張晨,史艷楠,楊寧寧,秦莉莉,唐佳偉,董臣*

1(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州,450001)2(河南工業(yè)大學(xué) 國(guó)際教育學(xué)院,河南 鄭州,450001)

蓮藕作為我國(guó)重要的水生經(jīng)濟(jì)作物,廣泛種植于湖北、湖南、江西、福建等地。蓮藕富含水分、蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、胡蘿卜素、視黃醇、核黃素、維生素C和維生素E等[1-3]物質(zhì)，具有較高的食用價(jià)值。

蓮藕根據(jù)口感品質(zhì)可以分為三大類。一類是粉質(zhì)藕,口感柔軟、黏度大、適于煨湯,制作藕粉和糯米藕等,常見(jiàn)的有鄂蓮5號(hào);另一類是脆質(zhì)藕,口感脆嫩、黏度低、適于涼拌或清炒,常見(jiàn)的有鄂蓮3號(hào);另有口感居于兩者之間的品種如鄂蓮4號(hào)。蓮藕也是我國(guó)出口的重要蔬菜之一,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于蓮藕富含水分、外表皮薄、容易被損壞、貯藏期間易失水干縮和褐變變色,所以將新鮮蓮藕進(jìn)行鮮切加工,供應(yīng)餐飲業(yè)使用或作為即食產(chǎn)品成為了蓮藕銷售的主流方式[4-6]。然而鮮切后的蓮藕在加工和貯藏期間容易變質(zhì),存放的時(shí)間短,影響產(chǎn)品的出口和銷售[7]。褐變是限制蓮藕品質(zhì)的重要因素,鮮切蓮藕的褐變以酶促褐變?yōu)橹?相關(guān)機(jī)理的研究主要集中于酚、酚酶區(qū)域性分布學(xué)說(shuō)、自由基傷害假說(shuō)和保護(hù)酶系統(tǒng)假說(shuō)[8]。然而不同口感鮮切蓮藕褐變的生理生化差異及機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道,這對(duì)于篩選適合鮮切加工的蓮藕品種至關(guān)重要。因此作者選用了3種不同口感的蓮藕品種,通過(guò)對(duì)其鮮切后的外觀和生理生化水平進(jìn)行分析,結(jié)合相關(guān)基因的表達(dá),研究不同口感蓮藕褐變的生理生化特征及其分子機(jī)制,以及鮮切產(chǎn)品的適用性[9],旨在為解決蓮藕褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

試驗(yàn)所用蓮藕品種為鄂蓮3號(hào);鄂蓮4號(hào)和鄂蓮5號(hào)均由廣昌白蓮研究所提供。選取品種一致,大小正常,顏色均勻無(wú)機(jī)械損傷的蓮藕,備用。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸、氮藍(lán)四唑、乙酸、碳酸氫鈉、過(guò)氧化氫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、草酸、酚酞、甲醇、愈創(chuàng)木酚、核黃素、酒石酸鈉、苯酚、乙醇、乙酸鈉,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)、A590型雙束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),翔藝儀器(上海)有限公司;干式恒溫器,杭州奧盛儀器有限公司;電熱式恒溫水槽,翔藝儀器(上海)有限公司;電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;JJ200型電子天平,常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,翔藝儀器(上海)有限公司;MX-S可調(diào)式漩渦混勻儀,北京鑫潤(rùn)科諾儀器儀表有限公司;SX-500滅菌鍋,翔藝儀器(上海)有限公司;微孔板掃描分光光度計(jì),BioTek儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.2 還原糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、總酚含量和維生素C含量的測(cè)定

在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度,采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)比色法測(cè)量還原糖[14];在595 nm處測(cè)定其吸光度,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量[16];總酚含量的測(cè)定采用HCl-甲醇法[16]。在波長(zhǎng)290 nm處測(cè)定吸光度;采用二氯酚靛酚滴定法測(cè)定維生素C含量。

1.3.3 抗氧化系統(tǒng)酶活性分析

采用愈創(chuàng)木酚氧化法分析POD活性[17],在波長(zhǎng)470 nm處測(cè)定吸光度。每隔半分鐘記錄其吸光度的數(shù)值,連續(xù)記錄6次,酶活力大小用每分鐘A470改變0.01表示;氮藍(lán)四唑光化還原法分析SOD活性[18]。通常用抑制氮藍(lán)四唑光化還原的50%作為1個(gè)酶活性單位來(lái)表示SOD活性。

