的序列總數(shù),11個(gè)大曲樣品共得到1 715個(gè)OTUs。樣品覆蓋率均>98%,表明該試驗(yàn)取樣合理,測(cè)序結(jié)果能真實(shí)反映樣本的實(shí)際情況。從多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)jq2微生物多樣性和豐富度都較低,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,環(huán)境中的微生物進(jìn)入到曲塊中,曲塊的微生物多樣性和豐富度逐漸增加,jq3微生物多樣性和豐富度達(dá)到第1個(gè)高峰,jq5達(dá)到第2個(gè)高峰,之后由于底物的消耗以及外界環(huán)境的阻遏,多樣性指數(shù)開始降低,最終趨于穩(wěn)定。由此,可將jq2～jq3記為發(fā)酵前期,jq3～jq5記為發(fā)酵后期,jq5～jq8記為后熟期。

表3 中高溫大曲制備過程中大曲中真菌和細(xì)菌的序列數(shù)量、操作分類單元和Alpha多樣性指數(shù)分析Table 3 Sequence number, OTUs, and Alpha-diversity indices of fungi and bacteria in medium-high-temperature Daqu during the starter-making process

2.2.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性用以分析不同樣本間微生物群落組成的差異,結(jié)果如圖1所示。可看出第一個(gè)主坐標(biāo)軸(PCoA 1)在真菌和細(xì)菌群落差異的貢獻(xiàn)值分別為67.07%和66.91%。由圖1-a、圖1-b可發(fā)現(xiàn)大曲jq2與qa相關(guān)性較強(qiáng),在發(fā)酵過程中,隨著大曲發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行,樣本在PCoA1上逐漸移動(dòng),真菌中與qb、qc距離較近,相關(guān)性較高,細(xì)菌中與qa相關(guān)性較強(qiáng),后期大曲微生物均聚集在一起,結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。說明qa中的菌群對(duì)大曲初期微生物影響較大,而qb、qc菌群對(duì)發(fā)酵過程中大曲微生物影響較大。此外,可將樣品分成兩個(gè)聚類,其中jq2與qa為1個(gè)聚類,jq1、jq3～jq8與qb、qc為1個(gè)聚類(圖1-c),推測(cè)qb、qc即稻草、谷殼對(duì)大曲微生物菌群有重要影響。

a-大曲真菌PCoA圖;b-大曲細(xì)菌PCoA圖;c-大曲微生物聚類樹圖1 中高溫大曲菌群中真菌和細(xì)菌主坐標(biāo)分析和聚類分析Fig.1 PCoA and cluster analysis of fungal and bacterial communities in medium-high-temperature Daqu

2.3 大曲制作過程中不同時(shí)間段微生物群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)上述的OTUs序列進(jìn)行物種注釋,可展示物種組成及豐度信息(圖2)。真菌和細(xì)菌分別注釋到門水平的比例為81.04%、70.82%。將豐度<1%的合并為一類(others),大曲真菌群落獲得8個(gè)門類、255個(gè)屬。主要包括Ascomycota下的Issatchenkia(28.12%)、Thermoascus(16.16%)、Trichocladium(14.14%)、Aspergillus(6.44%),以及Mucoromycota下的Rhizopus(7.15%)、Rhizomucor(5.43%)。大曲細(xì)菌群落共分析得到10個(gè)門類、262個(gè)屬。其中相對(duì)豐度較高的是Firmicutes下的Weissella(39.60%)、Lactobacillus(17.43%)、Bacillus(2.14%)。在大曲制作過程中,微生物種類不斷增加,在粉碎小麥壓成曲塊時(shí)(jq2),曲中的Blumeria豐度較高,與qa(小麥)菌群結(jié)構(gòu)相似,此時(shí)環(huán)境中的微生物還未進(jìn)入曲塊進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。大曲移入曲房進(jìn)入培菌期間,由于曲房溫度較為適宜,大曲微生物種類急劇增加,此時(shí)Issatchenkia、Thermoascus、Rhizopus、Rhizomucor、Weissella和Lacto-bacillus豐度升高。培菌期結(jié)束大曲移入曲庫(kù)進(jìn)入貯藏期,Aspergillus、Rhizopus、Thermoascus等豐度逐漸降低,Bacillus、Saccharopolyspora和Streptomyces豐度增大。貯藏期相對(duì)培菌期而言,微生物種類較少,這是由于曲庫(kù)環(huán)境溫度和濕度均明顯降低,曲塊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗且含水量較低,導(dǎo)致大量微生物死亡,最終使得大曲微生物菌群趨于相對(duì)穩(wěn)定。

2.4 大曲制作過程中不同時(shí)間段微生物與理化特征相關(guān)性分析

對(duì)大曲制作過程中屬水平微生物優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度與理化、生化特征之間進(jìn)行相關(guān)性分析(圖3)。發(fā)現(xiàn)溫度是影響大曲微生物群落結(jié)構(gòu)變化的最主要因素,其次是水分。溫度與Thermoascus、Issatchenkia、Candida等大部分微生物豐度呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.14～0.90,與少部分菌群豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。表明環(huán)境溫度變化可影響曲塊溫度變化,從而影響大曲中菌群結(jié)構(gòu)組成,使其功能發(fā)生改變。

a-屬水平大曲真菌群落;b-屬水平大曲細(xì)菌群落圖2 中高溫大曲制作過程中真菌和細(xì)菌群落群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of fungal and bacterial communities in medium-high-temperature Daqu during the starter-making process

