李丹丹，翁啟杰，甘四明,3，周長(zhǎng)品，黃世能，李 梅*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所, 熱帶林業(yè)研究國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510520；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 江蘇 南京 210037；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100091)

猴耳環(huán)(Archidendronclypearia)是豆科(Leguminosae)云實(shí)亞科(Caesalpinioideae)猴耳環(huán)屬(Archidendron)的重要藥用樹(shù)種，廣泛分布于亞洲熱帶地區(qū)[1]。其藥用價(jià)值極高，可治療上呼吸道感染、急性咽炎和扁桃體炎等疾病，也是治療阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的有效候選藥物[2-5]。此外，猴耳環(huán)木材可用于制作家具和生產(chǎn)紙漿，藥渣還可制備高密度復(fù)合材料[4]。但是，猴耳環(huán)野生資源受人為活動(dòng)的嚴(yán)重干擾，加之其天然更新能力較弱，導(dǎo)致現(xiàn)存自然群體多為小或極小種群[6]。

全同胞家系在遺傳和育種研究中應(yīng)用廣泛，如配合力、遺傳力和遺傳增益的估算以及遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀位點(diǎn)定位等[7]。全同胞家系常常通過(guò)控制授粉獲得，但對(duì)于樹(shù)體高大的林木，控制授粉存在諸多不便，而通過(guò)分子標(biāo)記鑒定自由授粉的子代來(lái)自母本附近某個(gè)或某幾個(gè)父本則可快速構(gòu)建全同胞家系。并且，父本的確定也可為天然群體的花粉傳播范圍和異交率等提供有用信息。目前，已利用分子標(biāo)記對(duì)多個(gè)樹(shù)種的自由授粉子代進(jìn)行了父本鑒定而獲得全同胞家系，如美洲黑楊(Populusdeltoides)[8]和尾葉桉(Eucalyptusurophylla)[9]等。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSR)標(biāo)記是以2～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列，在基因組中數(shù)量豐富，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物多個(gè)領(lǐng)域的研究，包括花粉(基因)流和父本分析[10-12]。SSR標(biāo)記已用于多種林木的親本分析，如杉木(Cunninghamialanceolata)[13]及豆科植物孿葉豆(Hymenaeacourbaril)[14]和香脂樹(shù)屬樹(shù)種(Copaiferalangsdorffii)[15]。目前，猴耳環(huán)屬中已有SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的報(bào)道[16]，親本分析和全同胞子代鑒定將是猴耳環(huán)SSR標(biāo)記應(yīng)用研究的有益嘗試。

本研究利用開(kāi)發(fā)自表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)的SSR(EST-SSR)標(biāo)記，對(duì)猴耳環(huán)自然群體內(nèi)1株母本的1 489株自由授粉子代進(jìn)行父本和全同胞子代的鑒定，旨在為基于全同胞群體的后續(xù)研究提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樹(shù)種生物學(xué)特性和采樣地概況

猴耳環(huán)為常綠喬木，喜陽(yáng)光充足和氣候溫潤(rùn)的環(huán)境，通常沿著溝谷溪河邊緣散布生長(zhǎng)[4]。花期2—6月，果期4—8月；雌雄同花，數(shù)朵花聚成小頭狀花序，排成頂生和腋生的圓錐花序，雄蕊長(zhǎng)約花冠2倍，子房具短柄(http://www.iplant.cn/info/猴耳環(huán)；2021年7月19日登錄)。但是，猴耳環(huán)的傳粉方式、傳粉距離和是否存在自交等均鮮見(jiàn)報(bào)道。

采樣的自然群體位于廣東省廣州市二龍山國(guó)際生態(tài)園(113°44″E，23°21″N，最高海拔441 m)。該地屬南亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，年降雨量1 700 mm左右，年均氣溫21.6 ℃。該自然群體沿一條西南至東北流向的小溪邊零散分布，海拔范圍241～188 m，單株距溪邊1.0～20.0 m。因猴耳環(huán)自然群體多為小或極小種群[6]，該群體是筆者目前發(fā)現(xiàn)最大的兩個(gè)自然群體之一(另一個(gè)位于海南省尖峰嶺國(guó)家森林公園)。

