王寶貝,蔣霖鐠,劉璐璐,萬可薇,陳洪彬,鄭宗平*

1(泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院， 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點實驗室,福建 泉州,362000)2(近海資源生物技術(shù)福建省高校重點實驗室,福建 泉州,362000)3(閩南特色傳統(tǒng)食品工程研究中心,福建 泉州,362000)

近年來,生物活性肽因具有抑制高血壓、抗凝血、抗腫瘤等多種生物活性而被廣泛關(guān)注[1]。其中,海洋蛋白源活性肽因具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類多、活性強和低副作用等優(yōu)點[2],在健康食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。多肽的生物活性主要由分子大小、氨基酸種類和排序決定的[4],不同來源、不同酶解方法制備得到的多肽功效不同。鯖魚又名鮐魚,主要分布在西太平洋及大西洋的海岸附近,是我國重要的經(jīng)濟魚種[5]。鯖魚作為一種高蛋白的經(jīng)濟魚類,主要用于直接食用,資源利用率低,其經(jīng)濟價值未被充分挖掘。鯖魚含有相當(dāng)大比例的肌肉蛋白[6],這部分肌肉蛋白營養(yǎng)價值高,氨基酸組成均衡,同時還含有多種生理功能的生物活性肽等物質(zhì)。鯖魚多肽的生物學(xué)功能的探索是實現(xiàn)鯖魚的高值化利用和深度開發(fā)的一個方向。

隨著生活水平的提高,我國高血壓人群日趨增多。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)通過將血管緊張素I轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ,從而使得高血壓升高。目前大多數(shù)降血壓藥都是通過降低該酶的活性達到降低高血壓的目的。高血壓患者一般通過服用卡托普利等藥物抑制ACE活性進而達到控制血壓的目的,這類藥物普遍具有一定的毒副作用。因此,尋找更為安全無副作用的降血壓方式是每一位高血壓患者的迫切需求。食物來源的抑制ACE活性的多肽可有效降低血壓,無毒副作用,可作為抑制高血壓的功能性食品以替代降壓藥[7]。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)海洋來源的多肽對ACE具有一定的抑制效果。SUN等[8]從海洋大球藻Ulvaintestinalis中提取的多肽,經(jīng)分離純化后,得到2條新型ACE抑制多肽,半抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)分別為0.183、0.179 mg/mL。JIANG等[9]利用堿性蛋白酶提取的琵琶魚多肽具有較好的ACE抑制活性。

吐司面包口味豐富多樣,食用方便快捷,并且易于消化和吸收,在快節(jié)奏的生活中深受人們喜愛。然而市面上的面包產(chǎn)品對功能性方面的關(guān)注較少。隨著生活水平逐步提高,消費者對食品的追求不再局限于口感風(fēng)味,而是更關(guān)注其營養(yǎng)價值和保健功能。

本研究以鯖魚肌肉為原料酶解制備了鯖魚多肽,對其抗氧化活性和ACE抑制活性進行評價,然后將所得的鯖魚活性肽應(yīng)用到吐司面包中,探討鯖魚活性肽對面包的比容、含水量、色澤及質(zhì)構(gòu)特性的影響,并對面包水提取物的抗氧化活性與ACE抑制活性進行評價,以期為今后開發(fā)功能性的烘焙食品提供參考。將鯖魚降血壓活性肽加入到面包中,不僅可以提升面包的營養(yǎng)價值,還能讓高血壓患者通過食療控制血壓,減少藥物的攝入,為今后開發(fā)適合高血壓人群的營養(yǎng)休閑食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯖魚活性肽,實驗室自制。新良原味面包粉、太古一級糖霜、安琪高活性干酵母、安佳無鹽黃油、鹽(閩鹽·精選自然鹽)、伊利純牛奶,市售。DPPH,上海阿拉丁;30% H2O2,廣東西隴科學(xué)股份有限公司;FeSO4·7H2O、水楊酸、無水乙醇(均為分析純),上海國藥集團;ACE Kit-WST A502,日本同仁化學(xué);四硼酸鈉、DL-絲氨酸、DL-二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)(均為分析純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)(分析純), 鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)(97%),上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BM1352B-3C面包機,廣東東菱電器有限公司;Hauswirt F50電烤箱,寧波宜德電器有限公司;TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)分析儀、P/36R 圓柱形平底探頭,英國Stable Micro Systems 公司; ADCI-60-W全自動色差計,北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司;DGG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海森信實驗儀器有限公司;Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀,瑞士帝肯;FD-2型冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鯖魚活性肽的制備