糖化力、液化力等作為大曲的重要性質(zhì),決定大曲的品質(zhì)。大曲的生化特征主要受Rhizopus、Rhizomucor、Weissella、Lactobacillus影響,該4種菌屬與糖化力、液化力等呈正相關(guān)。其中Rhizopus與糖化力、液化力、酯化力和酸性蛋白酶活力呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)均>0.6,其中與酸性蛋白酶活力相關(guān)系數(shù)達(dá)0.96;Rhizomucor與液化力、酯化力和中性蛋白酶活力相關(guān)系數(shù)均>0.6,與酯化力最為相關(guān),其系數(shù)達(dá)0.71;Weissella與糖化力、液化力和酯化力相關(guān)系數(shù)為0.61～0.75;Lactobacillus與糖化力、液化力、發(fā)酵力和蛋白酶活力相關(guān)系數(shù)均>0.54,其中與發(fā)酵力相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.75。此外,Issatchenkia僅與發(fā)酵力相關(guān)系數(shù)>0.6,與其余生化特征相關(guān)系數(shù)均<0.45。Aspergillus與各項(xiàng)理化、生化特征相關(guān)系數(shù)均<0.51,與發(fā)酵力和中性蛋白酶活力更是呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。說明Issatchen-kia與Aspergillus對(duì)大曲品質(zhì)影響較小,影響大曲功能的關(guān)鍵微生物種屬是Rhizopus、Rhizomucor、Weissella、Lactobacillus。

圖3 中高溫大曲制作過程中優(yōu)勢(shì)微生物與理化生化特征之間的相關(guān)性分析(屬水平)Fig.3 Correlation analysis between dominant microbial taxa and physicochemical and biochemical properties of medium-high-temperature Daqu during the starter-making process (genus level)

3 結(jié)論與討論

中國(guó)白酒歷史悠久,種類多樣,有典型的地域特色。各地白酒除原料和工藝存在差異外,參與釀造前期的酒曲微生物也隨酒曲的種類以及地域環(huán)境不同而不同,是影響白酒品質(zhì)與風(fēng)味的重要因素。本研究通過高通量二代測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)在該大曲制作過程中,酒曲微生物主要來自曲房環(huán)境,真菌歸屬于8個(gè)門、255個(gè)屬,細(xì)菌歸屬于10個(gè)門、262個(gè)屬。主要優(yōu)勢(shì)真菌屬為Issatchenkia、Thermoascus、Trichocladium、Aspergillus、Rhizopus、Rhizomucor,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Weissella和Lactobacillus,細(xì)菌群落的多樣性相對(duì)于真菌更為豐富。譚崇堯等[20]對(duì)不同地域的濃香型白酒大曲進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江中游地區(qū)大曲優(yōu)勢(shì)真菌為Aspergillus、Thermoascus等,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為L(zhǎng)actobacillus、Pediococcus、Leucanostoc等;在西南地區(qū),優(yōu)勢(shì)真菌包括Thermoascus、Aspergillus等,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括Weissella、Lactobacillus、Bacillus等。不同地區(qū)或不同原料制得的濃香型中高溫白酒大曲微生物群落結(jié)構(gòu)既有共性之處,也有一定的特性,研究發(fā)現(xiàn)以Thermoascus、Aspergillus、Lactobacillus等為代表的菌屬都是酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌屬,具有一定的普遍性。此外,本研究通過多樣性和菌群結(jié)構(gòu)分析,大曲發(fā)酵期間出現(xiàn)的Issatch-enkia、Thermoascus、Rhizopus、Trichocladium、Lichtheim-ia、Weissella、Brevibacterium在qb、qc中存在,由此可推斷曲房中的稻草和谷殼是大曲微生物的主要來源,對(duì)大曲微生物類群組成影響較大。

中國(guó)傳統(tǒng)食品發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的多菌種自然發(fā)酵過程,也是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定又動(dòng)態(tài)變化的微生態(tài)系統(tǒng)。本研究通過相關(guān)性分析揭示了該大曲中微生物結(jié)構(gòu)組成與功能之間的關(guān)系,并了解大曲中不同微生物對(duì)大曲發(fā)酵性能的影響程度。在大曲發(fā)酵過程中,溫度是影響微生物菌群結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子,因此控制曲房溫度極為重要。此外,影響大曲功能的主要微生物是Rhizopus、Rhizomucor、Weissella、Lactobacillus。雖然Issatchenkia和Aspergillus在菌群數(shù)量占有優(yōu)勢(shì),但其與大曲理化、生化特征相關(guān)性不顯著,說明功能微生物與其種群數(shù)量并不完全一一對(duì)應(yīng)。賈云等[21]通過相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)豆瓣醬中的Aspergillus、Bacillus、Weissella等主要與酶活性呈正相關(guān),而細(xì)菌群落中豐度最高的Staphylococcus與酶活性卻呈負(fù)相關(guān)。由此可見,種群數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的菌功能并不一定強(qiáng),發(fā)揮優(yōu)勢(shì)功能的菌在大曲中的豐度不一定是最高。利用二代測(cè)序技術(shù)結(jié)合相關(guān)性分析,能全面有效地了解大曲制作過程中微生物群落演替規(guī)律和影響大曲功能的關(guān)鍵因素,對(duì)科學(xué)制曲具有重要的的指導(dǎo)意義。