饒澤華，吳雪芬，馬逸杰，廖意娟，宋家薇，易麗貞，劉欣，岳增輝

湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，AS斑塊破裂形成血栓是引發(fā)急性心血管事件的重要原因。斑塊易損性是血栓形成的決定因素。AS易損斑塊的特點是豐富的脂質(zhì)核心，浸潤明顯的巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞或炎癥細(xì)胞，尤其巨噬細(xì)胞可通過吞噬或分泌作用，產(chǎn)生纖溶蛋白酶原激活物及基質(zhì)金屬蛋白酶等降解細(xì)胞外基質(zhì)，致纖維帽變薄[1-2]。研究AS斑塊不穩(wěn)定因素，盡早識別易損斑塊并有效干預(yù)，促使其向穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)變，是預(yù)防心血管事件發(fā)生的重要策略。巨噬細(xì)胞是AS斑塊中最主要的細(xì)胞，在AS病變早期，巨噬細(xì)胞凋亡可抑制炎癥反應(yīng)，但在AS病變后期，其凋亡會加速壞死核形成，破壞AS斑塊穩(wěn)定性，這與巨噬細(xì)胞自噬水平密切相關(guān)[3]。因此，調(diào)節(jié)易損斑塊中細(xì)胞自噬水平對穩(wěn)定AS易損斑塊具有重要作用。Beclin1是自噬起始階段的重要調(diào)節(jié)蛋白，與自噬水平呈正相關(guān)。LC3是自噬體的特異性蛋白，當(dāng)自噬發(fā)生時，胞質(zhì)型LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化成LC3Ⅱ并附著在自噬體膜上，參與自噬底物的降解。他汀類藥物能夠穩(wěn)定易損斑塊，但長期應(yīng)用可引起肝功能不全及肌痛等不良反應(yīng)，使其應(yīng)用受到限制[4]。

隔藥餅灸是結(jié)合艾灸、藥物和腧穴三者共同作用的中醫(yī)外治療法。研究表明，隔藥餅灸可調(diào)節(jié)AS兔血脂水平，抑制AS進(jìn)展[5-7]，但其能否通過調(diào)節(jié)自噬穩(wěn)定AS易損斑塊目前尚不清楚。因此，本研究以隔藥餅灸為干預(yù)手段，觀察其對AS易損斑塊兔Beclin1、LC3蛋白表達(dá)的影響，探討隔藥餅灸穩(wěn)定AS易損斑塊的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性新西蘭大耳白兔58只，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，湖南太平生物科技有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2020-0005。單籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，室溫25 ℃、濕度50%～70%環(huán)境，12 h明暗交替。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批（LL2019081905）。高脂飼料，湖南嘉泰實驗動物有限公司提供，含83.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、5%豬油和0.2%丙基硫氧嘧啶。

1.2 藥物及制備

丹參、郁金、山楂、澤瀉、大黃藥粉，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，按等比例取上述藥粉3～5 g，以醋調(diào)成糊狀，制成厚3 mm、直徑1 cm的藥餅。阿托伐他汀鈣片，美國輝瑞公司，批號1237304。

1.3 主要試劑與儀器

艾炷（南陽昊翔藥業(yè)有限公司，5 mm×10 mm）；斑點蝰蛇毒（廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所制備）；Ad5-p53重組載體（深圳賽百諾基因技術(shù)有限公司，批號20130602）；組胺（上海三杰生物技術(shù)有限公司，批號20110901）；總膽固醇（TC）ELISA試劑盒（江蘇艾迪生生物科技有限公司，貨號ZF014）；三酰甘油（TG）ELISA試劑盒（江蘇艾迪生生物科技有限公司，貨號ZF013）；Beclin1 抗體（美國Immunoway 公司，貨號YM3363）；LC3 抗體（美國CST 公司，貨號12741）。球囊擴張導(dǎo)管（3.0～3.5 mm×15 mm）、導(dǎo)引導(dǎo)管（145 cm×0.84 mm）、導(dǎo)引導(dǎo)絲（14 mm×195 cm）、手推式球囊擴張壓力泵（30 atm/20 mL），美國Cordis公司；臺式高速冷凍離心機（型號D3024R），北京大龍儀器；立式冷藏陳列柜（型號LSC-316C），浙江星星科技股份有限公司；高速組織研磨儀（型號KZ-Ⅱ），武漢賽維爾生物科技有限公司；超薄切片機（型號UC7），德國Leica公司；酶標(biāo)儀（型號RT-6100），美國Rayto 公司，凝膠成像系統(tǒng)（型號alphaEase FC），美國Alpha Innotech公司，顯微鏡（型號E100），日本Nikon公司。

