張雪,吳葉,陳雪雪,陳星光,楊華,陸健*,吳殿輝*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)3(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)是一種深受大眾歡迎的熱帶水果,其果味甜、香氣獨(dú)特,具有多種生物比活力[1-2],有“熱帶水果皇后”、“齒留香”等美稱。但菠蘿蜜果實(shí)采摘期短、不耐貯藏,嚴(yán)重制約了菠蘿蜜種植業(yè)的發(fā)展。因此,菠蘿蜜精深加工的相關(guān)研究備受關(guān)注[3]。菠蘿蜜果實(shí)含糖量高、香氣濃郁、風(fēng)味獨(dú)特,是釀造果酒的上等原料[4];同時有研究認(rèn)為,菠蘿蜜果酒富含有機(jī)酸、多糖、沒食子酸和原兒茶酸,具有抗氧化性和抑制DNA損傷的特性[5]。因此,釀造果酒成為了菠蘿蜜精深加工的一個重要方向。

果酒釀造過程中,果汁在發(fā)酵微生物的作用下發(fā)生了一系列復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng),形成種類豐富、特征各異的揮發(fā)性香氣化合物,賦予了酒體不同風(fēng)格[6]。酵母對菠蘿蜜果酒香氣成分的形成和含量具有重要影響[7]。在釀酒工藝相同的前提下,同品種菠蘿蜜釀造果酒的香氣成分差異主要是釀酒酵母風(fēng)味酶活力不同引起的[8-9]。風(fēng)味酶又稱增香酶,是能夠催化風(fēng)味前體形成風(fēng)味物質(zhì)的酶的總稱,如脂肪酶、糖苷酶、酯酶、蛋白酶等[10]。其中,釀酒酵母的酯酶活力與果酒中酯類物質(zhì)的合成、積累過程密切相關(guān)[9]。BARDI等[11]研究發(fā)現(xiàn)葡萄汁酒精發(fā)酵期間有較高的酯酶活力;PéNICAUD等[12]的研究證實(shí)了釀酒酵母細(xì)胞中酯酶的存在。酯類化合物具有較低的閾值和濃郁的水果香味,是決定果酒香氣的重要香氣化合物[13],因此,酯酶可以通過調(diào)節(jié)酒體中酯類物質(zhì)的濃度來影響果酒的質(zhì)量[14]。近年來關(guān)于酵母與菠蘿蜜果酒香氣之間關(guān)系研究多側(cè)重于篩選自然菌株提高菠蘿蜜果酒香氣[15]、比較不同商業(yè)酵母對果酒香氣成分影響[7]、果酒香氣成分檢測[16]及優(yōu)化發(fā)酵工藝提高果酒香氣[17]等,而關(guān)于通過提高釀酒酵母酯酶活力來增強(qiáng)菠蘿蜜果酒香氣品質(zhì)的研究鮮有報道。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變育種指在室溫常壓的條件下,使用高純氦氣產(chǎn)生大量的等離子體流損傷微生物的遺傳物質(zhì)DNA,從而產(chǎn)生大量突變株的菌種選育方法。與傳統(tǒng)誘變方法相比,該項(xiàng)技術(shù)具有突變效率高、安全性高等特點(diǎn)。目前誘變育種研究日趨成熟,可以有效地突變酵母[18]。

因此,本研究首先通過ARTP技術(shù)誘變釀酒酵母CS31(從菠蘿蜜果汁自然發(fā)酵液中篩選),提高出發(fā)菌株的酯酶活力;再評估誘變菌株的各類發(fā)酵性能以及產(chǎn)酯酶能力,選擇能順利完成發(fā)酵的同時又具有最高酯酶活力的菌株;最后驗(yàn)證在菠蘿蜜果酒發(fā)酵中,該突變菌株的產(chǎn)香能力,以期為菠蘿蜜果酒專屬釀酒酵母的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

釀酒酵母CS31,由江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心從菠蘿蜜自然發(fā)酵液中分離并在-20 ℃甘油管中保藏;菠蘿蜜汁由海南豪蜜食品有限公司提供;白砂糖購自江蘇省無錫市濱湖區(qū)歐尚超市。

