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        動(dòng)物糞便中分子遺傳信息的應(yīng)用

        2022-11-28 08:36:00王小琪段子淵
        四川動(dòng)物 2022年6期
        關(guān)鍵詞:研究

        王小琪,段子淵

        (中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所,北京100101)

        非損傷性取樣(非侵入式)是在不傷害動(dòng)物的前提下,采集動(dòng)物的糞便、尿液、毛發(fā)或含有口腔脫落細(xì)胞的食物殘?jiān)瓤赡芎羞z傳信息的樣本(周璨林等,2015)。相比于傷害性取樣,非損傷性取樣方法更加簡(jiǎn)單方便,對(duì)動(dòng)物機(jī)體沒(méi)有傷害。在動(dòng)物研究中,尤其是在野生動(dòng)物的研究中使用較為廣泛。其中,糞便樣本因其易獲得、識(shí)別性高和含有多元遺傳信息的優(yōu)點(diǎn),極大地促進(jìn)了動(dòng)物學(xué)的相關(guān)研究(單磊等,2018),并由此誕生了一門(mén)新的學(xué)科:分子糞便學(xué)。目前,糞便是應(yīng)用最廣泛的非損傷性樣本,利用糞便樣本可對(duì)動(dòng)物開(kāi)展食性分析、腸道微生態(tài)研究、標(biāo)記物篩選、種群遺傳多樣性分析等多方面的深入研究。尤其是近20年來(lái),二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn),標(biāo)志著測(cè)序正式進(jìn)入到高通量時(shí)代,為遺傳信息的發(fā)掘提供了大量、高效且可靠的數(shù)據(jù),快速推動(dòng)了各類組學(xué)的發(fā)展。糞便在動(dòng)物研究中的傳統(tǒng)應(yīng)用方式已被多次報(bào)道(劉丙萬(wàn),蔣志剛,2002;周璨林等,2015),本文就目前利用測(cè)序技術(shù)提取糞便樣本中分子遺傳信息的研究予以簡(jiǎn)要概述。

        1 食性研究

        動(dòng)物的食性研究是了解動(dòng)物與環(huán)境相互關(guān)系的前提。然而對(duì)于野生動(dòng)物或放牧家畜來(lái)說(shuō),食物是不可控的,不了解它們吃了什么,就無(wú)法進(jìn)一步研究其活動(dòng)范圍、飲食結(jié)構(gòu)及營(yíng)養(yǎng)代謝。除了對(duì)糞便樣本的視覺(jué)觀察,從20世紀(jì)80年代起,基于DNA的鑒定方法出現(xiàn),到21世紀(jì)初期,DNA條形碼正式出現(xiàn)并被標(biāo)準(zhǔn)化(Hebertet al.,2003)。DNA條形碼是一個(gè)特定的短序列DNA 片段,具有物種特異性,可以被用來(lái)準(zhǔn)確快速地識(shí)別物種。但尚未有適用于所有物種的通用條形碼,為了獲得更高的覆蓋度和準(zhǔn)確率,通常組合使用DNA 條形碼,這些組合條形碼主要來(lái)自以下基因片段:動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ基因,植物核糖體大亞基的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因,葉綠體成熟酶K 基因,葉綠體trnL 內(nèi)含子區(qū)和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Group CPW,2009;Valentiniet al.,2009;Taberletet al.,2012;張瑞瑩,2013)等。DNA宏條形碼是隨著二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展而誕生的用于檢測(cè)混合樣本的條形碼技術(shù),可以快速、大規(guī)模地鑒定糞便樣本中的DNA,確定食物范圍、種類和成分。由于動(dòng)物有肉食性、草食性和雜食性,所以需要對(duì)被檢動(dòng)物的飲食情況有所了解,才能夠選擇合適的引物用于DNA宏條形碼檢測(cè);同時(shí),還需要采集當(dāng)?shù)氐闹参锘騽?dòng)物樣本,建立適用于當(dāng)?shù)氐腄NA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù),用于比對(duì)測(cè)序得到的宏條形碼(劉剛等,2018)。

