何海永， 羅蕓芳， 楊雨環(huán)， 王金鳳， 譚清群， 趙玳琳， 李繼業(yè)， 呂 紅， 趙詩(shī)燦

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 貴陽(yáng) 550009；2.貴州綠之源農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)有限公司， 貴陽(yáng) 550009；3.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴陽(yáng) 550025； 4.遵義師范學(xué)院， 貴州 遵義 563006)

玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.) Druce]是百合科、黃精屬植物，為根狀莖，近圓柱形，根莖長(zhǎng)且節(jié)多，故稱玉竹，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。是一種藥食兩用的中藥材，在多本醫(yī)書(shū)中均有記載，《本草綱目》中用于治療風(fēng)熱濕毒，《本草便讀》中記載其具有滋陰養(yǎng)肺的功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，玉竹還具有治療糖尿病、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等作用[1-5]；玉竹還可以做成藥膳茶飲，如玉竹茶、玉竹粥、玉竹銀耳湯等[6]。我國(guó)玉竹種質(zhì)資源非常豐富，市場(chǎng)上主要將玉竹分為栽培品種和野生品種，栽培品種有湘玉竹[7]、西玉竹、東玉竹和海門(mén)玉竹[8]4種，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴州各個(gè)地區(qū)均有大量野生玉竹資源分布。玉竹的化學(xué)成分主要為甾體皂苷、黃酮、多糖、揮發(fā)油、凝集素等[10-14]，其中多糖為主要的生物活性物質(zhì)，也是關(guān)注最多的方向之一。肖嵐等[2]在玉竹多糖對(duì)在體和離體肺癌腫瘤抑制作用中發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖具有顯著的抗腫瘤作用。單穎等[15]通過(guò)50只小鼠模型發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖可以通過(guò)提高超氧化物歧化酶活性來(lái)清除自由基，減輕機(jī)體的損傷以延緩衰老。季峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖可以提高血清胰島素水平，達(dá)到降血糖的效果；Yan等[17]通過(guò)老鼠模型發(fā)現(xiàn)玉竹多糖可以降低腸道菌群數(shù)從而減輕肥胖。姜曉坤等[18]探索并明確了玉竹多糖微波超聲提取法最佳提取條件；仇宏偉[19]對(duì)超聲波輔酶法提取玉竹多糖進(jìn)行優(yōu)化；陳銀霞[20]對(duì)玉竹水提取醇沉法探索和優(yōu)化；Yong[21]等對(duì)玉竹多糖堿提取法進(jìn)行探索和優(yōu)化。

在玉竹遺傳分析方面，主要采取分子標(biāo)記技術(shù)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)進(jìn)行分類[22]，潘清平等[23]探索發(fā)現(xiàn)，ISSR分子標(biāo)記法可用于玉竹的品種鑒定和優(yōu)良品種選育研究；周鈺等[24]研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星標(biāo)記在玉竹遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)中具有較高的潛在價(jià)值。路放[25]對(duì)8個(gè)不同品種的玉竹采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以從分子水平檢測(cè)出玉竹的差異，同時(shí)也證明不同產(chǎn)地玉竹具有較豐富的遺傳多樣性；郝久程等[26]研究發(fā)現(xiàn)，海島種群的遺傳多樣性高于大陸種群，說(shuō)明獨(dú)立環(huán)境下的遺傳變異現(xiàn)象比開(kāi)放環(huán)境下更為明顯；卜靜等[27]利用ISSR法對(duì)12個(gè)不同地區(qū)野生玉竹種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地玉竹有較高的遺傳多樣性，各產(chǎn)地個(gè)體差異較大可能與氣候環(huán)境相關(guān)；周曄等[28]用ISSR法鑒別中藥玉竹和小玉竹，為玉竹種質(zhì)資源的鑒定與區(qū)別奠定基礎(chǔ)。但關(guān)于貴州不同地區(qū)及周邊省份的野生玉竹地方資源多糖含量和遺傳多樣性研究相對(duì)較少。 本試驗(yàn)以來(lái)自貴州省不同地區(qū)的13個(gè)野生玉竹種質(zhì)資源和4個(gè)其他省份的玉竹種質(zhì)資源為材料，進(jìn)行不同玉竹種質(zhì)資源的多糖含量和群體遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究，以期為玉竹種質(zhì)資源的發(fā)掘、保護(hù)和利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

