白春玲，楊磊，蘇廣華，魏著英，王學(xué)僑，朱琳，周新宇，海超，吳迪，劉雪霏，武云喜，張立，李光鵬

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010071）

研究表明，一些低等物種，如線(xiàn)蟲(chóng)、真菌和藻類(lèi)，在合成LC-PUFA方面表現(xiàn)出良好的能力，許多研究者致力于培育新的或改良的物種，以將其作為合成LC-PUFAs和通過(guò)分子克隆進(jìn)一步開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的來(lái)源[14-16]。在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的FAT1基因編碼脂肪酸脫氫酶，能夠通過(guò)在甲基末端的第3個(gè)碳上添加1個(gè)雙鍵而將n-6 PUFAs催化至n-3 PUFAs，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)此類(lèi)酶。為提高n-3 PUFAs含量，研究者們嘗試通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)富含n-3 PUFAs的家畜動(dòng)物，迄今已獲得了轉(zhuǎn)FAT1基因豬[17-23]、牛[14-26]和羊[27-28]，且經(jīng)檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中n-3 PUFAs水平明顯升高，n-6/n-3 PUFAs比值明顯下降，說(shuō)明FAT1轉(zhuǎn)基因促進(jìn)了n-6 PUFAs向n-3 PUFAs的合成，而且FAT1轉(zhuǎn)基因通過(guò)上調(diào)參與多不飽和脂肪酸合成途徑的酶基因表達(dá)，增強(qiáng)了n-3PUFAs的合成。

本實(shí)驗(yàn)室自2008年開(kāi)始，以線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源的FAT1基因?yàn)榘袠?biāo)，在奶牛、肉牛和綿羊中開(kāi)展轉(zhuǎn)基因研究[24,27]，并于2009年成功培育出世界首例FAT1轉(zhuǎn)基因奶牛，經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛體細(xì)胞與奶汁中的n-3 PUFAs含量顯著高于普通奶牛，n-6/n-3比值接近于1.0，而且奶牛的繁殖能力未受到明顯影響[24]。同時(shí)用FAT1轉(zhuǎn)基因牛的奶飼喂小鼠表明，轉(zhuǎn)基因牛奶對(duì)小鼠的生理反應(yīng)、生長(zhǎng)繁殖能力以及肝臟和腎臟代謝均無(wú)不良影響[29]。本研究利用超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)（multisuperovulation and embryo transfer，MOET）對(duì) 原 代FAT1轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行擴(kuò)繁，獲得F1代轉(zhuǎn)基因牛；在F1代牛中，選育出可用于品系培育的系祖公牛；利用系祖公牛生產(chǎn)F2代轉(zhuǎn)基因牛，分別對(duì)F1和F2代牛遺傳穩(wěn)定性、生長(zhǎng)指標(biāo)與血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析，旨在獲得FAT1轉(zhuǎn)基因牛育種基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期為優(yōu)質(zhì)肉牛生物育種并為大眾提供健康牛肉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)管理

轉(zhuǎn)基因牛由原代轉(zhuǎn)基因克隆牛[24]擴(kuò)繁而來(lái)，同野生型牛一并養(yǎng)殖于內(nèi)蒙古內(nèi)大圣牧高科牧業(yè)有限公司牧場(chǎng)，全舍飼散養(yǎng)，用全混合日糧（total mixed rations，TMR）飼喂，每天7:00和17:00分別飼喂1次。TMR組成比例：青貯玉米62%、燕麥草2%、壓片玉米2%、棉籽3%、高產(chǎn)精補(bǔ)料16%、圍產(chǎn)料2%、中產(chǎn)精補(bǔ)料11%、苜蓿2%。

