王小琪，段子淵

（中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京100101）

非損傷性取樣（非侵入式）是在不傷害動(dòng)物的前提下，采集動(dòng)物的糞便、尿液、毛發(fā)或含有口腔脫落細(xì)胞的食物殘?jiān)瓤赡芎羞z傳信息的樣本（周璨林等，2015）。相比于傷害性取樣，非損傷性取樣方法更加簡(jiǎn)單方便，對(duì)動(dòng)物機(jī)體沒(méi)有傷害。在動(dòng)物研究中，尤其是在野生動(dòng)物的研究中使用較為廣泛。其中，糞便樣本因其易獲得、識(shí)別性高和含有多元遺傳信息的優(yōu)點(diǎn)，極大地促進(jìn)了動(dòng)物學(xué)的相關(guān)研究（單磊等，2018），并由此誕生了一門(mén)新的學(xué)科：分子糞便學(xué)。目前，糞便是應(yīng)用最廣泛的非損傷性樣本，利用糞便樣本可對(duì)動(dòng)物開(kāi)展食性分析、腸道微生態(tài)研究、標(biāo)記物篩選、種群遺傳多樣性分析等多方面的深入研究。尤其是近20年來(lái)，二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，標(biāo)志著測(cè)序正式進(jìn)入到高通量時(shí)代，為遺傳信息的發(fā)掘提供了大量、高效且可靠的數(shù)據(jù)，快速推動(dòng)了各類組學(xué)的發(fā)展。糞便在動(dòng)物研究中的傳統(tǒng)應(yīng)用方式已被多次報(bào)道（劉丙萬(wàn)，蔣志剛，2002；周璨林等，2015），本文就目前利用測(cè)序技術(shù)提取糞便樣本中分子遺傳信息的研究予以簡(jiǎn)要概述。

1 食性研究

動(dòng)物的食性研究是了解動(dòng)物與環(huán)境相互關(guān)系的前提。然而對(duì)于野生動(dòng)物或放牧家畜來(lái)說(shuō)，食物是不可控的，不了解它們吃了什么，就無(wú)法進(jìn)一步研究其活動(dòng)范圍、飲食結(jié)構(gòu)及營(yíng)養(yǎng)代謝。除了對(duì)糞便樣本的視覺(jué)觀察，從20世紀(jì)80年代起，基于DNA的鑒定方法出現(xiàn)，到21世紀(jì)初期，DNA條形碼正式出現(xiàn)并被標(biāo)準(zhǔn)化（Hebertet al.，2003）。DNA條形碼是一個(gè)特定的短序列DNA 片段，具有物種特異性，可以被用來(lái)準(zhǔn)確快速地識(shí)別物種。但尚未有適用于所有物種的通用條形碼，為了獲得更高的覆蓋度和準(zhǔn)確率，通常組合使用DNA 條形碼，這些組合條形碼主要來(lái)自以下基因片段：動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ基因，植物核糖體大亞基的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶基因，葉綠體成熟酶K 基因，葉綠體trnL 內(nèi)含子區(qū)和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Group CPW，2009；Valentiniet al.，2009；Taberletet al.，2012；張瑞瑩，2013）等。DNA宏條形碼是隨著二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展而誕生的用于檢測(cè)混合樣本的條形碼技術(shù)，可以快速、大規(guī)模地鑒定糞便樣本中的DNA，確定食物范圍、種類和成分。由于動(dòng)物有肉食性、草食性和雜食性，所以需要對(duì)被檢動(dòng)物的飲食情況有所了解，才能夠選擇合適的引物用于DNA宏條形碼檢測(cè)；同時(shí)，還需要采集當(dāng)?shù)氐闹参锘騽?dòng)物樣本，建立適用于當(dāng)?shù)氐腄NA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，用于比對(duì)測(cè)序得到的宏條形碼（劉剛等，2018）。