鯖魚活性肽制備采用堿性蛋白酶酶解[10]。取鯖魚魚肉80 g,使用高速分散器粉碎后,按料液比1∶3(g∶mL)加入去離子水,攪拌均勻后,置于沸水浴中15 min,使魚肉中的酶失活。自然冷卻至室溫。水浴鍋溫度設(shè)置為50 ℃,調(diào)pH 8.5,蛋白酶添加量為3 000 U/g,酶解時間2 h。酶解結(jié)束立即置于100 ℃ 沸水浴10 min滅酶。冷卻后離心,4 ℃,8 000 r/min,20 min,上清液冷凍干燥,放置在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鯖魚活性肽水解度、肽分子質(zhì)量測定

活性肽水解度的測量采用OPA法[11],具體如下:準(zhǔn)確稱取3.810 g 十水合四硼酸鈉和0.100 g SDS,溶解在75 mL的去離子水中,充分溶解;稱取0.080 g OPA,溶解在2 mL乙醇中,將該OPA溶液轉(zhuǎn)移到上述“四硼酸鈉-SDS”溶液中,用少量去離子水洗滌容器2～3次以確保OPA全部轉(zhuǎn)移;稱取0.088 g DTT加入到上述溶液中,攪拌至充分溶解后,定容到100 mL。以絲氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。量取3 mL OPA,加入400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合5 s,利用紫外分光光度計在340 nm處測量吸光度,空白用去離子水代替絲氨酸溶液,樣品測定時用樣品代替絲氨酸溶液,靜置2 min后測定吸光度。水解度(degree of hydrolysis,DH)計算如公式(1)～公式(3)所示:

(1)

(2)

(3)

式中:c絲氨酸-NH2,絲氨酸-NH2濃度，mmol/L,W絲氨酸-NH2,每克蛋白質(zhì)中含絲氨酸-NH2的量,mmol/g;m:樣品質(zhì)量,g;ω,樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù),%;V,樣品水解液體積,L;N:水解液稀釋倍數(shù);h,水解過程中,每克蛋白被斷裂的肽鍵數(shù),mmol/g,對于魚產(chǎn)品而言,htot=8.6,α=1,β=0.4。

分子質(zhì)量測定采用液相色譜測定。具體條件如下:色譜柱TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm;流動相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;檢測UV220 nm;流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃ 。以細胞色素C(MW12400)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189) 作為分子質(zhì)量標(biāo)尺。稱取樣品100 mg于10 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,用0.45 μm 微孔過濾膜過濾后供進樣。

1.3.3 面包的初始配方

本研究采用表1所示配方作為面包的基礎(chǔ)配方,探究鯖魚活性肽添加量為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(質(zhì)量分數(shù))時對面包品質(zhì)的影響。

表1 吐司面包基礎(chǔ)配方Table 1 Basic formula of toast bread

1.3.4 工藝流程

本研究的面包制作采用二次發(fā)酵法,生產(chǎn)工藝流程如圖1所示。

圖1 面包制作工藝Fig.1 Bread making process

1.3.5 面包比容的測定

面包比容的測定參考王寶貝等[12]的測定方法。

1.3.6 面包含水量的測定

參照GB/T 5009.3—2016 《食品中水分的測定》,采用直接干燥法測定面包中的水分。

1.3.7 面包色澤的測定

面包芯色澤采用ADCI-60-C全自動測色差計測定。面包冷卻至室溫后進行切片處理(切片厚度為10 mm),用色差儀測定面包芯的亮度(L)、紅綠度(a)和黃藍度(b)值。

1.3.8 面包質(zhì)構(gòu)的測定

采用英國SMS公司的TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測定面包的硬度、彈性、回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)參數(shù)。選用P/36R的圓柱形平底探頭,質(zhì)構(gòu)參數(shù):觸發(fā)力5 g,測前速度1 mm/s,測試速度3 mm/s,測后速度3 mm/s;壓縮至樣品原高度的50%,2次壓縮間隔的時間為5 s[13]。

1.3.9 生物活性的測定

面包水提物的提取、DPPH自由基和羥自由基(·OH)的清除率參考王寶貝等[12]的方法,ACE抑制率的測定采用酶試劑盒檢測(日本同仁化學(xué),ACE it-WST A502)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯖魚多肽的生物活性及分子質(zhì)量