YPD固體培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):酵母粉1.0%,蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%,瓊脂粉2.0%;YPD液體培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):酵母粉1.0%,蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%;初篩培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):酵母粉1.0%,蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%,滅菌后加入12%乙醇;發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):蛋白胨2.0%,酵母粉1.0%,硫酸銨0.3%,磷酸二氫鉀0.4%,葡萄糖2.0%,吐溫80 2 mL/L,蒸餾水配制,自然pH;以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為115 ℃、0.1 MPa高壓滅菌30 min。菠蘿蜜汁培養(yǎng)基:解凍后的菠蘿蜜汁,按料液比3∶2(g∶mL)加入蒸餾水,混勻后離心留上清液,用白砂糖調(diào)整糖度至230 g/L,加入偏重亞硫酸鉀120 mg/L;pH值為5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液:0.1 mol/L檸檬酸、0.2 mol/L磷酸氫二鈉。

偏重亞硫酸鉀、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉、乙醇、硫酸銨、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、異戊醇和石英砂,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;對硝基苯基乙酸酯(p-nitrophenyl acetate,p-NPA)、對硝基苯基丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate,p-NPB)、對硝基苯基己酸酯(p-nitrophenyl hexanoate,p-NPH)、2-辛醇,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;偏重亞硫酸鉀為食品級,2-辛醇為色譜純,其余試劑均為分析純。Premix ExTaqTM,6×DNA LoadingBuffer、2 000 bp DNA Marker、引物ITS1、ITS4,蘇州Genewiz公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Artp-iis ARTP 誘變系統(tǒng),無錫源清天木生物科技有限公司;SW-CJ-1D 無菌操作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;EPOCH2T酶標(biāo)儀,美國BioTek公司;LEGEND MICRO17離心機(jī),賽默飛世爾科技公司;SHP-2500低溫生化培養(yǎng)箱,上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Trace1310-ISQ LT ISQ單四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀,美國Thermo Scientific公司;LS-B50L自動高壓蒸汽滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司;HYL-C組合式搖床,太倉市強(qiáng)文實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;GHP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;5415D高速離心機(jī),德國Eppendorf股份公司;Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR擴(kuò)增儀,德國艾本德股份公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 初始菌株ARTP誘變

取出-20 ℃甘油管保藏的初始菌種CS31,涂布于YPD固體培養(yǎng)基上,30 ℃條件下培養(yǎng)48 h,使其活化?；罨Y(jié)束后,在YPD固體培養(yǎng)基中挑取單菌落,接種至YPD液體培養(yǎng)基,30 ℃條件下振蕩(220 r/min)培養(yǎng)11 h。收集處于對數(shù)期的初始菌種CS31,用生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)洗滌2次并稀釋至1.62×107CFU/mL。在金屬載片上均勻涂抹10 μL的菌懸液后,將金屬載片置于誘變系統(tǒng)中,在100 W誘變功率、10 L/min氣流量和2 mm照射距離下,分別誘變0、30、60、90、120、150、180、210 s。待誘變結(jié)束,對每個處理樣品進(jìn)行梯度稀釋,并將稀釋液涂布于YPD固體培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)3 d,觀察菌落數(shù)并計(jì)算致死率。誘變致死率見公式(1):

(1)

1.2.2 誘變菌株的初篩

優(yōu)良的菌株首先要順利啟動并完成發(fā)酵過程。因此,在篩選出具有高酯酶比活力的突變株之前,需要對這些菌株進(jìn)行一定的初篩。

1.2.2.1 一級篩選

通過高通量篩選耐酒精菌株。將YPD液體培養(yǎng)基(含有12%乙醇)加入96孔板后接入誘變菌株。隨后將孔板在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)(200 r/min)2 d。取出孔板,并用酶標(biāo)儀測定每個小孔在600 nm波長處的吸光值(OD600)。選取OD600比出發(fā)菌株CS31顯著提高的突變株進(jìn)行二級篩選。

