李林江，萬生芳，李榮科，張磊，楊雅麗，張亞男，荀敏奇

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

糖尿病性胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是一種無機(jī)械性梗阻導(dǎo)致的胃排空延遲性疾病，臨床主要表現(xiàn)為上腹脹滿、早飽、反酸、嘔吐、泄瀉等。近年研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病發(fā)展可導(dǎo)致肝、胃、腎、胰腺等出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，DGP作為糖尿病常見的消化道并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制與胃體平滑肌病變密切相關(guān)[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）存在于所有真核生物中，既是機(jī)體自我保護(hù)的反應(yīng)，也是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑[3]，活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）是ERS激活的經(jīng)典標(biāo)志物，ATF6/CHOP通路在調(diào)節(jié)ERS中起著關(guān)鍵作用[4]。研究表明，ERS參與DGP大鼠胃竇組織平滑肌調(diào)節(jié)[5]，但具體機(jī)制尚未闡明。紅芪為甘肅道地藥材，其藥效優(yōu)于黃芪，主要活性成分紅芪多糖具有清除自由基、調(diào)節(jié)ERS、抗氧化、抗衰老等作用[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖可改善DGP大鼠氧化損傷，修復(fù)胃黏膜，提高胃竇組織Bcl-2/Bax 比值，抑制胃竇組織黏膜細(xì)胞凋亡[7-9]。基于此，本實(shí)驗(yàn)觀察紅芪多糖對DGP模型大鼠胃竇組織平滑肌的影響，從ATF6/CHOP信號通路探討其作用機(jī)制，為紅芪多糖的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

72 只 SPF 級雄性 Wistar 大鼠，6 周齡，體質(zhì)量（160±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)室，溫度22～25 ℃，相對濕度45%～55%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批（2020-041）。

1.2 藥物

紅芪多糖，陜西省寶雞市方晟生物開發(fā)公司制備，批號20200315，多糖含量72.4%。鹽酸二甲雙胍分散片，河北省石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號183290，0.85 g/片。

1.3 主要試劑與儀器

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）抗體（英國Abcam，貨號ab21685），ATF6 抗體（英國Abcam，批號DF6009），CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）抗體（英國Abcam，批號DF6025），半胱氨酸蛋白酶 -12 （Caspase-12） 抗 體 （ 英 國 Abcam， 批 號AF5199），Bcl-2 抗體 （美 國 Immunoway，批號YT0455）， Bax 抗 體 （ 美 國 Immunoway， 批 號YT0470），TUNEL凋亡試劑盒（上海翊圣生物技術(shù)有限公司，批號T5001090）。渦旋振蕩器（上海滬西分析儀器廠，型號WH-2），小型離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，型號XK-400），酶標(biāo)儀（美國Thermo，型號MK3），離心機(jī)（德國Kendro，型號D-37520），熒光顯微鏡（日本OLYMPUS，型號BX51），切片機(jī)（德國Leica 公司，型號RM2016），凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司，型號Chemi DocXRS+），凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號PowerPoc Basic），電動離心機(jī)（常州市金壇恒豐儀器廠，型號XYJ80-2），多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan，型號Infinite M200 Pro）。

1.4 造模

72只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組12只和造模組60只。將鏈脲佐菌素溶于0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.2～4.5），配制成1%溶液。造模組大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素溶液50 mg/kg，空白組大鼠腹腔注射等量0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。72 h后大鼠尾靜脈采血，測定隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。將糖尿病大鼠不規(guī)則喂食高糖高脂飼料（單日上午進(jìn)食，雙日下午進(jìn)食），連續(xù)4 周。測定大鼠血糖≥16.7 mmol/L，并出現(xiàn)飲水量增加、腹脹、體質(zhì)量明顯減輕等表現(xiàn)，隨機(jī)選取空白組和造模組大鼠各2只檢測胃肌電活動。造模組大鼠胃平滑肌自主收縮頻率明顯低于空白組，提示DGP大鼠造模成功。

1.5 分組與給藥

造模結(jié)束后，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組9只、二甲雙胍組11只、紅芪多糖高劑量組10只、紅芪多糖中劑量組10只、紅芪多糖低劑量組9只，另設(shè)空白組10只。二甲雙胍組予二甲雙胍混懸液200 mg/kg灌胃，根據(jù)紅芪多糖臨床等效劑量和純度，紅芪多糖高、中、低劑量組灌胃劑量分別為200、100、50 mg/kg，相當(dāng)于成人臨床等效劑量的20、10、5倍（灌胃時將所需用量的鹽酸二甲雙胍分散片和紅芪多糖分別溶于2 mL純凈水中），空白組和模型組灌胃2 mL純凈水，每日1次，連續(xù)4周。同時，空白組喂食普通飼料，其余各組繼續(xù)喂食高糖高脂飼料，每2周檢測大鼠隨機(jī)血糖。

