吳佳雯，尹艷楠，談家金，郝德君

(南京林業(yè)大學，南方現代林業(yè)協同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病，是世界上極具危險性的林木病害之一[1]，其病原是一種移居性植物內寄生線蟲——松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)。松材線蟲生長速度快，繁殖力強，主要取食松樹薄壁細胞，使樹脂分泌停止，導致松樹迅速萎蔫直至失水死亡。松材線蟲病具有發(fā)病快、治理難度大等特點，在許多國家，特別是中國和日本，造成了巨大的經濟損失，并威脅著松林生態(tài)系統[2]。

馬尾松(Pinusmassoniana)作為我國重要的木材和油樹脂資源，是感染松材線蟲病的主要樹種。一些控制措施，如就地藥物熏蒸或燒毀，噴灑殺蟲劑殺滅媒介天牛等化學防治措施，雖然能延緩松材線蟲病的傳播速度[3]，但會污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，也會使害蟲逐漸產生抗藥性，導致防治效果逐漸減弱。因此，迫切需要尋求一種安全、有效、無污染的生物防治措施。

許多植物本身就具備抵抗外界傷害能力，能夠對多種病害產生抗病能力，即系統抗病性能，屬于先天免疫。然而，有些植物當受病原體的原發(fā)感染時，需要靠環(huán)境中的非生物或生物因子誘導才能激活其防御機制，這種誘導作用可以是多因素的。某些細菌引發(fā)植物產生系統抗性稱為ISR(ISR induced systemic resistance)現象。植物內生細菌有助于植物適應各種生態(tài)系統[4]。植物內生細菌可長期穩(wěn)定地定殖于植物體，通過自身產生的拮抗物質和酶類，與病原菌競爭營養(yǎng)物質和生態(tài)位，滅活病菌萌發(fā)因子，降解毒素，誘導寄主植物產生系統抗性ISR及信號傳導來阻止病原菌的生長和入侵[5]。一般認為ISR的抗性作用機制與病原體攻擊期間植物的超微結構變化和細胞化學改變有關，包括組織木質化增強，產生機械屏障和植保素，細胞壁增厚，改變宿主的生理和代謝反應等。目前植物內生細菌防治植物病害已得到廣泛應用[6]。

筆者選用的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)NJSZ-13菌株是南京林業(yè)大學松材線蟲病防治課題組從濕地松莖部分離得到的1株內生細菌，前期研究結果表明NJSZ-13菌株對松材線蟲有較高殺線活性[1]，并且能夠在馬尾松根、莖等不同部位定殖[7]，本研究將進一步探索該菌株能否誘導馬尾松抗松材線蟲病，為今后該菌株的研發(fā)和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬尾松2年生幼苗，江蘇沂北園林苗木有限公司提供；蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株[1]和松材線蟲強毒蟲株AMA3[8]，均由南京林業(yè)大學森林病理實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

用接種環(huán)在新鮮蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌落上取1環(huán)單菌落接入NB培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床上220 r/min震蕩培育48 h后獲得發(fā)酵液；然后將發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，將菌體沉淀用無菌水重懸制成菌懸液[9]。

1.2.2 滅活菌懸液的制備

以1.2.1同種方法制備菌懸液，再使用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min獲得滅活菌懸液。

1.2.3 松材線蟲的培養(yǎng)及接種

使用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)對松材線蟲AMA3蟲株進行培養(yǎng)，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，再用貝爾曼漏斗法收集線蟲液，并將線蟲液濃度調至3 000條/mL。

選取長勢整齊的馬尾松幼苗6株進行處理和12株為對照。灌根法施菌，施菌處理為處理Ⅰ[50 mL濃度為107CFU/mL(CFU/mL指的是每毫升樣品中含有的細菌菌落總數)的菌懸液]、處理Ⅱ(50 mL滅活菌懸液)和CK(50 mL無菌水)。4 d后再進行皮接法[10]接種松材線蟲處理，施菌的處理Ⅰ和處理Ⅱ分別接1 mL(3 000條/mL)線蟲接種液即為處理Ⅲ(處理Ⅰ+1 mL線蟲接種液)和處理Ⅳ(處理Ⅱ+1 mL線蟲接種液)，CK 1為水接1 mL無菌水(防止因刀切傷口過深導致幼苗死亡)，CK 2為水接1 mL線蟲接種液。