1.2.2.2 二級篩選

采用杜氏小管發(fā)酵法篩選出起酵速度快、發(fā)酵能力強(qiáng)的菌株。將上步篩選的正向突變菌株,以8%的接種量分別接種到裝有杜氏小管和菠蘿蜜汁培養(yǎng)基(10 mL)的試管中,30 ℃條件下靜置培養(yǎng)8 h后,每隔2 h觀察各菌株的產(chǎn)氣量,記錄菌株的起酵時間和產(chǎn)氣速度。

1.2.2.3 三級篩選

通過菠蘿蜜果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。將活化2次后的菌株使用無菌水低溫離心洗滌3次,再使用菠蘿蜜果汁進(jìn)行重懸。將重懸后的菌株進(jìn)行菠蘿蜜果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),主酵結(jié)束觀察酒體的色澤和氣味,去除明顯出現(xiàn)異味、酒體渾濁的酒樣。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定剩余酒樣的乙醇、總糖和總酸含量,再次去理化指標(biāo)不達(dá)標(biāo)的菌株。菠蘿蜜果酒初步發(fā)酵條件為料液比3∶2(g∶mL),初始總糖含量230 g/L,酵母接種密度1×107CFU/mL,果膠酶15 U/mL,偏重亞硫酸鉀120 mg/L,發(fā)酵溫度20 ℃,發(fā)酵時間132 h。

1.2.3 誘變菌株的復(fù)篩

將初篩菌株接入YPD液體培養(yǎng)基中30 ℃活化24 h后,再按1%接種量轉(zhuǎn)接至YPD液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)(200 r/min)11 h,隨后按2%接種量再次接入發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)(200 r/min)24 h。將培養(yǎng)好的菌液高速離心去上清液,用緩沖液低溫離心洗滌3次后重懸細(xì)胞,以此作為粗酶液測定菌株的酯酶活力。酯酶比活力最高的菌株即為目標(biāo)菌株。重懸細(xì)胞的干重通過將培養(yǎng)好的菌液用蒸餾水低溫離心洗滌3次后,在100 ℃恒溫烘干至恒重獲得。

酯酶活力測定方法參照文獻(xiàn)的報道[14，19],并進(jìn)行略微修改。具體方法如下:分別在40 μL的p-NPA(C2)、p-NPB(C4)和p-NPH(C6)異戊醇溶液(25 mmol/L)中加入400 μL的菌懸液和860 μL的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH=5.0)。在40 ℃下反應(yīng)10 min后,在混合溶液中加入400 μL的NaOH溶液(0.5 mol/L)終止反應(yīng),10 000 r/min離心5 min,測定上清液在400 nm波長下的吸光值。對照組使用檸檬酸-磷酸緩沖液代替細(xì)胞重懸液。每個樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.752 6x-0.018 2,R2=0.999 3)計(jì)算反應(yīng)體系中對硝基苯酚的質(zhì)量濃度(g/L)。1個酯酶活力單位(U)定義為:40 ℃條件下,每分鐘釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。用酯酶比活力來表征不同菌株的酯酶活力高低,比活力定義為:單位質(zhì)量(g)的菌體中所具有的酯酶活力單位數(shù)(U)。分別計(jì)算出不同菌株中C2、C4、C6酯酶比活力,計(jì)算見公式(2):

(2)

式中:C為酶活力測定反應(yīng)體系中對硝基苯酚的濃度,μmol/L;V為體積,L;m為400 μL粗酶液中菌體的干重,g;t為酶活力測定反應(yīng)時間,min。

酯酶累計(jì)比活力為各菌株C2～C6酯酶比活力之和。

1.2.4 優(yōu)選菌種的鑒定

采用石英砂破壁法[20]提取目的菌株基因組DNA,并通過PCR擴(kuò)增目的酵母的基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系(50 μL):Premix ExTaqTM,25 μL;引物ITS1和ITS4,各2 μL;DNA模板,1 μL;雙蒸水,20 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循環(huán)36次;72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳檢測,寄送至蘇州Genewiz公司進(jìn)行sanger測序。采用MEGA 7.4軟件將測定的18S rDNA序列與GenBank中酵母菌的序列進(jìn)行比對,下載匹配度前10位的序列與待鑒定菌株構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 產(chǎn)香能力驗(yàn)證