1.2 超數(shù)排卵與胚胎移植

以養(yǎng)殖于內(nèi)蒙古內(nèi)大圣牧高科牧業(yè)有限公司牧場(chǎng)的原代FAT1轉(zhuǎn)基因牛ZK002為供體（已獲批開(kāi)展中間試驗(yàn)，備案報(bào)告號(hào)：農(nóng)基安辦報(bào)告字〔2020〕第220號(hào)），用于超數(shù)排卵。將投放牛用孕酮陰道栓（1.9 g·支-1，新西蘭DEC國(guó)際有限公司）當(dāng)天定為發(fā)情第0天，并在第9天開(kāi)始超數(shù)排卵，采用連續(xù)4 d注射促卵泡激素（FOLLTROPINV，700 IU·瓶-1，加拿大Vetoquinol公司）進(jìn)行超排處理，并在注射卵泡激素第3天同時(shí)注射氯前列醇鈉注射液（獸藥字110252207，10 mL·支-1，寧波第二激素廠(chǎng)），注射完最后1針后取出牛用孕酮陰道栓，第13天根據(jù)發(fā)情情況進(jìn)行人工授精，所用精液為本牧場(chǎng)養(yǎng)殖公牛精液。在發(fā)情后的第7天采用非手術(shù)法沖胚，每個(gè)子宮角反復(fù)沖3~4次，鏡檢回收胚胎，并將回收胚胎移植于受體牛子宮中，發(fā)情開(kāi)始后第60天進(jìn)行妊娠檢查。

1.3 轉(zhuǎn)基因鑒定

提取待檢牛血液基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。設(shè)計(jì)合成FAT1基因PCR擴(kuò)增引物，F(xiàn)1代鑒定：正向引物序列為5’-TCCAGCACTTTCTTCACGC-3’，反向引物序列為5’-TCAACGCCAACACCAAGC-3’，產(chǎn)物大小為942 bp；F2代鑒定：正向引物序列為5’-AACTTGGATCCCTGGTTATTGTGCTGTCTCAT-3’，反向引物序列為5’-AACTTGCGGCCGCCTCATCACT TGGCCTTGG-3’，產(chǎn)物大小為1 258 bp。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 血液脂肪酸分析

取1 mL血清加入3 mL氯仿-甲醇溶液（體積比為2∶1），混勻，室溫過(guò)夜；1 500 r·min-1離心5min，取上清，氮?dú)獯蹈?；正已?00μL溶解，振蕩2 min；加入1 mL KOH-甲醇飽和溶液（35.5 g·L-1），劇烈振蕩后，室溫靜置過(guò)夜；1 000 r·min-1離心10 min，取上清，加入小玻璃瓶中，采用氣象質(zhì)譜儀（GCMS-QP2010 ultra，日本島津公司）檢測(cè)脂肪酸各組分的相對(duì)含量。

1.5 外源基因的組織表達(dá)檢測(cè)

屠宰1頭原代成年FAT1轉(zhuǎn)基因母牛，分別取其心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪和腦等組織，以βactin為內(nèi)參，分別檢測(cè)各組織中FAT1基因的RNA表達(dá)情況。提取不同組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反應(yīng)體系為20μL：cDNA 2μL，SYBR PremixExTaq10μL，正反向引物（10μmol·L-1）各0.8μL，H2O 16.4μL。PCR反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。

2019年，智慧建筑專(zhuān)委會(huì)將著重加強(qiáng)組織建設(shè)工作，深入了解會(huì)員單位、緊密團(tuán)結(jié)核心會(huì)員單位、搭建會(huì)員單位有效溝通平臺(tái)；繼續(xù)圍繞標(biāo)準(zhǔn)工作穩(wěn)步推進(jìn)，充分發(fā)揮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)行業(yè)的發(fā)展支撐作用；積極推動(dòng)課題項(xiàng)目落地成熟，以問(wèn)題為導(dǎo)向， 推動(dòng)國(guó)密算法、節(jié)能技術(shù)在智能建筑領(lǐng)域的應(yīng)用。

1.6 組織的脂肪酸分析

采用氣相質(zhì)譜儀分別分析了轉(zhuǎn)基因牛肺、肝、心、脾、脂肪、腦、腎和肌肉組織中37種脂肪酸的含量，同時(shí)選取野生型牛相應(yīng)組織作為對(duì)照。分別稱(chēng)取各組織0.5 g，置于F6/10-6G勻漿器（德國(guó)弗魯克公司）中，加入3 mL氯仿-甲醇溶液（體積比為2∶1），研磨勻漿液，靜置至分層為止；收集上清液4℃保存，向剩余混濁液體加入2 mL氯仿-甲醇溶液（體積比為2∶1），混合均勻，室溫靜置過(guò)夜；收集上清液，與第1次的上清液混合，在TTLDCII氮?dú)獯蹈蓛x（北京同泰聯(lián)科技）上吹干。收集沉淀，加入2 mL正己烷，完全溶解后加入400μL KOH-甲醇飽和溶液（35.5 g·L-1），劇烈振蕩混勻2 min，靜置10 min，取上清液-20℃保存。取700μL液體于上樣瓶中，進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析。