2 腸道微生態(tài)研究

胃腸道微生物數(shù)量眾多，與宿主共同進(jìn)化，保持動(dòng)態(tài)平衡有助于維持宿主腸道健康（Relman，2012），也對(duì)宿主的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控起重要作用（B?ckhedet al.，2004；Kataoka，2016）。當(dāng)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到干擾時(shí)，胃腸道和其他器官（大腦、肝臟等）的功能會(huì)受到損害。探索腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，有助于了解微生物組對(duì)宿主健康的作用、微生物組特性與宿主特性之間的關(guān)系，以及微生物組在疾病中的作用（Stulberget al.，2016）。采集糞便樣本避免了腸道內(nèi)取樣對(duì)動(dòng)物體可能造成的傷害，但在腸道微生物組研究中，有關(guān)糞便樣品是否能代表腸道內(nèi)容物用于腸道微生物組研究一直存在爭(zhēng)議（Ingalaet al.，2018；Yanet al.，2019）。近期，多國(guó)科研人員共同提出了糞便微生物組倡議（Sapountziset al.，2021），并歸納了使用糞便樣本進(jìn)行微生物組研究的優(yōu)勢(shì)：（1）能可靠地代表腸道末端的微生物群落；（2）不違背動(dòng)物福利及動(dòng)物倫理；（3）可能含有來(lái)自瘤胃和小腸的部分微生物，這對(duì)于瘤胃和小腸內(nèi)微生物的相關(guān)研究也具有意義；（4）新鮮的糞便還可以用于培養(yǎng)組學(xué)，分離可培養(yǎng)微生物；（5）可分離核苷酸或蛋白質(zhì)材料，用于組學(xué)測(cè)序、診斷性PCR 和其他分子和生化研究；（6）用于鑒定非消化飼料成分的化學(xué)分析；（7）可用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。

通常，絕大多數(shù)的胃腸道微生物是細(xì)菌，還有極少量的古菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物（Parkeret al.，2020）。針對(duì)微生物組的高通量測(cè)序方式常用的是：宏基因組、擴(kuò)增子、宏病毒組和宏轉(zhuǎn)錄組。其中擴(kuò)增子測(cè)序包含針對(duì)細(xì)菌和古菌的16S rRNA測(cè)序，針對(duì)真核生物的18S rRNA 測(cè)序和ITS 測(cè)序，部分常見(jiàn)的PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

表1 用于擴(kuò)增子檢測(cè)的PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers for amplicon sequencing

2.1 細(xì)菌研究

細(xì)菌占腸道微生物總量的90% 以上，有500~1 000 種（Kataoka，2016），被認(rèn)為是腸道微生態(tài)平衡的主導(dǎo)者。研究表明，人類腸道細(xì)菌的穩(wěn)態(tài)平衡與多種疾病，如炎癥性腸病、肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎、慢性心臟病、癌癥和自閉癥等有關(guān)（Zhanget al.，2015）。目前，糞便樣本在腸道細(xì)菌研究的應(yīng)用上已極為成熟，對(duì)于人、家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和野生動(dòng)物，基于擴(kuò)增子（16S rRNA）測(cè)序，可以分析群落多樣性，揭示細(xì)菌群落與宿主代謝、免疫的關(guān)聯(lián)；利用宏基因組測(cè)序，可以解析微生物組的基因功能分布等。對(duì)于野生動(dòng)物，糞便樣本不僅可以幫助了解腸道細(xì)菌群落組成（Huanget al.，2020；Ishida-Kurokiet al.，2020），也可以協(xié)助鑒定腸道細(xì)菌特有的功能基因（張呈波，2021）。此外，通過(guò)宏基因組測(cè)序還可挖掘野生動(dòng)物糞便細(xì)菌的功能基因，合成具有醫(yī)藥、食品等應(yīng)用潛力的生化制品。楊金茹等（2022）從西黑冠長(zhǎng)臂猿Nomascus concolor糞便宏基因組中篩選出的丙氨酸消旋酶基因，經(jīng)擴(kuò)增、重組及異源表達(dá)后，得到了穩(wěn)定性更好、催化活性更高的丙氨酸消旋酶；楊正鳳（2018）通過(guò)滇金絲猴Rhinopithecus bieti糞便微生物宏基因組，獲得了具有優(yōu)良工業(yè)特性的幾丁質(zhì)酶和β-半乳糖苷酶。