        2 腸道微生態(tài)研究

        胃腸道微生物數(shù)量眾多,與宿主共同進(jìn)化,保持動(dòng)態(tài)平衡有助于維持宿主腸道健康(Relman,2012),也對(duì)宿主的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控起重要作用(B?ckhedet al.,2004;Kataoka,2016)。當(dāng)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到干擾時(shí),胃腸道和其他器官(大腦、肝臟等)的功能會(huì)受到損害。探索腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和功能,有助于了解微生物組對(duì)宿主健康的作用、微生物組特性與宿主特性之間的關(guān)系,以及微生物組在疾病中的作用(Stulberget al.,2016)。采集糞便樣本避免了腸道內(nèi)取樣對(duì)動(dòng)物體可能造成的傷害,但在腸道微生物組研究中,有關(guān)糞便樣品是否能代表腸道內(nèi)容物用于腸道微生物組研究一直存在爭(zhēng)議(Ingalaet al.,2018;Yanet al.,2019)。近期,多國(guó)科研人員共同提出了糞便微生物組倡議(Sapountziset al.,2021),并歸納了使用糞便樣本進(jìn)行微生物組研究的優(yōu)勢(shì):(1)能可靠地代表腸道末端的微生物群落;(2)不違背動(dòng)物福利及動(dòng)物倫理;(3)可能含有來(lái)自瘤胃和小腸的部分微生物,這對(duì)于瘤胃和小腸內(nèi)微生物的相關(guān)研究也具有意義;(4)新鮮的糞便還可以用于培養(yǎng)組學(xué),分離可培養(yǎng)微生物;(5)可分離核苷酸或蛋白質(zhì)材料,用于組學(xué)測(cè)序、診斷性PCR 和其他分子和生化研究;(6)用于鑒定非消化飼料成分的化學(xué)分析;(7)可用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。

        通常,絕大多數(shù)的胃腸道微生物是細(xì)菌,還有極少量的古菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物(Parkeret al.,2020)。針對(duì)微生物組的高通量測(cè)序方式常用的是:宏基因組、擴(kuò)增子、宏病毒組和宏轉(zhuǎn)錄組。其中擴(kuò)增子測(cè)序包含針對(duì)細(xì)菌和古菌的16S rRNA測(cè)序,針對(duì)真核生物的18S rRNA 測(cè)序和ITS 測(cè)序,部分常見(jiàn)的PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

        表1 用于擴(kuò)增子檢測(cè)的PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers for amplicon sequencing

        2.1 細(xì)菌研究

        細(xì)菌占腸道微生物總量的90% 以上,有500~1 000 種(Kataoka,2016),被認(rèn)為是腸道微生態(tài)平衡的主導(dǎo)者。研究表明,人類腸道細(xì)菌的穩(wěn)態(tài)平衡與多種疾病,如炎癥性腸病、肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎、慢性心臟病、癌癥和自閉癥等有關(guān)(Zhanget al.,2015)。目前,糞便樣本在腸道細(xì)菌研究的應(yīng)用上已極為成熟,對(duì)于人、家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和野生動(dòng)物,基于擴(kuò)增子(16S rRNA)測(cè)序,可以分析群落多樣性,揭示細(xì)菌群落與宿主代謝、免疫的關(guān)聯(lián);利用宏基因組測(cè)序,可以解析微生物組的基因功能分布等。對(duì)于野生動(dòng)物,糞便樣本不僅可以幫助了解腸道細(xì)菌群落組成(Huanget al.,2020;Ishida-Kurokiet al.,2020),也可以協(xié)助鑒定腸道細(xì)菌特有的功能基因(張呈波,2021)。此外,通過(guò)宏基因組測(cè)序還可挖掘野生動(dòng)物糞便細(xì)菌的功能基因,合成具有醫(yī)藥、食品等應(yīng)用潛力的生化制品。楊金茹等(2022)從西黑冠長(zhǎng)臂猿Nomascus concolor糞便宏基因組中篩選出的丙氨酸消旋酶基因,經(jīng)擴(kuò)增、重組及異源表達(dá)后,得到了穩(wěn)定性更好、催化活性更高的丙氨酸消旋酶;楊正鳳(2018)通過(guò)滇金絲猴Rhinopithecus bieti糞便微生物宏基因組,獲得了具有優(yōu)良工業(yè)特性的幾丁質(zhì)酶和β-半乳糖苷酶。