1.7 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量

分別在轉(zhuǎn)基因牛出生0、3、6、9、12、15、18月齡時(shí)測(cè)定生長(zhǎng)性狀指標(biāo)，包括體質(zhì)量、體高、十字部寬、胸圍等，其中體高是指由肩胛骨凸起處到地面的相對(duì)高度，十字部寬是指兩腰角間的水平距離，胸圍是指肩胛骨處垂直周長(zhǎng)。F1代FAT1轉(zhuǎn)基因牛（公牛2頭、母牛6頭，轉(zhuǎn)基因組）與野生型牛（公牛3頭、母牛8頭，對(duì)照組）比較；F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛（母牛6頭、公牛6頭，轉(zhuǎn)基因組）與野生型牛（公牛4頭、母牛7頭，對(duì)照組）比較。

1.8 繁殖能力分析

①母牛繁殖能力分析：觀察母牛初情期、性成熟期、發(fā)情周期及發(fā)情表現(xiàn)，并通過(guò)超數(shù)排卵的方式分析其對(duì)激素的反應(yīng)能力，方法同1.2。②公牛精液品質(zhì)分析：采用假陰道法采集成年健康轉(zhuǎn)基因公牛ZK005精液，將稀釋到合適密度的精液取10μL填充到通道載玻片上，然后放于Ni-U顯微鏡下（日本尼康公司），操作臺(tái)恒溫37℃。選擇3個(gè)不同區(qū)域采用MICROPTIC精子分析儀（法國(guó)卡蘇公司）分析精子活力，用Digitcool程序化自動(dòng)冷凍儀（法國(guó)卡蘇公司）冷凍精液，解凍時(shí)將細(xì)管冷精液從液氮罐里取出，置于室溫10 s，之后將細(xì)管放于37℃恒溫水浴鍋中解凍10~15 s，待解凍后用酒精棉球擦拭細(xì)管，再用剪子剪開(kāi)細(xì)管，將精液吹入含5 mL BO（Bracket and Oliphant）液的15 mL玻璃管中（BO液提前預(yù)熱至少1 h），取10μL填充到通道載玻片上，放于顯微鏡下分析精子活力。

1.9 血液生化指標(biāo)的測(cè)定

分別采集轉(zhuǎn)基因牛和野生型牛頸部靜脈血13 mL，3 000 r·min-1離心10 min，將獲得的血清用C311生化分析儀（德國(guó)羅氏公司）測(cè)定血液生化指標(biāo)，取300μL放入1.5 mL離心管中，置于分析儀樣品轉(zhuǎn)盤(pán)，用儀器自動(dòng)分析輸出數(shù)據(jù)。測(cè)定指標(biāo)包括葡萄糖、肝功指標(biāo)（堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、總蛋白、白蛋白、膽堿脂酶、肌酸激酶）、脂代謝相關(guān)指標(biāo)（膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、脂肪酶）、腎功能指標(biāo)（尿素、肌酐）及血液α-淀粉酶、乳酸和乳酸脫氫酶等。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代FAT1轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)效率

以FAT1轉(zhuǎn)基因牛ZK002為供體，通過(guò)超數(shù)排卵與人工輸精生產(chǎn)胚胎，再經(jīng)胚胎移植獲得胚胎23枚，移植入18頭西門(mén)塔爾受體牛子宮；60 d妊娠檢查時(shí)，有14頭妊娠，妊娠率為77.8%；發(fā)育到期后，產(chǎn)下14頭犢牛，產(chǎn)犢率為100%。經(jīng)DNA鑒定，在14頭犢牛中有8頭為FAT1轉(zhuǎn)基因牛（圖1），陽(yáng)性率為57.1%，其中2頭公牛（ZK004、ZK005）和6頭母牛（FD001、FD002、FD003、FD004、FD005、FD006）。