2.2 真菌研究

腸道真菌可能參與宿主的炎癥性腸炎等疾病，但腸道內(nèi)真菌群落的穩(wěn)定性不如細(xì)菌群落，容易受環(huán)境因素影響（Iliev & Cadwell，2021）。由于必須滿足能在37°C 下生長(zhǎng)的條件，目前檢測(cè)到能在腸道內(nèi)生長(zhǎng)和定植的真菌種類較少，主要是念珠菌屬Candida（假絲酵母屬）和雙足囊菌科Dipo?dascaceae（Hallen-Adams&Suhr，2017）。宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示，真菌只占人類腸道微生物的0.01%（Nashet al.，2017）。盡管真菌群落的穩(wěn)定性較差，但Hoffmann等（2013）對(duì)96份糞便樣本進(jìn)行擴(kuò)增子（ITS 區(qū)）檢測(cè)，人類微生物組計(jì)劃通過(guò)對(duì)317 份糞便樣本的ITS區(qū)和18S rRNA基因測(cè)序（Behret al.，2018），Sun 等（2021）通過(guò)宏基因組測(cè)序?qū)θ∽灾袊?guó)不同地域的6個(gè)民族（傣族、哈尼族、藏族、白族、苗族和漢族）的942 份糞便樣本測(cè)序，發(fā)現(xiàn)酵母菌屬Saccharomyces和念珠菌屬的含量最高；其中，Sun 等（2021）還進(jìn)一步確定城市化對(duì)真菌群落影響最大，會(huì)顯著降低真菌豐富度。在動(dòng)物腸道真菌群落研究中，通過(guò)ITS 區(qū)測(cè)序技術(shù)，糞便樣本被用于評(píng)估仔豬斷奶后胃腸道中真菌定植的波動(dòng)情況，用以干預(yù)斷奶過(guò)渡期仔豬的健康和生長(zhǎng)狀況（Arfkenet al.，2020）。蘇日娜等（2022）比較了原麝Moschus moschiferus和 林麝Moschus berezovskii腸 道真菌菌群結(jié)構(gòu)特性及季節(jié)因素對(duì)真菌菌群多樣性的影響。

2.3 古菌研究

基于廣泛使用的多相分類法（Vandammeet al.，1996），古菌不等同于細(xì)菌，被歸類為一個(gè)單獨(dú)的原核生物類群。盡管16S rRNA 基因序列有過(guò)于保守導(dǎo)致序列同源性過(guò)高的缺點(diǎn)，但目前依舊被認(rèn)為是推斷原核生物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最重要的“標(biāo)準(zhǔn)”（Schleifer，2009）。相較于細(xì)菌和真菌，古菌有獨(dú)特的遺傳、生化和細(xì)胞特征。與細(xì)菌相比，古菌與真核生物有更多共同之處，包括基因組結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制等（Doolittle&Logsdon，1998）。大多數(shù)的古菌門(mén)存在于海洋、火山等環(huán)境中，對(duì)生物地化循環(huán)起著至關(guān)重要的作用（Bakeret al.，2020）。人或動(dòng)物腸道中定植的古菌屬僅有少數(shù)幾種：甲烷短 桿 菌 屬M(fèi)ethanobrevibacter、Methanomethylophi?lus屬 、Methanomassiliicoccus屬 、甲 烷 球 形 菌 屬M(fèi)ethanosphaera、甲烷粒菌屬M(fèi)ethanocorpusculum、甲烷桿菌屬M(fèi)ethanobacterium、嗜鹽古菌屬Haloferax和鹽紅菌屬Halorubrum（Chibaniet al.，2022）等。其中，廣古菌門(mén)Euryarchaeota 包含廣泛分布的產(chǎn)甲烷菌，也是研究最廣泛的古菌門(mén)。盡管在豬的腸道中還存在少量其他古菌屬，但豐度最高的也是與產(chǎn)甲烷相關(guān)的菌屬（Denget al.，2021）。此外，人類腸道中的古菌含量變化與宿主的代謝、免疫有關(guān)，比如兒童哮喘、腸道功能紊亂、肥胖、結(jié)直腸癌等（Triantafyllouet al.，2014；Barnettet al.，2019；Cokeret al.，2020）。目前，對(duì)人或野生動(dòng)物腸道古菌的研究，常通過(guò)采集糞便樣本進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序分析，如對(duì)大熊貓Ailuropoda mela?noleuca、林麝糞便古菌結(jié)構(gòu)組成的研究（徐誼英，2015）；而經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（牛等）的糞便樣本也可用于表征腸道古菌群落（Cendronet al.，2020）。