菠蘿蜜果酒發(fā)酵條件同1.2.2.3。對選育出的菌株和出發(fā)菌株CS31進(jìn)行菠蘿蜜果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。主發(fā)酵結(jié)束后,采用頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析菠蘿蜜果酒發(fā)酵香氣成分。

樣品配制:在20 mL容量的頂空瓶中,加入3 mL的菠蘿蜜果酒樣品、3 mL的去離子水、52 μg/L的2-辛醇內(nèi)標(biāo)、3.0 g的NaCl固體。

HS-SPME條件:50 μm/30 μm CAR/DVB/PDMS的SPME纖維萃取頭用于風(fēng)味物質(zhì)的萃取。預(yù)熱時間為2.5 min,預(yù)熱溫度為45 ℃,萃取吸附時間為30 min,質(zhì)譜解吸溫度為250 ℃,質(zhì)譜解吸時間為1 min。

GC條件:色譜柱為TG-Wax(60 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱;載氣為氦氣,流速是1 mL/min;升溫程序?yàn)?5 ℃維持1 min后,以6 ℃/min速度升溫至230 ℃并保持6 min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃,不分流。

MS參數(shù)如下:離子源,電子電離源(EI);離子源溫度,260 ℃;四極桿溫度,150 ℃;碰撞電壓,70 eV;掃描質(zhì)量范圍,29～350 u。

物質(zhì)定性:香氣比活力成分的定性通過與NIST 05質(zhì)譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行檢索比對,并根據(jù)改進(jìn)的Kovats法計(jì)算得到各物質(zhì)保留指數(shù)(retention index,RI)進(jìn)行確認(rèn)。

物質(zhì)定量:在待測酒樣中加入2-辛醇內(nèi)標(biāo),根據(jù)半定量方法計(jì)算各物質(zhì)的含量[21]。

1.2.6 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)分析方法

對突變菌株和出發(fā)菌株CS31發(fā)酵果酒的風(fēng)味成分進(jìn)行歸納,并利用相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)法確定揮發(fā)性物質(zhì)對菠蘿蜜果酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)[22]。一般認(rèn)為ROAV>1的揮發(fā)性物質(zhì)是樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。使對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分ROAVstan為100,其余各組分的ROAVA計(jì)算見公式(3):

(3)

式中:Cstan、Tstan分別為對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的香氣成分的含量及其感官閾值,μg/L;CA、TA分別為其余各香氣成分的含量及其感官閾值,μg/L。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

將復(fù)篩得到的具有較高酯化酶酶活力的突變株傳代5次,測定每一代菌株的C2～C6酯酶活力及酯酶累計(jì)活力,以確定突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變結(jié)果

原始菌株CS31經(jīng)ARTP誘變后致死率曲線如圖1所示。隨著時間的增長,致死率也隨之增大。當(dāng)誘變時間180 s時,致死率達(dá)到98.75%,誘變時間210 s時,致死率達(dá)到100%(即未發(fā)現(xiàn)有活菌存活)?，F(xiàn)代育種理論表明,誘變致死率≥95%時,正向突變率最高,可獲得最佳正向突變體[18]。因此,選擇ARTP誘變時間180 s為本試驗(yàn)的最佳誘變時間。

圖1 CS31在ARTP不同處理時間下的致死率Fig.1 Lethality rate of CS31under different mutagenic time of ARTP

2.2 誘變菌株初篩結(jié)果

2.2.1 酒精耐受性實(shí)驗(yàn)

酒精耐受性是衡量突變菌株在果酒發(fā)酵中應(yīng)用的重要指標(biāo)之一,可初步篩選出性狀優(yōu)良的菌株[23]。以處理組菌體OD600值高于對照組菌體OD600值的20%為篩選準(zhǔn)則進(jìn)行選擇[18]。由表1可知,從165株突變株中獲得了21株對乙醇具有較好耐受性的菌株。

表1 不同菌株對酒精的耐受性Table 1 Alcohol tolerance of different strains

2.2.2 杜氏小管產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)