圖1 F1代轉(zhuǎn)基因牛FAT-1基因整合的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of FAT-1 gene integration in F1 transgenic cattle

2.2 血液中不同脂肪酸水平比較

由表1可知，F(xiàn)1代FAT1轉(zhuǎn)基因牛血液中n-3 PUFAs含量明顯高于轉(zhuǎn)基因陰性牛和野生型對(duì)照牛，n-6/n-3 PUFAs平均值顯著低于轉(zhuǎn)基因陰性牛和野生型對(duì)照牛（P＜0.01）。結(jié)果表明，外源FAT1基因在牛體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能，可將n-6 PUFAs有效地轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs。

表1 F1代FAT1轉(zhuǎn)基因牛血液中脂肪酸組成Table1 Fatty acids composition in blood of FAT1 transgenic cattle in F1 generation

2.3 轉(zhuǎn)基因牛不同組織中FAT1基因的表達(dá)和脂肪酸含量比較

分別檢測(cè)了原代轉(zhuǎn)基因牛各組織中FAT1基因的RNA表達(dá)情況，結(jié)果（圖2）顯示，F(xiàn)AT1基因在肺中表達(dá)最低，將其設(shè)定為1，依次分別計(jì)算出其他組織相對(duì)于肺組織的表達(dá)量，F(xiàn)AT1基因的RNA表達(dá)量由低到高依次為肺、肝、心、脾臟、脂肪、腦、腎臟和肌肉，其中肌肉中表達(dá)量是肺組織表達(dá)量的36.60倍。對(duì)各種組織的脂肪酸含量進(jìn)行分析（表2）顯示，與野生型牛相比，轉(zhuǎn)基因牛各組織n-6/n-3 PUFAs比值均下降，表明FAT1在轉(zhuǎn)基因牛體內(nèi)能夠表達(dá)并合成脂肪酸脫氫酶，有效地將n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs。

表2 不同組織中n-6/n-3PUFAs比值Table2 n-6/n-3PUFAsratioindifferenttissues

圖2 FAT1在不同器官組織中的表達(dá)情況Fig.2 E xpression of FAT1 in different tissues

2.4 F1代FAT1轉(zhuǎn)基因牛生長(zhǎng)發(fā)育情況

對(duì)F1代轉(zhuǎn)基因牛生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量顯示（表3），轉(zhuǎn)基因組公牛和母牛0~18月齡體質(zhì)量、體高、十字部寬和胸圍與對(duì)照組牛差異均不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明轉(zhuǎn)FAT1基因后不影響宿主牛的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

表3 F1代FAT1轉(zhuǎn)基因牛與野生型對(duì)照牛主要生長(zhǎng)指標(biāo)比較Table3 ComparisonofthemaingrowthindexesbetweenFAT1transgenicF1generationcattleandwildtypecontrolcattle

2.5 F1代FAT1轉(zhuǎn)基因母牛繁殖能力

本研究先后獲得F1代FAT1轉(zhuǎn)基因母牛6頭，觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因母牛初情期出現(xiàn)在10~13月齡，性成熟期為14~16個(gè)月，發(fā)情周期為21.0~22.5 d，發(fā)情表現(xiàn)為外陰部腫脹、黏膜充血、排黏液、接受爬跨或爬跨。母牛成年后，對(duì)其進(jìn)行集中超數(shù)排卵、人工授精以生產(chǎn)胚胎。結(jié)果顯示，在6頭母牛中，其中1頭連續(xù)同期處理2次均未表現(xiàn)明顯的發(fā)情，也沒(méi)有獲得可利用的胚胎；1頭母牛對(duì)激素非常敏感，同等劑量的激素會(huì)引發(fā)其卵巢水腫，每次超排能夠獲得5~6枚胚胎，但僅有3枚可用，其余2~3枚卵子均沒(méi)有受精；另外4頭牛發(fā)情效果與對(duì)照組無(wú)明顯差異，平均每頭獲得良好胚胎6.5枚，其中有2頭表現(xiàn)最好，每次均可得10枚以上的優(yōu)質(zhì)胚胎。比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代FAT1轉(zhuǎn)基因母牛的卵泡發(fā)育、排卵行為、受精能力、胚胎發(fā)育能力等均與野生型牛無(wú)明顯差異。