1.4 造模

所有兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為空白組10只和手術(shù)組48只。采用高脂飼料喂養(yǎng)+腹主動脈球囊損傷+基因轉(zhuǎn)染+藥物觸發(fā)斑塊破裂法[8]制備模型，空白組予普通飼料喂養(yǎng)，手術(shù)組予高脂飼料喂養(yǎng)，2周后對手術(shù)組兔行腹主動脈球囊損傷術(shù)：兔經(jīng)耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉，肝素鈉抗凝（200 U/kg），將兔固定于兔臺，右后肢大腿內(nèi)側(cè)剪毛備皮，絡(luò)合碘常規(guī)消毒，在股動脈搏動明顯處縱行切開皮膚，游離股動脈約2 cm，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動脈夾夾閉近心端，并在股動脈近心端穿線打一活結(jié)，準(zhǔn)備術(shù)后結(jié)扎。將股動脈剪一小口，送入導(dǎo)引導(dǎo)絲，松開動脈夾，沿導(dǎo)引導(dǎo)絲將球囊導(dǎo)入腹主動脈，長度約20 cm，用球囊擴張壓力泵向球囊注入肝素鈉生理鹽水，保持壓力泵讀數(shù)為6～8 atm（1 atm=101.325 kPa），抗阻力牽拉球囊導(dǎo)管至髂動脈，抽空球囊，45 s后再次將球囊導(dǎo)管送入20 cm深度處，重復(fù)3次。術(shù)后結(jié)扎股動脈近心端，逐層縫合皮膚，消毒，連續(xù)3 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）預(yù)防感染。手術(shù)過程死亡4只，剩余44只兔再隨機分為模型組、直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組，每組11只。術(shù)后繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)，同時進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)，共8周。

干預(yù)結(jié)束后停止高脂飼料喂養(yǎng)，改為普通飼料，對所有手術(shù)組兔進(jìn)行腹主動脈斑塊局部基因轉(zhuǎn)染。選取左后肢大腿內(nèi)側(cè)股動脈，術(shù)前準(zhǔn)備及送入球囊導(dǎo)管操作同腹主動脈球囊損傷術(shù)，用球囊擴張壓力泵向腹主動脈斑塊局部注入20 μL滴度為1.0×1012VP/mL的Ad5-p53 重組載體，術(shù)后操作同前。基因轉(zhuǎn)染時間為2周。

分別于動物處死前48、24 h腹膜下注射中國斑點蝰蛇毒（0.15 mg/kg），30 min 后耳緣靜脈注射組胺（0.02 mg/kg），共觸發(fā)2次。

1.5 干預(yù)方法

取穴分為2組，1組“巨闕”、雙側(cè)“天樞”“豐隆”，2組雙側(cè)“心俞”“肝俞”“脾俞”。參照《實驗針灸學(xué)》[9]取穴定位，直接灸組將兔固定于兔臺，取穴處剪毛，將艾炷（下有紙制墊盤）粘于穴位處，點燃施灸，待艾炷燃完且余熱散盡后，再換另一壯，每穴每日連灸3壯（約30 min），2組穴位隔日交替施灸；隔藥餅灸組將兔固定于兔臺，取穴處剪毛，將藥餅貼于穴位處，將艾炷（去除紙質(zhì)墊盤）置于藥餅上點燃，取穴及其余操作同直接灸組；西藥組將阿托伐他汀鈣片研磨成粉，按1.96 mg/（kg·d）劑量拌入高脂飼料中，并每日進(jìn)行相同固定操作，每次30 min；空白組和模型組兔每日僅固定，不干預(yù)，每次30 min。以上干預(yù)連續(xù)8周。