1.2 植物材料和DNA提取

2018年6月和2019年6月在上述自然群體中采集母樹(shù)ELS31的種子。同時(shí)，采集所有可見(jiàn)的掛果單株的嫩葉，共39株，距離母本10.0～559.1 m。因猴耳環(huán)為雌雄同花，掛果單株當(dāng)年開(kāi)花，均可能對(duì)ELS31進(jìn)行了授粉，是ELS31自由授粉子代的潛在父本。種子按常規(guī)措施育苗，次年1月采集幼苗嫩葉，共計(jì)1 489株。

嫩葉DNA提取采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。采用1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，利用NanoDrop 2000(美國(guó)Thermo Scientific)測(cè)定DNA的濃度和純度，并稀釋至10 ng/μL備用。

1.3 PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)

利用前期基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)的15個(gè)EST-SSR標(biāo)記的引物對(duì)[16]，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)。引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)[16]，引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司，前向引物5′端進(jìn)行HEX、6-FAM、ROX或TAM熒光修飾。PCR體系為10 μL，包括1.0 μL 10× buffer[100 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，100 mmol/L KCl、80 mmol/L(NH4)2SO4、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NP-40和20 mmol/L MgCl2]、200 μmol/L dNTP、正向和反向引物各0.25 μmol/L、1單位TaqDNA聚合酶(上海博樂(lè)生物科技有限公司)和10 ng DNA。PCR儀為DNA Engine(美國(guó)Bio-Rad)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；35個(gè)循環(huán)包含94 ℃變性30 s，58 ℃或者60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s；最后72 ℃延伸5 min。

取PCR產(chǎn)物1.0 μL加入0.16 μL GeneScanTM500 LIZ內(nèi)標(biāo)和9.34 μL超純甲酰胺(美國(guó)Applied Biosystems)稀釋，95 ℃變性5 min后迅速置于冰塊中冷卻。SSR標(biāo)記分型在遺傳分析儀ABI 3130xl(美國(guó)Applied Biosystems)上進(jìn)行，具體參照儀器操作手冊(cè)，利用GeneMapper 4.1軟件(美國(guó)Applied Biosystems)進(jìn)行等位片段的判讀和數(shù)據(jù)收集。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件GenAlEx 6.5[17]計(jì)算等位片段數(shù)(number of alleles，Na)、有效等位片段數(shù)(number of effective alleles，Ne)和等位片段范圍(allelic size range，ASR)等標(biāo)記參數(shù)。利用軟件Cervus 3.0[18]計(jì)算觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)和多態(tài)性信息量(polymorphic information content，PIC)等多樣性參數(shù)，其中PIC基于自然群體內(nèi)無(wú)親緣關(guān)系的18株掛果單株(相距50 m以上)進(jìn)行計(jì)算。

利用軟件CERVUS 3.0[18]中“Parentage”母本已知模型，基于最大似然法確定父本的可能性，通過(guò)建立似然函數(shù)，計(jì)算每個(gè)候選父本的概率對(duì)數(shù)(logarithm of odds，LOD)，確定父本的可能性，LOD為負(fù)值表明候選父本為隨機(jī)樣品、非子代的真實(shí)父本，LOD為正值表明候選父本為真實(shí)父本的可能性大于隨機(jī)樣品，LOD值越大則為真實(shí)父本的可能性也越大。軟件設(shè)置的模擬循環(huán)為10 000次，候選父本取樣比例和不匹配的標(biāo)記位點(diǎn)比率分別設(shè)為0.80和0.01。初步確定LOD值最大的候選父本為真實(shí)父本，再結(jié)合母本、父本和子代在所有位點(diǎn)上的分離與重組進(jìn)行人工校正，母本相同時(shí)同一父本的子代群體即為全同胞家系。

利用Joinmap 4.1[19]對(duì)全同胞家系中標(biāo)記分離是否符合孟德?tīng)柶谕蛛x比進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 半同胞群體多樣性與標(biāo)記多態(tài)性