1.2.4 病情觀察與統計

接種松材線蟲后每7 d觀察1次馬尾松幼苗的發(fā)病情況直至CK 2全部死亡。參照談家金等[11]的方法進行病情分級和病情指數的計算：

病情指數=∑(各病級株樹×病級代表值)×100/(總株樹×最高病級的代表值)；

防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100%。

1.2.5 丙二醛含量與防御酶活性的測定

施菌前和施菌6、12、24、48和96 h后，分別取針葉做分析丙二醛(MDA)及防御酶的樣品，每處理3個重復，對照6個重復；接種松材線蟲前和接種1、7、14、21和28 d后，分別取針葉做分析防御酶的樣品，各設3個重復，重復間取樣部位基本保持一致。

粗酶液提取采用易龍等[12]的方法，丙二醛含量測定參照李合生[13]的方法；過氧化氫酶(CAT)活性測定參照王學奎等[14]的方法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑還原法[13]；苯丙氨酸氧化酶(PAL)活性測定參照王學奎等[14]的方法；多酚氧化酶PPO活性測定參照雷東鋒等[15]的方法。

2 結果與分析

2.1 NJSZ-13菌株誘導馬尾松抗松材線蟲病的防治效果

實驗結果顯示，處理Ⅲ和Ⅳ的馬尾松苗首次發(fā)病時間分別為接種線蟲后21和14 d，而CK 2馬尾松苗首次發(fā)病時間為接種后第7天，說明NJSZ-13推遲了松材線蟲病的發(fā)生時間。接種線蟲后 42 d，菌懸液處理Ⅲ的松苗發(fā)病較輕，部分松苗松針開始褪綠變黃，有的開始枯萎；滅活菌懸液處理Ⅳ的松苗發(fā)病較重，部分松苗松針褪綠變黃，有的開始枯萎，也有整株枯死的，松針變紅；而無菌水處理的CK 1生長性狀正常，接種線蟲的CK 2對照發(fā)病最重，全部松苗枯死，松針紅褐色(圖1)。由此可以看出，NJSZ-13菌株延緩了松材線蟲病的病情發(fā)展。菌懸液處理Ⅲ的防治效果為54%，滅活菌懸液處理Ⅳ的防治效果為33%(表1)。

表1 NJSZ-13菌株對松材線蟲病的防治效果

2.2 NJSZ-13菌株處理后馬尾松體內MDA含量和CAT活性的變化

NJSZ-13菌株處理后，各處理和對照的馬尾松體內丙二醛含量總體都呈先升后降的趨勢(圖2)。施菌后6 h，各處理和對照的MDA含量達到峰值，隨后MDA含量開始下降；施菌96 h后，處理和對照的MDA含量趨于相近。

從不同處理馬尾松體內過氧化氫酶活性的變化情況可知，NJSZ-13處理后，在96 h內馬尾松CAT 活性均低于對照(CK)，菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ第48 h，馬尾松的CAT活性均最低，分別為53.29 U/g和46.35 U/g(圖2)，這一結果表明NJSZ-13對馬尾松體內CAT有一定的抑制作用。

由接種松材線蟲后不同處理馬尾松體內丙二醛含量的變化情況(圖3)可見：接種松材線蟲后，除CK 1接種后28 d的MDA含量恢復到接種前水平，其他所有處理和對照的MDA含量在不同時間均明顯增加(圖3)。菌懸液處理Ⅲ和滅活菌懸液處理Ⅳ的馬尾松體內MDA含量的變化趨勢相同，隨時間先增加后減少，兩種處理MDA含量始終小于接蟲CK 2，并且菌懸液處理Ⅲ的馬尾松MDA含量始終小于滅活菌懸液處理Ⅳ。接蟲CK 2的馬尾松體內MDA含量一直處于最高水平。菌懸液處理和滅活菌懸液處理能減少馬尾松體內丙二醛的產生，可能是NJSZ-13菌株誘導馬尾松抗松材線蟲病的機制之一。