1.6 取材

干預(yù)結(jié)束后取材。取材前12 h禁食不禁水，耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，仰臥固定于兔臺，腹部剪毛后，沿腹中線開腹，游離主動脈弓至髂總動脈分叉處主動脈全長，采血針平行血管穿刺，取動脈血2 mL于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取離心后血清，放于新的EP管，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采血完成后，用眼科剪將腹主動脈剪下，生理鹽水沖洗，剪取米粒大小腹主動脈組織，迅速置于2.5%戊二醛中固定24 h以上，置于4 ℃冰箱冷藏備用，剩余腹主動脈組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 一般狀態(tài)觀察

每日觀察兔精神狀態(tài)、動作靈敏性、反應(yīng)敏捷性、毛發(fā)光澤度、體質(zhì)量變化、飲食量、飲水量及大小便顏色形態(tài)等。

1.7.2 ELISA檢測

取離心后血清，采用ELISA試劑盒檢測TC和TG含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀波長450 nm處測量各孔吸光度（OD值），計算血清TC和TG含量。

1.7.3 透射電鏡觀察

取出2.5%戊二醛固定24 h以上的腹主動脈組織，1%鋨酸固定2 h，50%、70%、90%、100%丙酮脫水，每次15 min。置于丙酮-812包埋劑（1︰1）中，37 ℃烤箱滲透2～4 h，丙酮-812包埋劑（1︰2）37 ℃滲透過夜，812包埋劑37 ℃滲透5～8 h后烤箱包埋過夜，60 ℃烤箱聚合48 h，超薄切片（厚度60～80 nm），醋酸鈉、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.7.4 Western blot檢測

取適量腹主動脈組織，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，80 μg蛋白上樣，凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫孵育2 h，分別加入Beclin1和LC3一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Quantity One 4.4.0軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值計算蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 隔藥餅灸對模型兔一般狀態(tài)的影響

最終存活42只兔，其中空白組8只、模型組9只、直接灸組9只、隔藥餅灸組7只、西藥組9只。與空白組比較，模型組兔精神狀態(tài)萎靡，活動減少，毛發(fā)光澤度降低，體質(zhì)量增加，大便成形、顏色較黑，小便混濁；與模型組比較，各干預(yù)組兔精神狀態(tài)稍改善，行動遲緩，其他無明顯差異。

2.2 隔藥餅灸對模型兔血清總膽固醇和三酰甘油含量的影響

與空白組比較，模型組兔血清TC和TG含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔血清TC和TG含量顯著減少（P<0.01，P<0.05）。見圖1。

圖1 各組兔血清TC和TG含量比較（，每組7～9只）

2.3 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈超微結(jié)構(gòu)及自噬體形成的影響

空白組兔腹主動脈血管平滑肌細(xì)胞包膜完整、呈梭形排列，無脂滴沉積，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常；模型組兔腹主動脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，其內(nèi)肌原纖維不可見，泡沫池中有脂滴分布，核周圍出現(xiàn)低電子密度空泡，細(xì)胞核局部凹陷呈不規(guī)則形狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器不可見，未見自噬體存在，胞外可見個別膠原纖維存在，大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀；直接灸組兔腹主動脈血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，其內(nèi)肌原纖維部分保留，泡沫池中含有大量脂滴，主要為圓形或橢圓形，局部出現(xiàn)低電子密度空泡，細(xì)胞核呈不規(guī)則三角形、局部凹陷，染色質(zhì)均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器不可見，核膜部分區(qū)域模糊、雙層膜結(jié)構(gòu)消失，可見自噬體存在，胞外大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀；隔藥餅灸組兔腹主動脈血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，其內(nèi)肌原纖維不可見，細(xì)胞膜與胞外物質(zhì)溶為一體，脂滴散在分布于泡沫池中，核周圍出現(xiàn)低電子密度空泡，細(xì)胞核呈不規(guī)則形狀、局部凹陷，染色質(zhì)均勻，核周隙擴張嚴(yán)重，有髓樣殘留物，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器不可見，可見自噬體存在，胞外可見個別膠原纖維存在，大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀；西藥組兔腹主動脈可見血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，其內(nèi)肌原纖維部分保留，胞內(nèi)出現(xiàn)大面積低電子密度空泡，細(xì)胞核呈不規(guī)則三角形、局部凹陷，染色質(zhì)均勻，核膜部分區(qū)域模糊，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器不可見，未見自噬體存在，胞外可見個別膠原纖維存在，大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀。見圖2。