17個(gè)供試玉竹種質(zhì)資源中，有13個(gè)樣品來(lái)自貴州；2個(gè)來(lái)在四川??；1個(gè)來(lái)自湖北省；1個(gè)來(lái)自河南省，樣品具體來(lái)源詳見(jiàn)表1。2020年3月采集各地玉竹種質(zhì)資源的根莖，帶土進(jìn)行包裝，用冰袋保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，再去除樣品的須根、莖桿后，將根莖洗凈后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用，記錄采集地點(diǎn)。

表1 玉竹種質(zhì)資源的來(lái)源Table 1 Source of Polygonatum odoratum germplasm resources

試驗(yàn)材料包括植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱形)、2×TaqPCR Master Mix、核酸染料，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、6×Loading buffer(藍(lán)色)購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司、瓊脂糖(Agarose)和核酸提取液(24∶1)分別購(gòu)自BioWest和Solarbio公司、無(wú)水乙醇購(gòu)自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。

1.2 試驗(yàn)器材

試驗(yàn)器材包括TGrinder第三代變速組織研磨器套裝(天根生化科技(北京)有限公司)、thermo scientific/micro 17離心機(jī)(Denmark)、100-024 VAC PCR儀(新加坡BIO-RAD公司)、DYY-6 C型電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD(美國(guó)BIO-RAD公司)、XK-1200型手掌式醫(yī)用離心機(jī)(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)、RADWAG天平(上海精密儀器儀表有限公司)、立式壓力滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、制冰機(jī)IMS-30(常熟市圣海電器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(寧波江南儀器廠)、超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)、MiniT-H 2 C三聯(lián)多用途金屬浴(成都浩康科技有限公司)、電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1玉竹多糖含量檢測(cè)

將2020年3月保存?zhèn)溆玫挠裰窀o在恒溫干燥鼓風(fēng)箱內(nèi)60 ℃烘干3 d后送往遵義市精科信檢測(cè)有限公司，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年第四版規(guī)定的相關(guān)檢測(cè)方法，在溫度為15 ℃、濕度為45%的條件下，采用紫外-分光光度法進(jìn)行多糖含量的檢測(cè)。

1.3.2玉竹DNA提取

取玉竹新鮮組織約100 mg，加入液氮充分研磨，將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μL 65 ℃預(yù)熱緩沖液GP 1的離心管中(實(shí)驗(yàn)前在預(yù)熱的GP 1中加入巰基乙醇)，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65 ℃水浴鍋中水浴20 min，水浴過(guò)程中顛倒離心管數(shù)次以混合樣品；再加入700 μL氯仿，充分混勻，12 000 r/min離心5 min；將所得上層水相溶液轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加入700 μL緩沖液GP 2，充分混勻；將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB 3中，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液；向吸附柱CB 3中加入500 μL緩沖液GD(使用前先加入無(wú)水乙醇)，12 000 r/min離30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB 3放入收集管中；再向吸附柱CB 3中加入600 μL漂洗液PW(使用前先加入無(wú)水乙醇)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB 3放入收集管中(重復(fù)操作一次)；將吸附柱CB 3放回收集管中12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB 3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；將吸附柱CB 3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.3.3引物篩選

試驗(yàn)所用引物選用哥倫比亞大學(xué)公布的100條通用引物序列中的41條，由擎科生物公司合成。選用4個(gè)凝膠條帶清晰的DNA樣品對(duì)引物進(jìn)行篩選，共篩選出11條較清晰的引物(表2)。

表2 ISSR擴(kuò)增引物序列Table 2 ISSR amplification primer sequence

1.3.4ISSR-PCR擴(kuò)增

根據(jù)所選用的2×TaqPCR Master Mix確定PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，反應(yīng)體系為25 μL：mix 12.5 μL，模板1 μL，引物1 μL，雙蒸水10.5 μL。反應(yīng)程序的退火溫度根據(jù)引物的Tm值設(shè)定，94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，變性到延伸進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸7 min，最后4 ℃保持。

1.3.5凝膠電泳

取PCR產(chǎn)物與2.0%的瓊脂糖凝膠于120 V電泳85 min，制膠時(shí)加入TS-GelRed核酸凝膠染料用于對(duì)電泳條帶染色。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀在紫外條件觀察、拍照。

1.3.6ISSR分析

將有條帶出現(xiàn)的顯性位點(diǎn)用“1”表示，無(wú)條帶出現(xiàn)的隱形位點(diǎn)用“0”表示，建立“1”和“0”的數(shù)據(jù)矩陣，采用NTSYS 2.10聚類軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，再根據(jù)遺傳相似系數(shù)利用UPGMA法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源玉竹多糖含量

檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，17份玉竹多糖含量分別為9.33%、9.31%、9.18%、9.05%、8.37%、8.35%、8.33%、8.28%、7.74%、7.67%、6.43%、6.41%、6.38%、6.31%、6.25%、6.24%和6.12%。參試材料的多糖含量均高于《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部所規(guī)定的藥用玉竹多糖含量(不得低于6%)。玉竹多糖含量最高的是來(lái)自四川省瀘州市敘永縣的13號(hào)(9.33%)；最低的是來(lái)自貴州省遵義市湄潭縣茅坪鎮(zhèn)的15號(hào)(6.12%)。17份玉竹多糖含量平均值為7.63%，其中2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、13號(hào)和14號(hào)均高于平均值，表明這幾份玉竹種質(zhì)資源的品質(zhì)相對(duì)較好。

表3 不同玉竹種質(zhì)資源的多糖含量Table 3 Polysaccharide content of different germplasm resources of Polygonatum odoratum

對(duì)不同玉竹種質(zhì)資源多糖含量進(jìn)行Duncan新復(fù)極差分析，結(jié)果表明，在5%顯著水平下，不同玉竹種質(zhì)資源之間的多糖含量均呈顯著性差異。在1%顯著水平下，5號(hào)貴州遵義綏陽(yáng)玉竹和1號(hào)貴州畢節(jié)七星關(guān)玉竹，多糖含量相差不大，二者之間差異不顯著，其余各個(gè)品種差異顯著。

2.2 多態(tài)位點(diǎn)分析

將初篩的11條引物分別與17個(gè)樣品模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出條帶多且清晰的2條引物(表4)，將篩選出來(lái)的2條引物再次與17個(gè)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)篩選出的2個(gè)ISSR引物的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行85 min的電泳，并用凝膠電泳成像系統(tǒng)在紫外條件下觀察并拍照保存。如圖1所示，2條引物共擴(kuò)增出27組條帶，其中27組為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比例為100%，擴(kuò)增片段均在200～3 000 bp之間。同一引物對(duì)不同來(lái)源的玉竹樣品的擴(kuò)增條帶不完全相同，說(shuō)明這兩條引物能較好地反映17個(gè)樣品的多態(tài)性。

表4 ISSR引物擴(kuò)增條帶數(shù)Table 4 Number of bands amplified by ISSR primers

將引物單獨(dú)使用時(shí)，能將一些玉竹樣本與其他玉竹樣本區(qū)分開(kāi)，如圖1B所示，4號(hào)玉竹在1 200 bp處與其他玉竹有區(qū)別；8號(hào)玉竹在500 bp處與其他玉竹有區(qū)別。將擴(kuò)增出的條帶放在一起對(duì)比時(shí)，也能看出玉竹之間的相似和區(qū)別，如圖1 A，7號(hào)玉竹與5號(hào)、11號(hào)、12號(hào)在250 bp處都有條帶，與5號(hào)、6號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、15號(hào)、17號(hào)玉竹在500 bp處都有條帶，與1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、15號(hào)玉竹在1 200 bp處都有條帶，這些條帶顯示7號(hào)玉竹與其他玉竹在多態(tài)性上存在差異。同樣，在圖1 B中6號(hào)玉竹和7號(hào)玉竹在條帶的多態(tài)位點(diǎn)上相同，推測(cè)6號(hào)玉竹和7號(hào)玉竹的遺傳背景可能相同。

圖1 引物UBC 844(A)和引物UBC 845(B)電泳圖 Fig.1 The electrophoresis diagram of primer UBC 844(A), the electrophoresis diagram of primer UBC 845(B)

2.3 遺傳相似性分析

使用NTSYSps 2.10 e軟件對(duì)17份玉竹種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，在0.56至0.63處分為三大類。結(jié)果(圖2)表明，第Ⅰ類群含有10個(gè)品種，為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、13號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、17號(hào)，占總數(shù)的58.82%，7個(gè)品種來(lái)自貴州，其余3個(gè)分別來(lái)自四川和湖北。其中親緣性最近的1號(hào)和15號(hào)分別來(lái)自貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)、貴州省畢節(jié)市納雍縣；2號(hào)和13號(hào)分別來(lái)自四川省雅安市石棉縣、四川省瀘州市敘永縣；9號(hào)和17號(hào)分別來(lái)自貴州省畢節(jié)市大方縣、貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)。第Ⅱ類群含5個(gè)品種，為5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、14號(hào)，占總數(shù)的29.41%，均來(lái)自貴州。親緣性最近的11號(hào)、12號(hào)分別來(lái)自貴州省貴陽(yáng)市白云區(qū)和貴州省黔西南州興義市萬(wàn)峰林鎮(zhèn)。第Ⅲ類群只有1個(gè)品種為4號(hào)，占總數(shù)的5.88%，來(lái)自河南省洛陽(yáng)市蒿縣。