2.4 病毒研究

腸道病毒包括感染細(xì)菌的噬菌體和感染真核細(xì)胞的病毒，它們與細(xì)菌和腸道上皮細(xì)胞的相互作用可以激活宿主的保護(hù)性免疫途徑（Iliev &Cadwell，2021）。腸道病毒檢測(cè)的常規(guī)方法是有針對(duì)性地設(shè)計(jì)病毒相關(guān)引物或探針，對(duì)糞便或肛拭子中提取的病毒核酸進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，成本低且靈敏度高，是目前通過(guò)人或動(dòng)物糞便檢測(cè)諾如病毒（錢(qián)明明等，2015）、豬δ 冠狀病毒（肖帥，2018）、新型冠狀病毒（吳冰珊等，2020）等單一病毒的常規(guī)方法。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，了解腸道病毒的手段也發(fā)生了革命性進(jìn)步，利用宏病毒組，也稱為病毒宏基因組，不僅可以檢測(cè)樣本中所有病毒的遺傳物質(zhì)、確定病毒組成，還可以進(jìn)行病毒溯源（Rosario&Breitbart，2011）。對(duì)糞便樣本進(jìn)行宏病毒組測(cè)序已經(jīng)是了解野生動(dòng)物糞便病毒群落結(jié)構(gòu)和發(fā)現(xiàn)新病毒不可或缺的工具。古文鵬和代解杰（2019）探索樹(shù)鼩Tupaia belangeris腸道病毒的群落結(jié)構(gòu)和分布特征、文隴英等（2022）評(píng)估四川邛海濕地公園9種鳥(niǎo)類的病毒多樣性等。

2.5 寄生蟲(chóng)調(diào)查

人畜共患寄生蟲(chóng)會(huì)對(duì)人、野生動(dòng)物和家畜的生產(chǎn)生活造成了極大的負(fù)面影響。由于大部分寄生蟲(chóng)的蟲(chóng)卵、卵囊或幼蟲(chóng)可以隨宿主糞便排出，檢查糞便可以確定寄生蟲(chóng)感染的情況（谷玉，道力高，1999）。使用涂片、沉淀、漂浮和培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢查方法，無(wú)法獲得寄生蟲(chóng)的分子遺傳信息，也不適用于處理較大的樣本量。野生動(dòng)物中常見(jiàn)的人畜共患寄生蟲(chóng)主要分為原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)（線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)和吸蟲(chóng)）（車(chē)麗美等，1996）。以常見(jiàn)的人畜共患隱孢子蟲(chóng)Cryptosporidiumspp.、畢氏腸微孢子蟲(chóng)Enterocyto?zoon bieneusi和十二指腸賈第蟲(chóng)Giardia duodenalis為例，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物（針對(duì)小亞基rRNA）進(jìn)行巢式PCR 可以檢測(cè)出來(lái)。Zhang 等（2019）利用該方法對(duì)青藏高原地區(qū)放牧的牦牛、藏綿羊和駱駝等動(dòng)物的糞便樣本分析了上述3 種寄生蟲(chóng)的流行病學(xué)情況。多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查可發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物中常常出現(xiàn)寄生蟲(chóng)混合感染的情況（陳小麗，2013；李東方等，2018；李瑞琪等，2020），而擴(kuò)增子等高通量測(cè)序技術(shù)可以靈敏、高效且全面地檢測(cè)動(dòng)物是否感染寄生蟲(chóng)和寄生蟲(chóng)的感染種類及亞型。在目前使用ITS區(qū)檢測(cè)寄生蟲(chóng)的測(cè)序中，18S rRNA 基因的V4 和V9 區(qū)是最常用的目的序列（Hadziavdicet al.，2014）。對(duì)云南獨(dú)龍牛Bos frontalis糞便樣本寄生蟲(chóng)調(diào)查（岳鳳嬌，2021）、野生大鼠糞便蠕蟲(chóng)多樣性評(píng)估（Tanakaet al.，2014）。由于ITS 區(qū)和大亞基rRNA（28S rRNA 等）的多樣性高于18S rRNA，ITS 區(qū)和28S rRNA 基因也可被用于擴(kuò)增子測(cè)序（Kounosuet al.，2019）。