接種NJSZ-13菌株后再接種松材線蟲，處理Ⅲ、Ⅳ和接蟲CK 2馬尾松苗體內CAT活性初期較高，后期持續(xù)降低，而接種CK 1馬尾松CAT活性一直保持最高水平。兩種接菌處理的變化趨勢相似，其中菌懸液處理Ⅲ的CAT活性始終高于滅活菌懸液處理Ⅳ。接種松材線蟲14 d后，兩種施菌處理的馬尾松體內CAT活性開始高于接蟲(CK 2)處理(圖3)。

2.3 NJSZ-13菌株處理后馬尾松體內POD和PAL活性變化

NJSZ-13菌株處理后，馬尾松體內POD活性先升后降，其中前期菌懸液處理Ⅰ較滅活菌懸液處理Ⅱ的POD活性升高較快，后期兩種施菌處理的POD活性趨于與CK相近(圖4)。表明施菌前處理和CK的馬尾松POD活性差異不明顯，施菌后12 h，菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ的馬尾松POD活性達到最高，分別為406.73和382.81 U/g，而此時CK的POD活性僅為212.48 U/g。

PAL是存在于高等植物中的一種不可缺少的防御酶。試驗結果表明NJSZ-13能明顯提高馬尾松體內PAL活性，并且菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ兩者無明顯差異(圖4)。施菌后，處理和對照的PAL活性均呈先升后降的趨勢，施菌處理的PAL活性增加更快。施菌后12 h，菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ的馬尾松針葉中PAL活性達到峰值，分別為175.64和182.81 U/g。而對照的PAL活性峰值出現在施菌后24 h，為161.07 U/g。

施菌后再接種松材線蟲，馬尾松POD活性變化較大(圖5)，處理和對照均呈現先升后降的趨勢，但兩種施菌處理的POD活性始終比未施菌接蟲對照高，其中菌懸液處理Ⅲ總體上比滅活菌懸液處理Ⅳ的POD活性高，且兩者差異在接種后前期表現明顯。接種松材線蟲后7 d，菌懸液處理Ⅲ的POD活性達到最高，為777.41 U/g，而滅活菌懸液處理Ⅳ和接蟲CK2的POD活性已開始下降，分別降為681.24和473.93 U/g，此時，無菌水CK1的POD活性已超過接蟲對照，達到組內最高水平，為543.97 U/g。

僅接種松材線蟲CK2的馬尾松PAL活性先升后降，病害后期降至CK以下水平。接蟲前通過施菌處理，接蟲后的馬尾松PAL活性增加幅度較大，其中菌懸液處理Ⅲ較滅活菌懸液處理Ⅳ增加尤為明顯(圖5)。所有接蟲株的PAL活性總體上呈現先升后降的趨勢，而接無菌水CK2的活性相對穩(wěn)定。接種松材線蟲后7 d，菌懸液處理Ⅲ和接蟲CK2的PAL活性達到峰值，分別為387.41和273.93 U/g，而滅活菌懸液處理Ⅳ于接蟲后14 d的PAL活性達到峰值，為314.07 U/g。由此可見，NJSZ-13對馬尾松體內PAL活性有明顯的誘導作用。

2.4 NJSZ-13菌株處理后馬尾松體內SOD和PPO活性變化

馬尾松體內SOD活性在NJSZ-13菌株處理后，處理和對照的SOD活性含量均呈現先上升后下降的趨勢，其中施菌處理的SOD活性升高更快，并且菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ兩者間無顯著差異。施菌后12 h，滅活菌懸液處理Ⅱ的SOD活性達到峰值，為781.48 U/g，菌懸液處理Ⅰ和CK的SOD活性在施菌后24 h達到峰值，分別為772.76和702.08 U/g。

研究結果顯示接種NJSZ-13能提高馬尾松PPO活性，其中總體上菌懸液處理Ⅰ較滅活菌懸液處理Ⅱ的效果好。菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ的馬尾松在施菌96 h內出現了2個峰值，而對照CK的PPO活性波動也較大(圖6)。

但僅接種松材線蟲的馬尾松SOD活性稍增加后，便急劇下降(圖7)。接蟲前通過施菌處理，接蟲后的馬尾松SOD活性增加幅度較大，呈現先升后降的趨勢，其中菌懸液處理Ⅲ較滅活菌懸液處理Ⅳ增加尤為明顯。而接無菌水對照CK1的SOD活性相對穩(wěn)定。接種松材線蟲后14 d，所有接蟲株的SOD活性均達到峰值，菌懸液處理Ⅲ和滅活菌懸液處理Ⅳ的SOD活性分別為1 093.46和892.24 U/g，此時接蟲CK2僅769.62 U/g，由此可見，菌株NJSZ-13對馬尾松體內SOD活性有明顯的誘導作用。