2.6 F1代FAT1轉(zhuǎn)基因公牛繁殖能力

分別將2頭F1代FAT1轉(zhuǎn)基因公牛命名為ZK004和ZK005，ZK004體況較弱，ZK005生長(zhǎng)發(fā)育良好。ZK005公牛在13月齡時(shí)出現(xiàn)雄性表現(xiàn)，活躍興奮，爬跨其他牛；在16月齡時(shí)，開(kāi)始對(duì)其采精訓(xùn)練；到20月齡時(shí)，正式采精與凍精。精液分析表明，精液密度平均1.36×109·mL-1，鮮精活力為60%~70%，凍后活力為40%，各項(xiàng)指標(biāo)均高于野生型公牛。

利用ZK005的精液分別與西門(mén)塔爾牛與魯西黃牛進(jìn)行配種，生產(chǎn)F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛，獲得17頭犢牛，其中15頭存活至周歲，存活率為88.2%。分別從F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛的背最長(zhǎng)肌采集肌肉組織，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果（圖3）表明，在存活的15頭牛中，F(xiàn)AT1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性牛12頭（編號(hào)：190220、190221、1904051、1904052、190427、190429、190505、190506、190510、190623、190624和190630），陽(yáng)性率為80%（12/15）。FAT1基因在12頭牛的肌肉中均檢測(cè)到目的條帶，PCR產(chǎn)物大小為1258bp。說(shuō)明FAT1基因在這些個(gè)體中均可以正常轉(zhuǎn)錄為mRNA。

圖3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛組織中外源基因FAT1的表達(dá)Fig.3 RT-PCRdetection of the expression of FAT1 gene in transgenic F2 generation cattle

分別提取12頭F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛及ZK005的肌肉組織蛋白，通過(guò)Western blotting的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果（圖4）顯示，所有組織樣品中均可以檢測(cè)到FAT1蛋白，說(shuō)明FAT1基因在轉(zhuǎn)基因牛中均可以穩(wěn)定表達(dá)。

圖4 FAT1轉(zhuǎn)基因牛的Western blotting檢測(cè)Fig.4 Western blotting detection of the FAT1 gene expression

2.7 F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛的生長(zhǎng)發(fā)育

對(duì)F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量顯示（表4），在同等飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，0~18月齡F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛的體質(zhì)量、體高、十字部寬、胸圍等主要生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明FAT1轉(zhuǎn)基因?qū)蟠纳L(zhǎng)發(fā)育不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。

表4 F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛與野生型對(duì)照牛主要生長(zhǎng)指標(biāo)比較Table 4 Comparison of the main growth indexes between FAT1 transgenic F2 generation cattle and wild type control cattle

2.8 F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛的血液生理生化指標(biāo)

對(duì)獲得的F2代FAT1轉(zhuǎn)基因牛（轉(zhuǎn)基因組）分別進(jìn)行血液生理生化指標(biāo)檢測(cè)，并與野生型牛（對(duì)照組）的血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行比較，由表5可知，轉(zhuǎn)基因組牛除了個(gè)別時(shí)期個(gè)別指標(biāo)出現(xiàn)差異外，在生產(chǎn)發(fā)育過(guò)程中血糖、肝功能、總蛋白、白蛋白、膽堿酯酶、肌酸激酶等指標(biāo)均與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但整體呈現(xiàn)略低于對(duì)照組的現(xiàn)象。脂代謝指標(biāo)中，高密度脂蛋白膽固醇水平高于對(duì)照組牛（P＜0.05），而低密度脂蛋白膽固醇水平低于對(duì)照組牛（P＜0.05），總膽固醇水平低于對(duì)照組牛（P＜0.05），甘油三酯僅在15月齡顯著高于對(duì)照組牛（P＜0.05），其他時(shí)期無(wú)顯著差異（P＞0.05）。其他血液學(xué)指標(biāo)中，轉(zhuǎn)基因組牛肌酐、α-淀粉酶水平均低于對(duì)照組牛，乳酸脫氫酶水平均高于對(duì)照組牛，乳酸含量均低于對(duì)照組牛。以上結(jié)果表明，F(xiàn)AT1轉(zhuǎn)基因牛對(duì)牛血糖、肝功能未產(chǎn)生顯著影響，但影響了宿主牛的脂代謝，一些關(guān)鍵指標(biāo)呈下降趨勢(shì)，但均在正常參考值范圍內(nèi)，說(shuō)明FAT1轉(zhuǎn)基因?qū)λ拗鹘】捣矫嫖丛斐娠@著影響。