15個(gè)EST-SSR標(biāo)記的引物(對(duì))均能有效地對(duì)母本ELS31的自由授粉子代進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得89個(gè)等位片段(表1)。對(duì)于單個(gè)標(biāo)記，Na最低為4，最高為12(平均為5.9)；Ne最低1.220，最高3.318(平均2.237)；Ho最低0.191，最高0.823(平均0.584)；He最低0.185，最高0.699(平均0.525)。其中，He是衡量群體多樣性的最主要參數(shù)，平均為0.525，為中等水平。特別地，基于18株無(wú)親緣關(guān)系的單株計(jì)算的EST-SSR標(biāo)記PIC為0.577～0.885(平均0.736)，表明所用EST-SSR均為高多態(tài)性標(biāo)記，可較好地保證群體多樣性和父本分析的有效性(表1)。母本ELS31、候選父本ELS14和6株子代在標(biāo)記ARCeSSR366上的等位片段情況見(jiàn)圖1。

表1 參試15個(gè)EST-SSR標(biāo)記及其多態(tài)性參數(shù)

2.2 父本鑒定及花粉傳播距離

母本ELS31的1 489株自由授粉子代中，857株(57.6%)確定了父本(表2)，但632株(42.4%)因LOD較低未能確定父本。圖1也顯示了父本ELS14的3株子代和3株非親子代在標(biāo)記ARCeSSR366上的等位片段。共確定了34株父本，包括子代數(shù)20株以上父本10個(gè)、單個(gè)父本(全同胞家系)的子代數(shù)量為26～184個(gè)(表2)，其他24個(gè)父本共產(chǎn)生了139株子代,單個(gè)父本的子代數(shù)量為1～19株(數(shù)據(jù)未列示)。同時(shí)，也將母本ELS31作為父本進(jìn)行了分析，未發(fā)現(xiàn)自交子代，表明猴耳環(huán)是異交物種，自交的可能性極低。

對(duì)子代數(shù)量20株以上的10個(gè)父本對(duì)應(yīng)的全同胞家系進(jìn)行分析，Ho為0.502～0.693，He為0.417～0.544(表2)，均為中等水平的多樣性。不高的多樣性水平可能與遺傳基礎(chǔ)只有兩個(gè)親本有關(guān)，因任一親本(二倍體)一旦出現(xiàn)SSR純合位點(diǎn)則在子代中不分離(無(wú)多樣性)，易影響子代群體的多樣性。各家系均是Ho>He，存在雜合子過(guò)?，F(xiàn)象。

表2 鑒定的父本和子代數(shù)量及全同胞家系的多樣性參數(shù)

父本與母本的距離及子代數(shù)量的關(guān)系見(jiàn)圖2。

花粉傳播距離即確定的父本與母本ELS31的直線距離?；ǚ蹅鞑ゾ嚯x的范圍為10.0～559.1 m，平均119.2 m。主要傳播距離在150 m以內(nèi)，10株父本共產(chǎn)生了716株子代(83.5%)。隨著距離的增加，150 m之外的父本產(chǎn)生的子代數(shù)趨于減少，但個(gè)別較遠(yuǎn)單株仍可產(chǎn)生較多子代，如距母本373 m的父本ELS14產(chǎn)生了31株子代，距離最遠(yuǎn)的父本ELS01(559.1 m)和ELS02(552.2 m)分別產(chǎn)生了9株和12株子代(圖2)。

2.3 全同胞家系的標(biāo)記偏分離

對(duì)子代數(shù)量20株以上的10個(gè)全同胞家系的卡方檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 EST-SSR標(biāo)記在不同父本的全同胞家系中分離比的卡方檢驗(yàn)

表3表明，不同家系存在不同標(biāo)記數(shù)量或不同程度的偏離孟德?tīng)柗蛛x期望比，平均每家系的偏分離標(biāo)記數(shù)為8.6個(gè)，父本ELS29和ELS25的家系偏分離標(biāo)記分別為最少的3個(gè)和最多的12個(gè)(P< 0.05)。偏分離最嚴(yán)重的是標(biāo)記ARCeSSR141在父本ELS30的全同胞家系中χ2值高達(dá)164.6(P< 0.001)。此外，多個(gè)全同胞家系中標(biāo)記ARCeSSR464、ARCeSSR649和ARCeSSR448因母本和父本均為純合而無(wú)分離。