        2.2 真菌研究

        腸道真菌可能參與宿主的炎癥性腸炎等疾病,但腸道內(nèi)真菌群落的穩(wěn)定性不如細(xì)菌群落,容易受環(huán)境因素影響(Iliev & Cadwell,2021)。由于必須滿足能在37°C 下生長(zhǎng)的條件,目前檢測(cè)到能在腸道內(nèi)生長(zhǎng)和定植的真菌種類較少,主要是念珠菌屬Candida(假絲酵母屬)和雙足囊菌科Dipo?dascaceae(Hallen-Adams&Suhr,2017)。宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示,真菌只占人類腸道微生物的0.01%(Nashet al.,2017)。盡管真菌群落的穩(wěn)定性較差,但Hoffmann等(2013)對(duì)96份糞便樣本進(jìn)行擴(kuò)增子(ITS 區(qū))檢測(cè),人類微生物組計(jì)劃通過(guò)對(duì)317 份糞便樣本的ITS區(qū)和18S rRNA基因測(cè)序(Behret al.,2018),Sun 等(2021)通過(guò)宏基因組測(cè)序?qū)θ∽灾袊?guó)不同地域的6個(gè)民族(傣族、哈尼族、藏族、白族、苗族和漢族)的942 份糞便樣本測(cè)序,發(fā)現(xiàn)酵母菌屬Saccharomyces和念珠菌屬的含量最高;其中,Sun 等(2021)還進(jìn)一步確定城市化對(duì)真菌群落影響最大,會(huì)顯著降低真菌豐富度。在動(dòng)物腸道真菌群落研究中,通過(guò)ITS 區(qū)測(cè)序技術(shù),糞便樣本被用于評(píng)估仔豬斷奶后胃腸道中真菌定植的波動(dòng)情況,用以干預(yù)斷奶過(guò)渡期仔豬的健康和生長(zhǎng)狀況(Arfkenet al.,2020)。蘇日娜等(2022)比較了原麝Moschus moschiferus和 林麝Moschus berezovskii腸 道真菌菌群結(jié)構(gòu)特性及季節(jié)因素對(duì)真菌菌群多樣性的影響。

        2.3 古菌研究

        基于廣泛使用的多相分類法(Vandammeet al.,1996),古菌不等同于細(xì)菌,被歸類為一個(gè)單獨(dú)的原核生物類群。盡管16S rRNA 基因序列有過(guò)于保守導(dǎo)致序列同源性過(guò)高的缺點(diǎn),但目前依舊被認(rèn)為是推斷原核生物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最重要的“標(biāo)準(zhǔn)”(Schleifer,2009)。相較于細(xì)菌和真菌,古菌有獨(dú)特的遺傳、生化和細(xì)胞特征。與細(xì)菌相比,古菌與真核生物有更多共同之處,包括基因組結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制等(Doolittle&Logsdon,1998)。大多數(shù)的古菌門(mén)存在于海洋、火山等環(huán)境中,對(duì)生物地化循環(huán)起著至關(guān)重要的作用(Bakeret al.,2020)。人或動(dòng)物腸道中定植的古菌屬僅有少數(shù)幾種:甲烷短 桿 菌 屬M(fèi)ethanobrevibacter、Methanomethylophi?lus屬 、Methanomassiliicoccus屬 、甲 烷 球 形 菌 屬M(fèi)ethanosphaera、甲烷粒菌屬M(fèi)ethanocorpusculum、甲烷桿菌屬M(fèi)ethanobacterium、嗜鹽古菌屬Haloferax和鹽紅菌屬Halorubrum(Chibaniet al.,2022)等。其中,廣古菌門(mén)Euryarchaeota 包含廣泛分布的產(chǎn)甲烷菌,也是研究最廣泛的古菌門(mén)。盡管在豬的腸道中還存在少量其他古菌屬,但豐度最高的也是與產(chǎn)甲烷相關(guān)的菌屬(Denget al.,2021)。此外,人類腸道中的古菌含量變化與宿主的代謝、免疫有關(guān),比如兒童哮喘、腸道功能紊亂、肥胖、結(jié)直腸癌等(Triantafyllouet al.,2014;Barnettet al.,2019;Cokeret al.,2020)。目前,對(duì)人或野生動(dòng)物腸道古菌的研究,常通過(guò)采集糞便樣本進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序分析,如對(duì)大熊貓Ailuropoda mela?noleuca、林麝糞便古菌結(jié)構(gòu)組成的研究(徐誼英,2015);而經(jīng)濟(jì)動(dòng)物(牛等)的糞便樣本也可用于表征腸道古菌群落(Cendronet al.,2020)。