圖2 各組兔腹主動脈超微結(jié)構(gòu)（×7 000）

2.4 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈組織Beclin1和LC3蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動脈組織Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，直接灸組兔腹主動脈組織Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），隔藥餅灸組兔腹主動脈組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P<0.01，P<0.05），西藥組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P<0.01）；與直接灸組比較，西藥組兔腹主動脈Beclin1蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見圖3、圖4。

圖3 各組兔腹主動脈Beclin1、LC3蛋白免疫印跡

圖4 各組兔腹主動脈Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比較（，每組7～9只）

3 討論

AS的形成與發(fā)展和脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)。TC主要功能是合成膽汁酸、促進(jìn)游離脂肪酸的吸收，當(dāng)其代謝失常時可導(dǎo)致AS發(fā)生。TG的主要功能是供能和貯能，可降低纖溶系統(tǒng)活性，增加凝血系統(tǒng)活性，促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展[10]。多項研究表明，灸法能有效降低血清TC和TG含量[11-13]。本實驗結(jié)果顯示，模型組兔血清TC和TG含量顯著增加，各干預(yù)組TC和TG含量均顯著減少，提示隔藥餅灸可改善AS易損斑塊兔血脂水平，抑制AS發(fā)展。且與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明隔藥餅灸效果與藥物阿托伐他汀相當(dāng)。

自噬是生物進(jìn)行降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)生物大分子和受損細(xì)胞器的過程[14]，在營養(yǎng)缺乏、組織缺氧、氧化應(yīng)激及DNA損傷等條件下被激活。巨噬細(xì)胞自噬是AS進(jìn)展中的重要參與者，AS早期階段，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)受損，單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白或其他脂蛋白后變成泡沫細(xì)胞，最終形成斑塊。機體通過自噬回收利用內(nèi)源性細(xì)胞成分如氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸等，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[15]。而斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡及胞葬作用缺陷會促進(jìn)斑塊壞死，從而導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加，形成血栓，最終引起急性心腦血管事件[16]。因此，減少斑塊中巨噬細(xì)胞浸潤、增加易損斑塊的穩(wěn)定性可作為治療AS的重要方法之一。本實驗透射電鏡結(jié)果顯示，模型組兔腹主動脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，泡沫池中可見脂滴分布，未見自噬體存在，大量膠原纖維斷裂溶解，表明AS過程中出現(xiàn)泡沫細(xì)胞聚集與脂質(zhì)積累。經(jīng)干預(yù)后，直接灸組和隔藥餅灸組兔腹主動脈泡沫細(xì)胞中可見自噬體存在，西藥組部分細(xì)胞器及膠原纖維保留，但視野中未見自噬體存在，表明隔藥餅灸干預(yù)可促進(jìn)自噬體形成，增強細(xì)胞自噬水平，抑制AS發(fā)展。

Beclin1可控制自噬和凋亡的相互轉(zhuǎn)換[17]，LC3是自噬體的特異性蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，LC3Ⅱ在AS血管中高表達(dá)，而在非AS血管中低表達(dá)，LC3Ⅱ可靶向定位于前自噬體和自噬體膜上，與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)[18-19]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平常用于評價自噬水平，比值越大表明自噬水平越高[20]。本實驗結(jié)果顯示，模型組兔腹主動脈組織Beclin1 蛋白表達(dá)顯著升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明AS發(fā)展使細(xì)胞自噬功能激活，自噬作為潛在的“補償機制”，發(fā)揮抗AS作用。經(jīng)干預(yù)后，隔藥餅灸組兔腹主動脈Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，表明隔藥餅灸干預(yù)可提高細(xì)胞自噬水平，增加斑塊穩(wěn)定性。

綜上，隔藥餅灸可能通過上調(diào)Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)自噬體形成，從而改善血脂水平，穩(wěn)定斑塊，抑制AS發(fā)展。