3 討 論

對(duì)猴耳環(huán)1株母本的1 489株自由授粉子代進(jìn)行了父本鑒定，共有857株(57.6%)子代確定了父本(花粉)來(lái)源，鑒定比例高于黃竹(Dendrocalamusmembranaceus)的56.4%[20]和中國(guó)沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)的53.9%[21]，但低于馬尾松(Pinusmassoniana)的72.5%[22]、日本落葉松(Larixkaempferi)的93.7%[23]和美洲黑楊的97.9%[8]。父本鑒定的子代比例常與候選父本數(shù)量、其他花粉來(lái)源、標(biāo)記(位點(diǎn))的數(shù)量和多態(tài)性等因素有關(guān)。本研究使用了15個(gè)共顯性EST-SSR標(biāo)記，在數(shù)量上滿足父本鑒定的要求[24]，并且對(duì)二龍山群體的多態(tài)性亦較高[16]。因此，相當(dāng)數(shù)量的子代(632株，42.4%)未鑒定到明確父本很可能是因?yàn)楹蜻x父本不足或存在其他花粉來(lái)源(附近父本未完全采樣)，如有的植株因種子成熟較早、ELS31采種時(shí)已經(jīng)掉果而被認(rèn)為未開(kāi)花且不會(huì)授粉，未被作為父本，或者有的父本樹(shù)體較小、在密林中不易發(fā)現(xiàn)而被遺漏，尤其是在遠(yuǎn)至500余米仍可有效授粉的情況下。此外，SSR位點(diǎn)的突變可能導(dǎo)致重復(fù)單元數(shù)的增減而產(chǎn)生非親本等位片段，從而影響鑒定的比例，如蘋(píng)果(Malusdomestica)中發(fā)現(xiàn)親本與子代SSR位點(diǎn)間發(fā)生了重復(fù)單元數(shù)的突變、但兩端的引物結(jié)合序列沒(méi)有發(fā)生變化[25]。

猴耳環(huán)花粉傳播范圍主要集中在150 m以內(nèi)，采樣群體內(nèi)平均傳播距離為119.2 m，最遠(yuǎn)可達(dá)559.1 m。這與牛蹄豆屬植物Pithecellobiumelegans平均花粉傳播距離142 m相近，但短于巴拿馬天蓬樹(shù)(Dipteryxpanamensis)平均240～557 m的距離[12]。猴耳環(huán)傳粉媒介鮮見(jiàn)報(bào)道，基于其為豆科植物且花粉散布范圍較遠(yuǎn)，推測(cè)應(yīng)為蟲(chóng)媒或以蟲(chóng)媒為主的傳粉方式?？傮w而言，花粉傳播的趨勢(shì)是距離越遠(yuǎn)，子代數(shù)越少，授粉率越低，這與植物花粉流強(qiáng)度隨距離增加而減弱的普遍規(guī)律一致[26]。

15個(gè)EST-SSR標(biāo)記在部分或全部10個(gè)全同胞家系中均有不同程度的偏分離。偏分離在多種植物中普遍存在[27]，其可能的原因較多，一般認(rèn)為從配子產(chǎn)生、合子形成到合子后發(fā)育過(guò)程中，基因互作、遺傳分化、細(xì)胞質(zhì)影響和環(huán)境因素均可導(dǎo)致偏分離的產(chǎn)生[27]。一些實(shí)驗(yàn)因素，如群體類(lèi)型與大小、標(biāo)記種類(lèi)等，也可能影響偏分離[27]。并且，偏分離也是一種重要的進(jìn)化動(dòng)力，可以增加雜合等位基因的頻率[28]，從而表現(xiàn)為雜合子過(guò)剩的現(xiàn)象。此外，偏分離標(biāo)記仍可有效用于全同胞群體的親本的遺傳圖譜構(gòu)建，因其對(duì)作圖的準(zhǔn)確性沒(méi)有影響或影響極小[29]。

本研究基于15個(gè)EST-SSR標(biāo)記鑒定了猴耳環(huán)1株母本的1 489株自由授粉子代的父本，獲得了子代20株以上的10個(gè)父本的全同胞家系。這為后續(xù)遺傳測(cè)定、遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀位點(diǎn)定位等研究提供了材料基礎(chǔ)。