將上步篩選得到的21株誘變菌株接種在裝有杜氏小管的試管中,產(chǎn)氣情況如表2所示。對照菌株CS31在8 h開始產(chǎn)氣,12 h內(nèi)氣泡充滿杜氏小管。對于突變菌株,產(chǎn)氣最快的菌株8 h時也開始產(chǎn)氣,至10 h 后產(chǎn)氣充滿杜氏小管,而有的菌株14 h后仍未能產(chǎn)滿氣體,可見不同酵母的產(chǎn)氣能力差異較大。其中,編號分別為YB10、YB13、YB19、YB31、YB38、YB55、YB57、YB61、YB63、YB65、YB69、YB71、YB87、YB93、YB111和YB144的菌株相較于出發(fā)菌株起酵短、產(chǎn)氣速度快,說明這16株酵母菌具有較高的發(fā)酵度和發(fā)酵效率[24]。故將上述16株酵母菌做下一級篩選。

表2 不同菌株的產(chǎn)氣情況Table 2 Results of gas production of different strains

2.2.3 菠蘿蜜果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為減小復(fù)篩選時的工作量,需進(jìn)一步剔除發(fā)酵液氣味、外觀和常規(guī)理化指標(biāo)有明顯缺陷的菌株。對17株菌(16株較為優(yōu)良的菌株以及對照菌株)進(jìn)行果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),20 ℃靜置發(fā)酵132 h后發(fā)現(xiàn)YB10、YB63、YB69、YB87發(fā)酵果酒有明顯臭味,YB31、YB55、YB71發(fā)酵果酒酒體渾濁失光,因此后續(xù)不再研究。其余菌株發(fā)酵的酒體均有不同程度的花香、果香和酒香,并伴隨有菠蘿蜜的典型香味,其中YB93發(fā)酵的果酒香味尤其突出,對這些酒體進(jìn)行指標(biāo)測定。如表3所示,這些菌株的總糖(以葡萄糖計(jì))、總酸(以酒石酸計(jì))和酒精度(以體積計(jì))雖有一定差異,但均處于正常范圍內(nèi),故本輪篩選中保留除有明顯缺陷外的全部菌株進(jìn)行復(fù)篩。

表3 菠蘿蜜酒的指標(biāo)分析結(jié)果Table 3 Indexes analysis of jackfruit wines

2.3 誘變菌株的復(fù)篩結(jié)果

果酒發(fā)酵過程中酯類化合物的種類和含量,由發(fā)酵汁中酯酶作用底物的種類和數(shù)量以及酯酶的潛在底物特異性決定。SUMBY等[25]對酒酒球菌(Oenococcusoeni)C2～C10酯酶活力研究發(fā)現(xiàn),其對不同碳鏈長度的底物反應(yīng)具有特異性。酯酶的潛在底物特異性決定了酒中酯類化合物的構(gòu)成,且其含量與碳鏈長度成反比[19];同時脂溶性酯類物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)會隨著碳鏈長度的增加而大幅下降,其中己酸乙酯可以100%釋放到細(xì)胞外,癸酸乙酯只有8%～17%被轉(zhuǎn)移,而只有被高效釋放到細(xì)胞外的酯類才可被消費(fèi)者感知[9],因此,微生物在發(fā)酵過程中主要通過作用于短碳鏈的酯酶影響酯類香氣物質(zhì)的合成。不同菌株間代謝能力的差異會影響合成酯酶的活力及底物特異性,進(jìn)而影響果酒的香氣特征。因此,本研究以C2～C6 酯酶比活力為指標(biāo)選育適合菠蘿蜜果酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株。

以釀酒酵母CA31為對照,對初篩獲得的10株菌株的C2～C6酯酶比活力進(jìn)行測定。由表4可知,共有6株菌株酯酶的累計(jì)比活力高于CS31,但僅有YB93的C2、C4和C6酯酶比活力均高于發(fā)菌株,并且YB93的C2酯酶比活力(952.67 U/g) 比CS31(764.32 U/g)高出24.64%。因此,篩選出酯酶活力較高的突變菌株YB93。