采用丙酮法提取PPO酶粗酶液,在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光度計(jì)算PPO酶活性,在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)吸光度算得PPO酶總蛋白量,計(jì)算出PPO酶比活力[19]。

1.3.4 APX、CAT、Mn-SOD、Cu,Zn-SOD、PPO和POD熒光定量分析

用Hipure piant RNA mini kit 試劑盒提取不同口感不同時(shí)期蓮藕的RNA,再把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用定量酶進(jìn)行定量分析[20]。本文章所用引物如表1所示。

表1 文章所用引物Table 1 Primers used in the article

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切蓮藕的外觀

通過(guò)觀察不同口感鮮切蓮藕的褐變過(guò)程,發(fā)現(xiàn)低溫貯藏第1天不同口感的鮮切蓮藕開(kāi)始發(fā)生褐變,如圖1所示。低溫貯藏第2天鄂蓮4號(hào)褐變最顯著;鄂蓮3號(hào)在貯藏第4天和第5天時(shí)褐變明顯;鄂蓮5號(hào)分別在低溫貯藏第3天和第4天褐變明顯。鄂蓮3號(hào)鮮切第0天,外觀偏白偏亮更適合做鮮切加工。

圖1 不同口感鮮切蓮藕褐變表觀變化Fig.1 Apparent changes of browning of fresh cutlotus roots with different tastes

2.2 還原糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、總酚含量和維生素C 含量

試驗(yàn)所用的鮮切鄂蓮3 號(hào)、鄂蓮4 號(hào)和鄂蓮5 號(hào)貯藏期間還原糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、總酚含量和維生素C 含量的變化如圖2 所示。還原糖的變化與蓮藕的褐變和呼吸作用有關(guān),還原糖主要來(lái)源于總糖的分解,還原糖的消耗主要因?yàn)楹粑饔?在整個(gè)貯藏期間3 種蓮藕還原糖含量都成上升趨勢(shì)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),褐變蓮藕內(nèi)還原糖含量延長(zhǎng),鄂蓮4 號(hào)的變化幅度較大,但鄂蓮3 號(hào)的還原糖含量較低,變化幅度較小。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),3 個(gè)品種的可溶性蛋白質(zhì)含量降低,但鄂蓮3 號(hào)相對(duì)于其他2個(gè)品種下降幅度較小,但3 個(gè)品種總的變化趨勢(shì)相同。

酚類化合物是植物組織褐變的重要底物之一,新鮮蓮藕中的酚類化合物容易被酚類酶氧化和褐變,從而使鮮切蓮藕發(fā)生表觀變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同品種蓮藕總酚延長(zhǎng)含量存在差異,鄂蓮4 號(hào)在鮮切第1 天總酚延長(zhǎng)含量最低,鄂蓮3 號(hào)和鄂蓮5 號(hào)總酚延長(zhǎng)含量基本一樣。在整個(gè)貯藏期間,鄂蓮3 號(hào)和鄂蓮5 號(hào)變化幅度較為平緩,鄂蓮4 號(hào)在第4 天總酚含量下降明顯。鮮切蓮藕體內(nèi)維生素C 在氧化酶的作用下可發(fā)生降解,從而導(dǎo)致含量下降。在整個(gè)貯藏期間,鄂蓮3 號(hào)、鄂蓮4 號(hào)和鄂蓮5 號(hào)這3 個(gè)品種中蓮藕的維生素C 含量都呈下降趨勢(shì),但是鄂蓮4 號(hào)前3 d 持續(xù)降低,最后1 d 略微升高,鄂蓮3 號(hào)和鄂蓮5 號(hào),這2 個(gè)品種貯藏第1 天略微升高,之后緩慢降低。這一結(jié)果顯示不同品種的蓮藕中維生素C 在鮮切后的貯藏期間的變化規(guī)律是不同的。

a-還原糖;b-可溶性蛋白;c-總酚;d-維生素C圖2 不同蓮藕品質(zhì)變化Fig.2 Quality changes of different lotus roots