圖2 引物UBC 845系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig.2 The phylogenetic tree of primer UBC 845

用NTSYS 2.10軟件分析ISSR標(biāo)記的0，1數(shù)據(jù)矩陣，計(jì)算出17份玉竹的遺傳相似系數(shù)在0.163 8～0.923 0之間(表6)，平均遺傳相似系數(shù)為0.639 6，說(shuō)明17份玉竹之間存在遺傳分化。其中1號(hào)與15號(hào)，2號(hào)與13、15號(hào)，10號(hào)與17號(hào)，11號(hào)與12號(hào)，13號(hào)與16號(hào)，15號(hào)與16號(hào)遺傳相似系數(shù)最大為0.923 0，說(shuō)明親緣性最近。6號(hào)與8號(hào)的遺傳相似系數(shù)最小，為0.163 8，說(shuō)明親緣性最遠(yuǎn)。

表6 不同玉竹種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)Table 6 Genetic similarity coefficients of different Polygonatum odoratum germplasm resources

3 討論與結(jié)論

參試的17份玉竹的多糖含量范圍為6.12%～9.33%，玉竹多糖含量極差分析表明，不同來(lái)源的玉竹多糖含量之間絕大多數(shù)都存在顯著差異，其中在1%的顯著水平下只有1號(hào)和5號(hào)玉竹的多糖含量沒(méi)有顯著差異。不同的玉竹多糖提取方法所檢測(cè)的多糖含量不同，本次玉竹檢測(cè)所用方法為水提醇法，并非玉竹多糖提取最高效的方法；同一種方法對(duì)不同產(chǎn)地的玉竹的提取效率也不同。檢測(cè)結(jié)果表明，不同地區(qū)的玉竹多糖含量有所區(qū)別，貴州省畢節(jié)市大方縣的6號(hào)玉竹、四川省瀘州市敘永縣的13號(hào)玉竹、湖北省宜昌市五峰土家族自治縣的3號(hào)玉竹、河南省洛陽(yáng)市蒿縣的4號(hào)玉竹的多糖含量分別為9.31%、9.33%、8.28%、9.05%，具有明顯的差異。同一省份不同地區(qū)的玉竹多糖含量也有一定的差異，貴州省畢節(jié)市大方縣的6號(hào)玉竹、貴陽(yáng)市的12號(hào)玉竹、安順市的14號(hào)玉竹的多糖含量分別為9.31%、8.37%、9.18%，也具有顯著的差異。同一省份同一地區(qū)的玉竹多糖含量也有區(qū)別，貴州省畢節(jié)市大方縣的6號(hào)、8號(hào)和9號(hào)玉竹的多糖含量分別為9.31%、8.35%和6.41%，差異也同樣明顯。總之，來(lái)自不同省份、同一省份的不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同玉竹種質(zhì)資源之間的多糖含量都有顯著差異，這與劉玉鳳等[29]的研究結(jié)果相一致。

參試玉竹的平均遺傳相似系數(shù)為0.636 9，多態(tài)性條帶占比為100%，表明不同玉竹種質(zhì)資源具有較高的遺傳相似性，同時(shí)具有較豐富的遺傳多樣性。來(lái)自同一地區(qū)的玉竹大多數(shù)會(huì)聚為一類，1號(hào)與15號(hào)、10號(hào)與17號(hào)、11號(hào)與12號(hào)、15號(hào)與16號(hào)都來(lái)自貴州省、2號(hào)和13來(lái)自四川省，其遺傳相似系數(shù)均為0.923 0，親緣性最近。但也有例外，四川省13號(hào)與貴州省的16號(hào)，遺傳相似系數(shù)為0.923 0，親緣性也為最近。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將玉竹種質(zhì)資源在遺傳相似系數(shù)0.56處分為三類，除了第Ⅰ類群中的有省份混雜外，其余兩類都是來(lái)在同一省份。就系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)而言，親緣性最近的都是來(lái)自同一省份的玉竹種質(zhì)資源。這與卜靜等[27]在不同產(chǎn)地野生玉竹種質(zhì)資源多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析中所得的結(jié)果相似。因此，玉竹的遺傳親緣性與生長(zhǎng)地區(qū)之間有一定的相關(guān)性，也可能與人類活動(dòng)導(dǎo)致玉竹種質(zhì)資源的遷移有一定的關(guān)系。