表4 不同菌株的酯酶比活力Table 4 Esterase specific activity of different strains

2.4 優(yōu)選菌株的鑒定

突變菌株YB93外觀呈乳白色、菌落凸起,表面較濕潤、光滑,顯微鏡下邊緣圓整,細(xì)胞呈圓狀,一端出芽。突變菌株YB93的18S序列被命名為YB93,從GenBank中查找最高相似性序列,與獲得的序列進(jìn)行比較,然后使用Mega11構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹,將自展值設(shè)置為1 000次重復(fù)。18S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知,YB93菌株與MF276987.1具有100%的同源性。MF276987.1是一種托卡伊葡萄酒釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),說明YB93菌株屬于釀酒酵母屬。

圖2 酵母菌株YB93的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of yeast strain YB93

2.5 產(chǎn)香能力驗(yàn)證與關(guān)鍵風(fēng)味化合物分析

突變菌株YB93和出發(fā)菌株CS31發(fā)酵得到的菠蘿蜜果酒風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果見表5。菠蘿蜜果酒內(nèi)共檢出60種風(fēng)味物質(zhì),其中包含38種酯類化合物,11種醇類化合物,5種酸類化合物及6種其他類化合物。由表5可知,在所有化合物中,以醇酯類化合物含量最為豐富,可占到揮發(fā)性化合物總量90%以上。兩株菌株發(fā)酵的菠蘿蜜果酒在風(fēng)味物質(zhì)的種類上并沒有顯著差異,但是在含量上具有顯著差異。相較于CS31,YB93發(fā)酵的果酒中酯類、醇類以及酸類揮發(fā)性物質(zhì)總含量均較高,尤其是酯類化合物。與CS31相比,經(jīng)突變菌株YB93發(fā)酵的酒樣總揮發(fā)性物質(zhì)提高了34.28%,酯類物質(zhì)提高了60.67%。上述結(jié)果表明,雖然酯酶作用效果具有雙向性[9],但本實(shí)驗(yàn)中的酯酶對于菠蘿蜜果酒中的酯類物質(zhì)主導(dǎo)合成作用。FUJII等[26]報告了實(shí)驗(yàn)酵母菌株比對照菌株表現(xiàn)出更高的酯酶活性和更高含量的乙酸酯,其中乙酸異戊酯含量增加了27倍,乙酸乙酯含量增加了9倍。祝霞等[13]發(fā)現(xiàn)供試菌株總酯酶活性最高的ZX-1,其發(fā)酵的酒樣中主要酯類物質(zhì)(OAV>0.1)的總含量也最高,尤其是乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯等具有潛在花香和果香味的物質(zhì)含量顯著增加(P<0.05)。豐富的酯類物質(zhì)賦予YB93發(fā)酵酒體更濃郁的花香和果香味[13],提高了菠蘿蜜果酒的香氣品質(zhì)。

表5 菠蘿蜜果酒中揮發(fā)性成分的半定量分析Table 5 Semi-quantitative analysis of volatile components in jackfruit wines

續(xù)表5

風(fēng)味物質(zhì)對總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)不僅取決于其含量,還取決于其氣味閾值。通過查詢揮發(fā)性風(fēng)味化合物的氣味閾值進(jìn)行ROAV分析,其中ROAV >1的香味物質(zhì)對菠蘿蜜果酒貢獻(xiàn)較大,是菠蘿蜜果酒中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。由表6可知,兩菌株發(fā)酵的果酒中關(guān)鍵風(fēng)味化合物幾乎都是酯類,且酯類物質(zhì)數(shù)量與種類相同,可見提高酯類物質(zhì)的含量對于提高菠蘿蜜果酒香氣品質(zhì)的重要性。其中,除壬醛外,YB93各主要香氣組分的含量均高于CS31,尤其是乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯3種組分,分別提高了97.70%、122.13%、78.76%。在菌株YB93發(fā)酵果酒中,乙酸異戊酯、癸酸乙酯、異戊酸乙酯的ROAV值較高,這意味著這3種物質(zhì)對酒體風(fēng)味有著極大的貢獻(xiàn)[22],這有助于分析菠蘿蜜果酒中的典型呈香物質(zhì)。綜合以上初篩、復(fù)篩以及產(chǎn)香能力驗(yàn)證與關(guān)鍵風(fēng)味化合物分析的結(jié)果,YB93菌株是可增強(qiáng)菠蘿蜜果酒的香氣品質(zhì)的優(yōu)良菌株。