1.6 胃排空率檢測

給藥結(jié)束后大鼠禁食24 h、禁水2 h，以2 mL酚紅灌胃，10 min后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，20 min后打開腹腔，充分暴露胃部，結(jié)扎賁門和幽門，用剪刀沿胃部平滑肌條剪開，使用蒸餾水沖洗胃內(nèi)容物并定容至10 mL，加入1 mol/L NaOH溶液5 mL，搖勻，常溫靜置1 h，取5 mL上層清液置另一試管中并加入20%三氯乙酸0.5 mL，3 600 r/min 離心15 min×2 次，取上清液進(jìn)行檢測。另取酚紅溶液2 mL，依次加入生理鹽水18 mL、1 mol/L NaOH溶液20 mL、20%三氯乙酸4 mL，混勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品。采用分光光度計(jì)于波長560 nm處檢測吸光度（OD值），計(jì)算胃排空速率。胃排空率（%）=（酚紅標(biāo)準(zhǔn)品OD值-酚紅實(shí)測OD值）÷酚紅標(biāo)準(zhǔn)品OD值×100%。

1.7 TUNEL凋亡檢測

取胃竇組織，去除胃黏膜層和外膜得到平滑肌，制作石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蛋白酶K修復(fù)，PBS洗滌，加入TUNEL反應(yīng)液和復(fù)合液，DAPI染色。正常細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色。每張切片選取5個視野拍照，以平均值作為胃竇組織凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)÷（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 Western blot檢測

取胃竇組織，去除胃黏膜層和外膜得到平滑肌，預(yù)冷生理鹽水清洗，加入蛋白裂解液，機(jī)器輔助粉碎組織，冰上充分裂解，13 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF 膜后置于5%BSA 中室溫封閉30 min。加入GRP78、CHOP、ATF6、Casepase-12 一抗（均為 1∶1 000），4 ℃孵育過夜。PBS洗膜15 min×3次，滴加HRP標(biāo)記二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，PBS洗膜15 min×3次，ECL顯色。采用Image J 1.4.8軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白與β-actin蛋白灰度值比值作為蛋白相對表達(dá)量。

1.9 免疫組化檢測

將胃竇組織平滑肌置于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片。切片置65 ℃烘箱中烤片2 h，常規(guī)脫水，放入檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中微波修復(fù)，5%山羊血清室溫封閉30 min，加入GRP78一抗（1∶1 000）、ATF6一抗（1∶400）、CHOP一抗（1∶400）、Casepase-12一抗（1∶400）、Bcl-2一抗（1∶400）、Bax一抗（1∶400），4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，以棕褐色為陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取3個200倍視野拍照，采用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽性表達(dá)的平均光密度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紅芪多糖對模型大鼠血糖的影響

給藥第0、2、4周，與空白組比較，模型組大鼠血糖顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和二甲雙胍組給藥第2、4周血糖顯著降低（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠不同時點(diǎn)血糖比較（，mmol/L）

表1 各組大鼠不同時點(diǎn)血糖比較（，mmol/L）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別給藥第4周只數(shù) 給藥第0周 給藥第2周空白組模型組紅芪多糖高劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖低劑量組二甲雙胍組8.69±0.73 32.69±0.53**18.71±0.87##20.40±2.47##21.76±1.32##16.70±2.19##10 9 10 10 9 11 8.94±0.43 33.15±2.64**31.71±1.77 30.62±3.42 31.20±1.14 31.80±0.35 8.67±0.82 32.45±1.63**20.98±2.58##24.79±1.46##24.49±2.71##20.14±1.46##

2.2 紅芪多糖對模型大鼠胃排空率的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃排空率顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和二甲雙胍組大鼠胃排空率顯著升高（P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠胃排空率比較（，%）

表2 各組大鼠胃排空率比較（，%）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

胃排空率84.65±14.09 33.09± 8.43**69.89± 9.46##54.37±15.08##52.44± 7.36##72.62± 9.45##組別空白組模型組紅芪多糖高劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖低劑量組二甲雙胍組只數(shù)10 9 10 10 9 11