上述酶解制備的鯖魚多肽水解度為10.3%,平均分子質(zhì)量為727 Da。其中,分子質(zhì)量<2 000 Da的多肽占94.50%,表明該酶法制備的鯖魚多肽主要為小分子多肽,容易被人體吸收[15]。將鯖魚多肽配制成不同濃度的多肽溶液,分析其生物活性。由表2和圖2可知,本研究制備的鯖魚多肽對DPPH自由基和·OH均有較高的清除能力,其對DPPH自由基和·OH的IC50分別為(1.90±0.19)、(1.99±0.09) mg/mL,比BEN SLAMA-BEN SALEM等[16]酶解的章魚多肽和NASRI等[17]報道的蝦虎魚多肽的IC50低,說明其抗氧化活性更佳。本研究還發(fā)現(xiàn)鯖魚多肽對ACE具有很好的抑制功效,其IC50為(28.53±0.57) μg/mL,低于海洋大球藻多肽[8]和琵琶魚多肽[9]等的IC50,表明鯖魚多肽對ACE具有更好的抑制功效。

表2 鯖魚多肽的生物活性Table 2 Bioactivity of mackerel peptides

A-DPPH自由基清除率;B-·OH清除率;C-ACE抑制率圖2 鯖魚多肽生物活性Fig.2 Bioactive of mackerel peptides注:X為多肽濃度,mg/mL

2.2 鯖魚活性肽對吐司面包品質(zhì)的影響

將上述制備的鯖魚活性肽按面粉質(zhì)量的0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%制作吐司面包,成品如圖3所示,探究不同添加量鯖魚活性肽對吐司面包比容、含水量、色澤及質(zhì)構(gòu)特性的影響。

圖3 不同鯖魚多肽添加量的面包Fig.3 Bread with different contents of mackerel peptides

2.2.1 鯖魚活性肽對面包比容的影響

面包的比容是面團體積膨發(fā)和氣體容納能力的直觀體現(xiàn),在很大程度上影響了成品面包的外觀、食用口感和組織結(jié)構(gòu)。鯖魚活性肽添加量對面包比容的影響如圖4所示,當(dāng)添加量為0.0%時,吐司面包比容為(4.28±0.04) mL/g;當(dāng)添加量分別0.5%、1.0%、1.5%和2.0%時,面包比容分別為(4.41±0.01)、(4.46±0.04)、(4.56±0.04)和(4.65±0.04) mL/g。隨著鯖魚活性肽添加量的增加,面包比容顯著增大。靳鳳芳等[18]也發(fā)現(xiàn)添加大豆肽和魚皮肽能有效改善面包比容。這可能是由于活性肽提高了面團的蛋白含量,改善了面團的空氣保持能力,進而使面包比容增大。另外,小分子肽更易于被酵母吸收利用,為酵母提供氨基酸等營養(yǎng)成分,促進酵母繁殖、提高其產(chǎn)氣能力增強,從而使面包的比容增加。

圖4 鯖魚多肽對面包比容的影響Fig.4 Effect of mackerel peptide on bread specific volume注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 鯖魚活性肽對吐司面包含水量的影響

如圖5所示,隨著鯖魚活性肽添加量的增加,面包含水量略有增加。當(dāng)活性肽添加量提高至2.0%時,面包含水量為(66.89±0.18)%。多肽對面包含水量的影響主要與其氨基酸序列有關(guān),含極性基團較多的多肽與水分子的結(jié)合能力較強,吸水性和保水性較好,有利于提高面包的含水量[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鯖魚活性肽對面包含水量影響甚微,這可能與其氨基酸序列有關(guān)。此外,本研究的多肽添加量比較少,也是造成影響不顯著的原因之一。

圖5 鯖魚多肽對面包含水量的影響Fig.5 Effect of mackerel peptide on bread moisture

2.2.3 鯖魚活性肽對面包色澤的影響

面包色澤的變化主要是由原料本身色澤、糖類物質(zhì)和游離氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)及酚類物質(zhì)在焙烤過程中氧化所造成[20]。如表3和圖6所示,面包芯的L值保持在73.46±1.64～71.23±1.15,變化不大,說明鯖魚活性肽的添加對整體亮度影響很小。隨著活性肽添加量的增加,面包芯的a值大幅下降,b值上升,分別從5.28±0.52降至0.47±0.35,從13.77±2.16上升至19.88±0.95。這表明鯖魚活性肽的添加使得面包的紅色度降低,黃色度增加。由圖7可見面包芯的顏色確實隨著多肽粉添加量的增加而越來越黃,這可能是由于烘焙過程中鯖魚活性肽與面包原料發(fā)生美拉德反應(yīng)[21],從而影響了面包的色澤。