        2.4 病毒研究

        腸道病毒包括感染細(xì)菌的噬菌體和感染真核細(xì)胞的病毒,它們與細(xì)菌和腸道上皮細(xì)胞的相互作用可以激活宿主的保護(hù)性免疫途徑(Iliev &Cadwell,2021)。腸道病毒檢測(cè)的常規(guī)方法是有針對(duì)性地設(shè)計(jì)病毒相關(guān)引物或探針,對(duì)糞便或肛拭子中提取的病毒核酸進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè),成本低且靈敏度高,是目前通過(guò)人或動(dòng)物糞便檢測(cè)諾如病毒(錢(qián)明明等,2015)、豬δ 冠狀病毒(肖帥,2018)、新型冠狀病毒(吳冰珊等,2020)等單一病毒的常規(guī)方法。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,了解腸道病毒的手段也發(fā)生了革命性進(jìn)步,利用宏病毒組,也稱為病毒宏基因組,不僅可以檢測(cè)樣本中所有病毒的遺傳物質(zhì)、確定病毒組成,還可以進(jìn)行病毒溯源(Rosario&Breitbart,2011)。對(duì)糞便樣本進(jìn)行宏病毒組測(cè)序已經(jīng)是了解野生動(dòng)物糞便病毒群落結(jié)構(gòu)和發(fā)現(xiàn)新病毒不可或缺的工具。古文鵬和代解杰(2019)探索樹(shù)鼩Tupaia belangeris腸道病毒的群落結(jié)構(gòu)和分布特征、文隴英等(2022)評(píng)估四川邛海濕地公園9種鳥(niǎo)類的病毒多樣性等。

        2.5 寄生蟲(chóng)調(diào)查

        人畜共患寄生蟲(chóng)會(huì)對(duì)人、野生動(dòng)物和家畜的生產(chǎn)生活造成了極大的負(fù)面影響。由于大部分寄生蟲(chóng)的蟲(chóng)卵、卵囊或幼蟲(chóng)可以隨宿主糞便排出,檢查糞便可以確定寄生蟲(chóng)感染的情況(谷玉,道力高,1999)。使用涂片、沉淀、漂浮和培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢查方法,無(wú)法獲得寄生蟲(chóng)的分子遺傳信息,也不適用于處理較大的樣本量。野生動(dòng)物中常見(jiàn)的人畜共患寄生蟲(chóng)主要分為原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)(線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)和吸蟲(chóng))(車(chē)麗美等,1996)。以常見(jiàn)的人畜共患隱孢子蟲(chóng)Cryptosporidiumspp.、畢氏腸微孢子蟲(chóng)Enterocyto?zoon bieneusi和十二指腸賈第蟲(chóng)Giardia duodenalis為例,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物(針對(duì)小亞基rRNA)進(jìn)行巢式PCR 可以檢測(cè)出來(lái)。Zhang 等(2019)利用該方法對(duì)青藏高原地區(qū)放牧的牦牛、藏綿羊和駱駝等動(dòng)物的糞便樣本分析了上述3 種寄生蟲(chóng)的流行病學(xué)情況。多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查可發(fā)現(xiàn),動(dòng)物中常常出現(xiàn)寄生蟲(chóng)混合感染的情況(陳小麗,2013;李東方等,2018;李瑞琪等,2020),而擴(kuò)增子等高通量測(cè)序技術(shù)可以靈敏、高效且全面地檢測(cè)動(dòng)物是否感染寄生蟲(chóng)和寄生蟲(chóng)的感染種類及亞型。在目前使用ITS區(qū)檢測(cè)寄生蟲(chóng)的測(cè)序中,18S rRNA 基因的V4 和V9 區(qū)是最常用的目的序列(Hadziavdicet al.,2014)。對(duì)云南獨(dú)龍牛Bos frontalis糞便樣本寄生蟲(chóng)調(diào)查(岳鳳嬌,2021)、野生大鼠糞便蠕蟲(chóng)多樣性評(píng)估(Tanakaet al.,2014)。由于ITS 區(qū)和大亞基rRNA(28S rRNA 等)的多樣性高于18S rRNA,ITS 區(qū)和28S rRNA 基因也可被用于擴(kuò)增子測(cè)序(Kounosuet al.,2019)。