所有接種松材線蟲的馬尾松PPO活性均為先升后降，而接無菌水對照(CK)馬尾松PPO活性相對穩(wěn)定。僅接種線蟲的馬尾松CK2 PPO活性于病害后期降至對照以下水平。兩個施菌處理Ⅲ的PPO活性均增加，其中通過菌懸液處理Ⅲ的PPO活性后期增加幅度明顯，而滅活菌懸液處理Ⅳ的PPO活性變化趨勢和接蟲對照相近(圖7)。接種松材線蟲后1d，滅活菌懸液處理Ⅳ和接蟲對照CK2的PPO活性達到峰值，分別為285.73和216.13 U/g，而菌懸液處理(Ⅲ)于接蟲后7 d的平均PPO活性達到峰值。由此可見，菌株NJSZ-13對馬尾松體內PPO活性有誘導作用。

3 討 論

前期研究表明，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對松材線蟲有殺線活性[1]，即該菌株本身就對線蟲有毒殺和抑制作用。為了進一步證明該菌株是否對馬尾松具有誘導抗病的作用，對菌懸液進行滅活處理，以排除細菌自身進入樹體內對線蟲的殺線作用。結果顯示，施用滅活的菌懸液后，馬尾松發(fā)病速度也有減緩，從而表明該菌具有誘導馬尾松抗病因子。Romeiro等[16]證明蠟樣芽孢桿菌UFV-101菌株的發(fā)酵上清液產生的蛋白類物質能誘導番茄葉片對黃瓜褐斑病(Corynesporacassiicola)的抗性，本研究中發(fā)現不管是菌懸液還是滅活的菌懸液，對松材線蟲病都具有一定的防治效果，說明本試驗中菌株NJSZ-13誘抗因子是非蛋白類物質。而菌懸液的防病效果要好于滅活的菌懸液，可能是由于菌懸液里的菌種在馬尾松根部定殖，起到直接抑制和長期誘導相結合的作用，但滅活的菌懸液只能起到短期的誘導作用。說明NJSZ-13可能既能通過其生理活性定殖馬尾松體內直接抑制松材線蟲的生長，同時又能誘導馬尾松防御反應來抵抗松材線蟲的侵染。

MDA含量常常可反映植物體內脂質過氧化的程度和細胞損傷的程度，是植物衰老和抗性生理中常用的指標。試驗表明接種NJSZ-13菌株能明顯降低接蟲馬尾松體內MDA含量。CAT活性的高低影響到植物體內H2O2的積累水平。H2O2有雙重作用，少量的H2O2能激活病程相關蛋白的表達，過多又會對植物細胞造成傷害。隋麗等[17]研究發(fā)現，放線菌769的發(fā)酵液能夠抑制水稻過氧化氫酶活性，對水稻具有誘導抗性。本試驗中，施菌處理后馬尾松體內CAT活性明顯低于無菌水對照，而接蟲后期又高于接蟲對照，說明菌株NJSZ-13于接蟲前期可誘導馬尾松產生抗性。

POD可以催化酚類物質的氧化，并參與木質素(木質素具有限制病原菌正常進出細胞，抑制病原菌的生長等作用)的合成，還參與乙烯的生物合成和氧自由基的消除反應。SOD可以調節(jié)植物體氧化與抗氧化關系，使它們達到動態(tài)平衡，能保護細胞免受超氧陰離子自由基對細胞的損傷。PAL能催化苯丙氨酸的脫氨反應，是苯丙烷代謝的關鍵酶，其活性與植物抗病性呈正相關，是抗病性的一個生化指標。PPO不僅能催化木質素的合成，構成保護細胞的機械屏障，還能氧化合成對病原菌有毒的醌類物質，抑制病原菌的生長和入侵。經NJSZ-13菌株菌懸液和滅活菌懸液處理后，馬尾松體內的這4種酶活性均表現出明顯的增加，接種松材線蟲后也始終比對照高，說明NJSZ-13菌株能誘導馬尾松抗松材線蟲病。