2.3 褐變度、呼吸強(qiáng)度、MDA含量和含量

2.4 抗氧化系統(tǒng)酶的活性

a-褐變度;b-呼吸強(qiáng)度;含量圖3 不同蓮藕生理生化的變化Fig.3 Physiological and biochemical changes of different lotus roots

a-POD活性;b-SOD活性;c-PPO活性圖4 不同蓮藕抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化Fig.4 Changes of enzyme activities of antioxidant system in different lotus roots

2.5 不同蓮藕不同基因熒光定量分析

基因在mRNA水平的表達(dá)模式和其生物學(xué)功能具有密切關(guān)系。采用熒光定量PCR技術(shù)分析PPO、Mn-SOD、Cu,Zn-SOD、CAT、APX和POD基因在蓮藕褐變中的表達(dá)模式,結(jié)果如圖5所示。鄂蓮3號(hào)的PPO基因在低溫貯藏第2天時(shí)相對(duì)于鄂蓮4號(hào)和鄂蓮5號(hào)的表達(dá)量偏低,而鄂蓮4號(hào)的PPO基因表達(dá)量在這天達(dá)到最大值,這與之前的褐變實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的;鄂蓮3號(hào)的POD基因表達(dá)量在低溫貯藏第2天時(shí)遠(yuǎn)高于4號(hào)和鄂蓮5號(hào),這和之前的POD活性的結(jié)果是一致的;鄂蓮3號(hào)的Mn-SOD基因表達(dá)量在鮮切低溫貯藏第2天高于鄂蓮4號(hào)和鄂蓮5號(hào)。

3 結(jié)論

3.1 褐變對(duì)鮮切蓮藕的品質(zhì)影響

本實(shí)驗(yàn)選用了3種湖北種植的蓮藕品種:鄂蓮3號(hào)、鄂蓮4號(hào)和鄂蓮5號(hào),發(fā)現(xiàn)不同品種的蓮藕在鮮切貯藏期間各項(xiàng)指標(biāo)存在著顯著的差異,主要表現(xiàn)為鄂蓮3號(hào)的還原糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、維生素C含量和總酚含量的變化幅度均比鄂蓮4號(hào)和鄂蓮5號(hào)低。鮮切蓮藕中的可溶性蛋白質(zhì)含量在整個(gè)貯藏期間處于相對(duì)平衡的狀態(tài)。這是由于蛋白質(zhì)發(fā)生了變性和水解反應(yīng),另一方面是因?yàn)樾碌挠坞x蛋白被細(xì)胞釋放出來(lái)。在貯藏后期,鮮切的蓮藕產(chǎn)品發(fā)生了嚴(yán)重的褐變,總糖發(fā)生分解反應(yīng)產(chǎn)生還原糖,其中大部分被蓮藕的呼吸作用所消耗。在特定的條件下,只有一小部分的還原糖參與美拉德反應(yīng)[21]。

a-APX;b-CAT;c-Mn-SOD;d-Cu,Zn-SOD;e-POD;f-PPO圖5 熒光定量分析表達(dá)Fig.5 Quantitative real-time PCR analysis

3.2 褐變?cè)斐傻牟煌诟絮r切蓮藕的生理特征改變

不同品種的蓮藕中,SOD和POD是活性氧清除系統(tǒng)中主要的2種酶,它們的活性大小也有差異。鮮切貯藏期間的3個(gè)品種的蓮藕在同一時(shí)間測(cè)定,鄂蓮4號(hào)中的這2種酶的活性變化趨勢(shì)都大于同期的其他2個(gè)品種,鄂蓮3號(hào)的這2種酶活性變化相對(duì)平緩。結(jié)果表明,相比其他2個(gè)品種,鄂蓮3號(hào)中的活性氧清除系統(tǒng)更強(qiáng)大,對(duì)不良的貯藏環(huán)境的應(yīng)激能力和反應(yīng)程度也比較強(qiáng),能更好地保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧等有害物質(zhì)的侵害以及減緩脂質(zhì)過(guò)氧化作用的發(fā)生。

綜上,鄂蓮3號(hào)、鄂蓮4號(hào)和鄂蓮5號(hào)這3個(gè)品種的蓮藕在品質(zhì)和生理特性上都存在著明顯的差別,表現(xiàn)為鄂蓮3號(hào)的可溶性蛋白質(zhì)、維生素C 和總酚的含量較高,褐變相關(guān)的酶SOD 和POD 活性較強(qiáng)。鄂蓮3 號(hào)品種更適合鮮切加工。