        3 生物標(biāo)記物

        生物標(biāo)記物可應(yīng)用于疾病診斷、疾病分期和分類,預(yù)后指標(biāo)、干預(yù)措施的臨床反應(yīng)預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè);還可用于臨床轉(zhuǎn)化研究,加快藥物的研發(fā)進(jìn)程(Group BDW,2001)。常利用PCR、熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、擴(kuò)增子或宏基因組、代謝組和蛋白質(zhì)組等技術(shù)篩選和鑒定生物標(biāo)記物。

        由于腸道微生態(tài)平衡與宿主的健康息息相關(guān),當(dāng)宿主的健康狀況發(fā)生改變時(shí),腸道內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)會(huì)嚴(yán)重失衡,其中豐度發(fā)生顯著變化的微生物,可能是與此類疾病密切相關(guān)的微生物標(biāo)記物。王小琪等(2022)基于16S rRNA 測(cè)序數(shù)據(jù),篩選出了12 個(gè)與柴達(dá)木馬腹瀉相關(guān)的糞便微生物標(biāo)記物。此外,還有中性粒細(xì)胞釋放的乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白、腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸等,都可以通過(guò)宿主的體循環(huán)隨糞便排出,當(dāng)宿主出現(xiàn)炎癥時(shí),其含量會(huì)發(fā)生極大變化,此類代謝物也可以作為相關(guān)疾病的生物標(biāo)記物。目前已有多種糞便微生物和代謝物被確定為疾病相關(guān)的標(biāo)記物(表2),成為診斷或治療疾病的潛在靶點(diǎn)。

        表2 疾病相關(guān)的部分糞便生物標(biāo)記物Table 2 Disease-related fecal biomarkers

        在一定區(qū)域內(nèi),糞便微生物群落結(jié)構(gòu)組成具有宿主的特異性(Erenet al.,2015)。檢測(cè)環(huán)境中具宿主特異性的糞便微生物,可以追溯污染物來(lái)源,因此,此類糞便微生物可以被認(rèn)定為污染溯源標(biāo)記物。糞便樣本中不僅含有微生物及其食用的動(dòng)植物的遺傳物質(zhì),還存在宿主脫落的腸道細(xì)胞。線粒體基因進(jìn)化速率高、特異性較高(Brownet al.,1979),因此,糞便中宿主的mtDNA 也常作為標(biāo)記物被用于動(dòng)物物種鑒定及追溯污染物來(lái)源的宿主標(biāo)記物,部分經(jīng)典標(biāo)記物如表3所示。目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)任何一種標(biāo)記具有絕對(duì)的宿主特異性,且一個(gè)標(biāo)記物很難同時(shí)具有高敏感性和高特異性(Zhanget al.,2020)。

        表3 部分糞便溯源標(biāo)記物Table 3 Fecal markers for source tracking

        4 宿主群體遺傳評(píng)估

        基于糞便樣本中宿主的遺傳信息,可以對(duì)研究動(dòng)物進(jìn)行群體遺傳學(xué)方向的研究,遺傳多樣性、種群分化、種群遺傳結(jié)構(gòu)、環(huán)境異質(zhì)性影響、種群動(dòng)態(tài)和基因流等,進(jìn)而對(duì)動(dòng)物及其生境進(jìn)行管理和保護(hù)(Yamazakiet al.,2011;周蕓蕓等,2014;Ntieet al.,2017;Baaset al.,2018)。