表5 F2代FAT1 轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛血液生化指標(biāo)比較Table5 Comparison of blood biochemical indexes between FAT1 transgenic F2 generation cattle and wild type cattle 續(xù)表 Continued

表5 F2代FAT1 轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛血液生化指標(biāo)比較Table5 Comparison of blood biochemical indexes between FAT1 transgenic F2 generation cattle and wild type cattle

3 討論

現(xiàn)代生物育種技術(shù)包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)，能夠加速育種進(jìn)程，以達(dá)到精準(zhǔn)育種的目的，培育滿(mǎn)足不同需求的品種[30]。n-3 PUFAs與人類(lèi)健康關(guān)系密切，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將外源FAT1基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物基因組，再通過(guò)轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物性食品提供給人類(lèi)必需的n-3 PUFAs。在前期工作中，本課題組獲得了FAT1轉(zhuǎn)基因牛并對(duì)其進(jìn)行了功能性分析[24]，本研究則對(duì)其進(jìn)一步擴(kuò)繁，對(duì)F1代進(jìn)行評(píng)價(jià)并從中選育系祖公牛以進(jìn)行品系培育。

外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備成功的重要指標(biāo)[31]。本研究從原代牛經(jīng)過(guò)MOET技術(shù)獲得的F1代牛中，n-3 PUFAs顯著升高，n-6/n-3 PUFAs比值由野生型的10.59～21.98降至8.38~1.12；組織表達(dá)檢測(cè)顯示，F(xiàn)AT1在各種可食用組織中均有表達(dá)，其中肺部表達(dá)量最低，肌肉中表達(dá)量最高，其脂肪酸表達(dá)也呈相同趨勢(shì)，脂肪酸中n-3 PUFAs所占比例提高，n-6/n-3 PUEAs比值下降，表明F1代牛中FAT1基因仍在穩(wěn)定發(fā)揮生物學(xué)功能。外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)與插入位點(diǎn)密切相關(guān)，本課題組在前期工作中已鑒定出原代牛FAT1基因插入到6號(hào)染色體NCAPG和LCORL之間的基因空白區(qū)域[32]。本研究獲得的轉(zhuǎn)基因牛后代性狀表現(xiàn)良好，繁殖性能正常，遺傳穩(wěn)定性較好，表明這個(gè)區(qū)域是適合轉(zhuǎn)基因的安全位點(diǎn)。

由于本研究前期獲得的原代牛為母牛，為了品系培育考慮，如果要快速擴(kuò)大核心群體，需要再選育性狀優(yōu)良的公牛作為系祖。系祖公牛要求有優(yōu)良的性狀、其后代要能穩(wěn)定遺傳優(yōu)良性狀。本研究中F1代公牛ZK005經(jīng)基因組水平檢測(cè)、功能鑒定和生長(zhǎng)性狀測(cè)定，表現(xiàn)出良好的性狀，遺傳穩(wěn)定，功能表現(xiàn)良好，繁殖能力較好，且其后代遺傳穩(wěn)定性也較好，因此本研究將ZK005作為備用系祖公牛，用以進(jìn)一步培育FAT1轉(zhuǎn)基因牛。