3 生物標(biāo)記物

生物標(biāo)記物可應(yīng)用于疾病診斷、疾病分期和分類，預(yù)后指標(biāo)、干預(yù)措施的臨床反應(yīng)預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)；還可用于臨床轉(zhuǎn)化研究，加快藥物的研發(fā)進(jìn)程（Group BDW，2001）。常利用PCR、熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、擴(kuò)增子或宏基因組、代謝組和蛋白質(zhì)組等技術(shù)篩選和鑒定生物標(biāo)記物。

由于腸道微生態(tài)平衡與宿主的健康息息相關(guān)，當(dāng)宿主的健康狀況發(fā)生改變時(shí)，腸道內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)會(huì)嚴(yán)重失衡，其中豐度發(fā)生顯著變化的微生物，可能是與此類疾病密切相關(guān)的微生物標(biāo)記物。王小琪等（2022）基于16S rRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出了12 個(gè)與柴達(dá)木馬腹瀉相關(guān)的糞便微生物標(biāo)記物。此外，還有中性粒細(xì)胞釋放的乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白、腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸等，都可以通過(guò)宿主的體循環(huán)隨糞便排出，當(dāng)宿主出現(xiàn)炎癥時(shí)，其含量會(huì)發(fā)生極大變化，此類代謝物也可以作為相關(guān)疾病的生物標(biāo)記物。目前已有多種糞便微生物和代謝物被確定為疾病相關(guān)的標(biāo)記物（表2），成為診斷或治療疾病的潛在靶點(diǎn)。

表2 疾病相關(guān)的部分糞便生物標(biāo)記物Table 2 Disease-related fecal biomarkers

在一定區(qū)域內(nèi)，糞便微生物群落結(jié)構(gòu)組成具有宿主的特異性（Erenet al.，2015）。檢測(cè)環(huán)境中具宿主特異性的糞便微生物，可以追溯污染物來(lái)源，因此，此類糞便微生物可以被認(rèn)定為污染溯源標(biāo)記物。糞便樣本中不僅含有微生物及其食用的動(dòng)植物的遺傳物質(zhì)，還存在宿主脫落的腸道細(xì)胞。線粒體基因進(jìn)化速率高、特異性較高（Brownet al.，1979），因此，糞便中宿主的mtDNA 也常作為標(biāo)記物被用于動(dòng)物物種鑒定及追溯污染物來(lái)源的宿主標(biāo)記物，部分經(jīng)典標(biāo)記物如表3所示。目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)任何一種標(biāo)記具有絕對(duì)的宿主特異性，且一個(gè)標(biāo)記物很難同時(shí)具有高敏感性和高特異性（Zhanget al.，2020）。

表3 部分糞便溯源標(biāo)記物Table 3 Fecal markers for source tracking

4 宿主群體遺傳評(píng)估

基于糞便樣本中宿主的遺傳信息，可以對(duì)研究動(dòng)物進(jìn)行群體遺傳學(xué)方向的研究，遺傳多樣性、種群分化、種群遺傳結(jié)構(gòu)、環(huán)境異質(zhì)性影響、種群動(dòng)態(tài)和基因流等，進(jìn)而對(duì)動(dòng)物及其生境進(jìn)行管理和保護(hù)（Yamazakiet al.，2011；周蕓蕓等，2014；Ntieet al.，2017；Baaset al.，2018）。