表6 菠蘿蜜果酒中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)含量及貢獻(xiàn)值Table 6 Contents and ROAV values of key flavor compounds of jackfruit wines

2.6 遺傳穩(wěn)定性測定

通過ARTP誘變選育的菌株仍然具有不穩(wěn)定性,會有回復(fù)性突變和隱性突變的可能,因此對誘變菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)驗(yàn)證菌株傳代穩(wěn)定性[18]。將誘變菌株CS31連續(xù)傳代5次測定產(chǎn)酶能力,結(jié)果如表7所示。突變菌株YB93累計(jì)酯酶比活力穩(wěn)定在2 308.51～2 318.91 U/g,且各代菌株的C2～C6酯酶活力差異不顯著,變化幅度小。因此,可以證明突變菌株YB93高產(chǎn)酯酶能力可以穩(wěn)定遺傳,發(fā)生回復(fù)性突變概率較小,可以應(yīng)用到菠蘿蜜果酒發(fā)酵中[18]。

表7 菌株YB93酶活穩(wěn)定性檢測Table 7 Enzyme activity stability test of strain YB93

3 結(jié)論

優(yōu)質(zhì)酵母菌株的篩選和培育是菠蘿蜜果酒釀造的重要一環(huán)。本實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)菠蘿蜜果酒香氣品質(zhì)為目的,進(jìn)行了菠蘿蜜果酒高產(chǎn)酯酶釀酒酵母的選育。經(jīng)ARTP誘變及系列篩選得到1株高產(chǎn)酯酶釀酒酵母YB93。經(jīng)18S rDNA測序與系統(tǒng)發(fā)育樹分析,鑒定YB93為Saccharomycescerevisiae。

在酯酶活力方面,YB93的C2、C4、C6酯酶比活力均高于發(fā)菌株,并且酯酶比活力累計(jì)量(2 319.15 U/g)比CS31(2 053.09 U/g)高出12.96%。高酯酶活力使YB93發(fā)酵果酒的醇類、酯類、酸類和總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均高于出發(fā)菌株CS31發(fā)酵的果酒,其中酯類物質(zhì)含量(7 588.31 μg/L)比出發(fā)菌株CS31(4 722.82 μg/L)提高了60.67%。通過ROAV法,分析出菠蘿蜜果酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)除壬醛外,均為酯類,較豐富的酯類物質(zhì)可以賦予YB93發(fā)酵的酒體更濃郁的花香和果香味。菠蘿蜜果酒中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)一部分來自菠蘿蜜的特征香味,一部分是由酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的芳香物質(zhì)。菠蘿蜜果酒和果汁中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)(結(jié)果中未顯示)相比較,果酒中關(guān)鍵香味物質(zhì)的含量是果汁中的12.11倍;果汁中共有8種關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),和果酒中一樣,除壬醛外均為酯類;兩者有5種風(fēng)味物質(zhì)是重疊的,其中4種為酯類,貢獻(xiàn)率最高的異戊酸乙酯和乙酸異戊酯也是果酒中貢獻(xiàn)率較大的;經(jīng)過酵母的發(fā)酵,果汁中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)丁酸異戊酯消失,果酒中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)癸酸乙酯和乙酸苯乙酯新生成,這使得菠蘿蜜果酒在不破壞菠蘿蜜典型香味的基礎(chǔ)上擁有了更豐富的香氣,達(dá)到既保留品種香,又增加發(fā)酵香的目的。經(jīng)過測定YB93菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性,具有應(yīng)用于果酒發(fā)酵的潛力。然而,本實(shí)驗(yàn)僅將誘變菌株與出發(fā)菌株的各項(xiàng)性能進(jìn)行了對比,后續(xù)試驗(yàn)有待進(jìn)一步考察突變菌株在菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程中酯酶活力和酯類物質(zhì)種類、含量的變化規(guī)律。

總體而言,本實(shí)驗(yàn)為菠蘿蜜果酒優(yōu)良酵母的選育提供了一定的參考。