本研究采用ZK005精液配種獲得了F2代牛12頭，F(xiàn)AT1基因穩(wěn)定遺傳并有效表達(dá)，通過(guò)生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量和血液生化分析對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和健康狀況進(jìn)行評(píng)估。生長(zhǎng)指標(biāo)是品種培育的基本要求，F(xiàn)AT1轉(zhuǎn)基因牛的生長(zhǎng)發(fā)育與野生型牛一致，無(wú)顯著差異，表明外源基因的轉(zhuǎn)入沒(méi)有影響生長(zhǎng)進(jìn)程。血液生理生化指標(biāo)與動(dòng)物健康狀況密切關(guān)聯(lián)，動(dòng)物血液生理生化參數(shù)主要由動(dòng)物自身的遺傳因素與環(huán)境因素決定與控制。華文君等[33]對(duì)轉(zhuǎn)sFat1-基因豬進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因豬生理生化指標(biāo)、繁殖性能、血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。本研究中，血糖水平在FAT1轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛中差異不顯著，但是在生長(zhǎng)過(guò)程中略低于野生型牛。機(jī)體中的血糖可以反映動(dòng)物能量代謝水平，已有研究表明，飲食中如果缺乏n-3 PUFAs會(huì)增加機(jī)體患Ⅱ型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[34]，n-3 PUFA通過(guò)影響細(xì)胞的胰島素敏感性，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因Glut4的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞吸收血液中的葡萄糖[35]。研究表明低n-6/n-3 PUFAs比值可以降低糖尿病患者胰島素抵抗來(lái)改善糖代謝[36]。有研究者對(duì)FAT1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT1表達(dá)引起n-3 PUFAs升高使血糖水平降低[37]。本研究中FAT1轉(zhuǎn)基因牛能夠改善糖代謝，與前人研究結(jié)果一致。生化指標(biāo)可以反映機(jī)體的肝臟功能的變化情況，如果超出正常生理水平范圍，則說(shuō)明肝臟受到一定損傷的潛在可能。有研究者對(duì)FAT1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)為脂肪肝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其肝臟的脂肪變性較野生型小鼠輕，對(duì)肝細(xì)胞的充氣和纖維化癥狀有緩解作用，表明n-3 PUFAs對(duì)脂肪肝疾病的發(fā)生有保護(hù)作用[38]。本研究中，轉(zhuǎn)基因牛肝功指標(biāo)與野生型牛差異不顯著，反映肝損傷的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶雖然有個(gè)別時(shí)期出現(xiàn)了差異，但是不具有損傷性；且轉(zhuǎn)基因牛中代表肝臟合成功能的總蛋白、白蛋白水平未發(fā)生明顯變化，表明肝臟功能未受轉(zhuǎn)基因的影響。血脂指標(biāo)是衡量動(dòng)物體健康的另一項(xiàng)重要指標(biāo)，過(guò)高的血液膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化等疾病的發(fā)生，而高密度脂蛋白膽固醇則能防止動(dòng)脈硬化的發(fā)生，降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，n-3 PUFAs可以促進(jìn)膽固醇代謝為膽酸和中性固醇，形成膽汁后經(jīng)糞便排出，因此能夠有效降低膽固醇的水平[39-40]，n-3 PUFAs還能降低甘油三脂和低密度脂蛋白膽固醇的水平[41-42]。本研究中轉(zhuǎn)基因牛血脂指標(biāo)總體來(lái)說(shuō)與野生牛無(wú)顯著差異，只是在個(gè)別時(shí)期出現(xiàn)差異，但這些差異均是有益的變化，如膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇降低而高密度脂蛋白膽固醇升高。表明FAT1基因的轉(zhuǎn)入與功能發(fā)揮對(duì)健康無(wú)不利影響。乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中的氧化還原酶，催化乳酸氧化為丙酮酸，引起乳酸脫氧酶升高的原因較多，如心肌梗死、急性肝炎/肝硬化等肝臟疾病、血液病、骨骼肌損傷等。本研究中，F(xiàn)AT1轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛相比，在部分生長(zhǎng)階段中血清乳酸脫氫酶水平升高，相應(yīng)的乳酸水平降低，但均在參考值范圍內(nèi)[43]。

綜上所述，F(xiàn)AT1基因的轉(zhuǎn)入不影響牛的繁殖能力，后代牛能穩(wěn)定遺傳外源基因并發(fā)揮功能，健康狀況未受顯著影響；由系祖公牛繁殖的轉(zhuǎn)基因牛后代的各項(xiàng)指標(biāo)均符合品系培育預(yù)期，因而利用系祖法培育FAT1轉(zhuǎn)基因新品系或新品種具有可行性。本研究為培育優(yōu)質(zhì)肉牛奠定了基礎(chǔ)，有望在將來(lái)為大眾提供高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值牛肉。