由于糞便含有宿主的遺傳物質(zhì)，基于糞便樣本可以對(duì)宿主進(jìn)行性別鑒定、物種鑒定、微衛(wèi)星（simple sequence repeat，SSR）分型或單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型、種群遺傳多樣性評(píng)估等群體遺傳學(xué)研究。與性別決定相關(guān)的基因有SRY、SOX3、NR5A1和WT?1等，其中的SRY位于Y染色體上，是使用最為廣泛的性別鑒定基因（Guneset al.，2016）。SSR 和SNP 是人們?cè)诜N群評(píng)估中使用較多的2種技術(shù)，都有其自身的優(yōu)勢(shì)和局限性。SSR 篩選位點(diǎn)的費(fèi)用、所需DNA 質(zhì)量、操作要求和評(píng)估需要的位點(diǎn)數(shù)量更低，而SNP由于通量更高，更為高效（Grover&Sharma，2016）。在國(guó)內(nèi)，用于評(píng)估大熊貓遺傳多樣性的整個(gè)SSR體系已發(fā)展得非常成熟并一直被優(yōu)化（寇潔等，2022）。由于糞便中的宿主DNA 通常是碎片化的，直接從糞便中提取遺傳物質(zhì)往往只適用于基因片段的研究，但隨著DNA 富集技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了從糞便樣品中高效捕獲宿主基因組DNA 及宿主全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（王李玲等，2021），可以在動(dòng)物的保護(hù)基因組學(xué)等方向上進(jìn)行深入研究（Fuentes-Pardo& Ruzzante，2017；Orkinet al.，2021）。王李玲等（2021）對(duì)富集糞便中宿主DNA 的方法（雜交捕獲法和甲基化CpG 島富集法）進(jìn)行了深入分析和比較，甲基化CpG 島富集法近幾年才出現(xiàn)，穩(wěn)定且成本低，富集效率與樣品CpG 甲基化程度成正比。Chiou 和 Bergey（2018）利用Papio屬狒狒的糞便樣本對(duì)改進(jìn)的甲基化CpG 島富集法進(jìn)行了驗(yàn)證。目前，此方法應(yīng)用最多。Tyagi 等（2022）通過(guò)該方法從糞便樣本中獲得了叢林貓F(tuán)elis chaus的全基因組SNP 數(shù)據(jù)。Taylor 等（2022）研究稱，可以不進(jìn)行宿主基因組DNA 捕獲，直接從糞便的粘膜層中提取DNA 測(cè)序，進(jìn)而獲得了馴鹿Rangifer tarandus的全基因組數(shù)據(jù)。

5 總結(jié)和展望

糞便樣本可提取的分子遺傳信息較多，是非常便利的無(wú)損傷取樣獲得的樣本，適用于野生動(dòng)物、放牧動(dòng)物、家養(yǎng)動(dòng)物，甚至人類的研究，且各種測(cè)序技術(shù)和組學(xué)技術(shù)的發(fā)展也降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率。但是，糞便樣本的使用也存在許多限制，比如糞便新鮮程度、保存時(shí)間及溫度、環(huán)境污染等，都可能影響糞便中易揮發(fā)的代謝物以及核酸的降解，降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率。此外，DNA 提取方法、標(biāo)記位點(diǎn)、測(cè)序方法及深度、分析方法等不同也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大差異（田新民，張明海，2008；單磊等，2018）。因此，盡量使用無(wú)菌器具收集新鮮糞便，是提高結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)。研究人員已經(jīng)對(duì)糞便樣本保存、DNA 提取、PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)技術(shù)持續(xù)進(jìn)行優(yōu)化，比如糞便樣本保存液的研發(fā)，DNA 提取方法、基因分型技術(shù)體系的優(yōu)化，一代測(cè)序與二代測(cè)序結(jié)合檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析方法改進(jìn)等。相信隨著實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)方法的完善，對(duì)糞便樣本遺傳信息的提取將更為全面。