表3 鯖魚活性肽添加量對面包色澤的影響Table 3 Effect of mackerel peptide on the color of bread

2.2.4 鯖魚活性肽對面包質(zhì)構(gòu)的影響

面包的質(zhì)構(gòu)參數(shù)很大程度上決定了感官指標(biāo)中形態(tài)與口感得分,能夠較為直觀地反映面包內(nèi)部的各項物理指標(biāo)如組織結(jié)構(gòu)、松軟程度等。表4展示了不同鯖魚活性肽添加量對面包芯質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的影響。隨著鯖魚活性肽添加量的增加,面包硬度逐漸減小,當(dāng)添加量達到2.0%時,面包的硬度比對照組減小了46.40%,這可能是因為鯖魚活性肽與淀粉分子結(jié)合改變了面團水分分布,控制了水分的遷移,使水分分布處于均勻狀態(tài),從而延緩了淀粉老化,降低了面包硬度,使面包品質(zhì)得到改善[22]。除此之外,鯖魚活性肽具有一定的吸水能力,隨著鯖魚活性肽添加量的增加,可能會降低面團的吸水率,從而抑制面筋網(wǎng)絡(luò)的形成,最終導(dǎo)致面包的硬度顯著降低[23]。鯖魚活性肽的添加使面包的彈性和黏聚性略有降低,但并不明顯。面包膠著性、咀嚼度和回復(fù)性等指標(biāo)隨鯖魚活性肽添加量的增大而減小。

圖6 不同鯖魚多肽添加量的面包芯Fig.6 Bread core with different contents of mackerel peptides

表4 鯖魚活性肽對面包質(zhì)構(gòu)的影響Table 4 Effect of mackerel bioactive peptides on bread texture

2.3 鯖魚活性肽對面包生物活性的影響

鯖魚活性肽具有較好的抗氧化和ACE抑制活性,且分子質(zhì)量小,易于被吸收利用。將鯖魚活性肽添加到吐司面包中后,面包仍然保持較好的抗氧化活性和ACE抑制活性(圖7)。面包水提物對DPPH自由基與·OH的清除率均隨著鯖魚活性肽的添加量的增加而顯著提高(P<0.05)。當(dāng)鯖魚活性肽添加量為2.0%時,其對DPPH自由基和·OH的清除率分別為(33.98±1.64)%(對照組的1.58倍)和(32.87±1.47)%(對照組的1.71倍)。由圖7 可知,鯖魚活性肽添加量為0.0%時,面包并不具有ACE抑制活性,當(dāng)添加鯖魚活性肽后,面包水提物對ACE卻有明顯的抑制效果。當(dāng)鯖魚活性肽添加量為2.0%后,其ACE抑制率提高到(82.39±0.12)%。該結(jié)果表明,經(jīng)過高溫焙烤后,鯖魚活性肽仍然保持較好的抗氧化能力和對ACE的抑制活性。因此在吐司面包中添加適量鯖魚活性肽能有效提高面包提取液的抗氧化能力并賦予其抗高血壓的功能特性。

A-DPPH自由基清除率;B-·OH清除率;C-ACE抑制率圖7 鯖魚活性肽面包水提物的生物活性Fig.7 Bioactive of bread aqueous extract with mackerel peptides

3 結(jié)論

本研究用堿性蛋白酶水解鯖魚魚肉制備得到了具有較佳抗氧化活性和ACE抑制活性的鯖魚活性肽。該多肽平均分子質(zhì)量為727 Da,其對DPPH自由基和·OH的IC50分別為(1.90±0.19)、(1.99±0.09) mg/mL,抑制ACE的IC50為(28.53±0.57)μg/mL。將鯖魚活性肽添加到吐司面包中可以顯著提高面包的抗氧化活性,并賦予面包抑制ACE活性的功效。當(dāng)添加量為2.0%(質(zhì)量分數(shù))時,DPPH自由基和·OH的清除率分別比未添加時增加了70.69%和55.87%,ACE抑制活性則從0增加至(82.40±0.12)%。鯖魚活性肽的添加對面包含水量無顯著影響,但是使面包的比容略有增大,硬度、膠著性、咀嚼性和回復(fù)性則顯著減小。該研究結(jié)果表明鯖魚活性肽用于吐司面包等烘焙產(chǎn)品,不僅能夠提高面包的食用營養(yǎng)價值與烘焙品質(zhì),還可以作為抗高血壓的功能性食品,為今后開發(fā)鯖魚活性肽在烘焙食品中的應(yīng)用提供一定的參考。