        由于糞便含有宿主的遺傳物質(zhì),基于糞便樣本可以對(duì)宿主進(jìn)行性別鑒定、物種鑒定、微衛(wèi)星(simple sequence repeat,SSR)分型或單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型、種群遺傳多樣性評(píng)估等群體遺傳學(xué)研究。與性別決定相關(guān)的基因有SRY、SOX3、NR5A1和WT?1等,其中的SRY位于Y染色體上,是使用最為廣泛的性別鑒定基因(Guneset al.,2016)。SSR 和SNP 是人們?cè)诜N群評(píng)估中使用較多的2種技術(shù),都有其自身的優(yōu)勢(shì)和局限性。SSR 篩選位點(diǎn)的費(fèi)用、所需DNA 質(zhì)量、操作要求和評(píng)估需要的位點(diǎn)數(shù)量更低,而SNP由于通量更高,更為高效(Grover&Sharma,2016)。在國(guó)內(nèi),用于評(píng)估大熊貓遺傳多樣性的整個(gè)SSR體系已發(fā)展得非常成熟并一直被優(yōu)化(寇潔等,2022)。由于糞便中的宿主DNA 通常是碎片化的,直接從糞便中提取遺傳物質(zhì)往往只適用于基因片段的研究,但隨著DNA 富集技術(shù)的發(fā)展,實(shí)現(xiàn)了從糞便樣品中高效捕獲宿主基因組DNA 及宿主全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)(王李玲等,2021),可以在動(dòng)物的保護(hù)基因組學(xué)等方向上進(jìn)行深入研究(Fuentes-Pardo& Ruzzante,2017;Orkinet al.,2021)。王李玲等(2021)對(duì)富集糞便中宿主DNA 的方法(雜交捕獲法和甲基化CpG 島富集法)進(jìn)行了深入分析和比較,甲基化CpG 島富集法近幾年才出現(xiàn),穩(wěn)定且成本低,富集效率與樣品CpG 甲基化程度成正比。Chiou 和 Bergey(2018)利用Papio屬狒狒的糞便樣本對(duì)改進(jìn)的甲基化CpG 島富集法進(jìn)行了驗(yàn)證。目前,此方法應(yīng)用最多。Tyagi 等(2022)通過(guò)該方法從糞便樣本中獲得了叢林貓F(tuán)elis chaus的全基因組SNP 數(shù)據(jù)。Taylor 等(2022)研究稱,可以不進(jìn)行宿主基因組DNA 捕獲,直接從糞便的粘膜層中提取DNA 測(cè)序,進(jìn)而獲得了馴鹿Rangifer tarandus的全基因組數(shù)據(jù)。

        5 總結(jié)和展望

        糞便樣本可提取的分子遺傳信息較多,是非常便利的無(wú)損傷取樣獲得的樣本,適用于野生動(dòng)物、放牧動(dòng)物、家養(yǎng)動(dòng)物,甚至人類的研究,且各種測(cè)序技術(shù)和組學(xué)技術(shù)的發(fā)展也降低了檢測(cè)成本,提高了檢測(cè)效率。但是,糞便樣本的使用也存在許多限制,比如糞便新鮮程度、保存時(shí)間及溫度、環(huán)境污染等,都可能影響糞便中易揮發(fā)的代謝物以及核酸的降解,降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率。此外,DNA 提取方法、標(biāo)記位點(diǎn)、測(cè)序方法及深度、分析方法等不同也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大差異(田新民,張明海,2008;單磊等,2018)。因此,盡量使用無(wú)菌器具收集新鮮糞便,是提高結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)。研究人員已經(jīng)對(duì)糞便樣本保存、DNA 提取、PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)技術(shù)持續(xù)進(jìn)行優(yōu)化,比如糞便樣本保存液的研發(fā),DNA 提取方法、基因分型技術(shù)體系的優(yōu)化,一代測(cè)序與二代測(cè)序結(jié)合檢測(cè),數(shù)據(jù)分析方法改進(jìn)等。相信隨著實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)方法的完善,對(duì)糞便樣本遺傳信息的提取將更為全面。

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