2.3 紅芪多糖對模型大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞凋亡率的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和二甲雙胍組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表3、圖1。

圖1 各組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞凋亡表達(dá)（TUNEL染色，×200）

表3 各組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞凋亡率比較（，%）

表3 各組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞凋亡率比較（，%）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

凋亡率1.71±0.86 15.81±3.70**3.64±1.29##5.84±1.32##6.27±2.07##2.85±0.47##組別空白組模型組紅芪多糖高劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖低劑量組二甲雙胍組只數(shù)10 9 10 10 9 11

2.4 紅芪多糖對模型大鼠胃竇組織平滑肌葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、活化轉(zhuǎn)錄因子6、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白、半胱氨酸蛋白酶-12蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和二甲雙胍組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），紅芪多糖高劑量組和二甲雙胍組ATF6 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01，P<0.05）。見圖2、表4。

表4 各組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)比較（）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

Caspase-12/β-actin 1.409±0.113 3.349±0.208**1.846±0.140##2.329±0.161##2.751±0.075##1.754±0.690##組別空白組模型組紅芪多糖高劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖低劑量組二甲雙胍組只數(shù)10 9 10 10 9 11 GRP78/β-actin 0.432±0.014 2.382±0.086**1.438±0.053##2.046±0.092##2.137±0.112##1.438±0.082##ATF6/β-actin 1.114±0.051 2.140±0.110**1.558±0.112#1.759±0.121 1.755±0.561 1.381±0.030##CHOP/β-actin 0.704±0.142 2.376±0.225**1.124±0.085##1.798±0.250##1.851±0.286##0.978±0.102##

圖2 各組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12蛋白免疫印跡

2.5 紅芪多糖對模型大鼠胃竇組織平滑肌活化轉(zhuǎn)錄因子6、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、半胱氨酸蛋白酶-12、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12、Bax蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖高、中劑量組和二甲雙胍組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），二甲雙胍組大鼠胃竇組織平滑肌Bax 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見圖3～圖8、表5。

表5 各組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（，平均光密度）

表5 各組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（，平均光密度）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組模型組紅芪多糖高劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖低劑量組二甲雙胍組Bax 1 930.82± 86.71 5 706.23±320.01**4 456.63±103.38 4 861.47±103.22 5 112.14±108.26 2 274.73±123.21##只數(shù)10 9 10 10 9 11 GRP78 115.53± 24.51 6 209.84±125.29**4 437.81±351.59##4 631.17±356.41##5 409.53±548.13 4 228.46±176.38##ATF6 1 811.72±520.92 7 230.53±365.10**3 604.82±479.75##5 975.83±187.74##6 522.81±426.18##2 137.70± 85.73##CHOP 148.23± 31.68 5 453.96± 66.89**3 143.11±368.62##4 502.37±333.21##5 964.42±230.40#352.83± 26.45##Caspase-12 56.71± 4.61 5 114.27±221.89**3 184.56±149.92##4 252.14±152.21##4 967.02± 97.31 109.51± 24.84##Bcl-2 6 164.53± 70.44 141.72± 15.98**5 641.35±293.68##5 292.17±332.24##5 300.80± 37.89##6 103.94±536.90##

圖3 各組大鼠胃竇組織平滑肌GRP78表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖8 各組大鼠胃竇組織平滑肌Bax表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖4 各組大鼠胃竇組織平滑肌ATF6表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖5 各組大鼠胃竇組織平滑肌CHOP表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖6 各組大鼠胃竇組織平滑肌Caspase-12表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖7 各組大鼠胃竇組織平滑肌Bcl-2表達(dá)（免疫組化染色，×200）

3 討論

DGP發(fā)病較為隱匿，極易被患者忽視，導(dǎo)致發(fā)病時間延長，胃動力減弱。DGP早期多以消化道癥狀為主，患者不僅出現(xiàn)腹脹、惡心、嘔吐等癥狀，胃動力減弱還影響患者對藥物的吸收，降低患者生活質(zhì)量。DGP屬中醫(yī)學(xué)“痞證”范疇，消渴久病累及脾胃，導(dǎo)致脾氣虛弱，胃不化物，病機(jī)為脾失健運(yùn)、胃失和降，治以補(bǔ)氣健脾[10]。紅芪乃補(bǔ)氣之要藥，具有補(bǔ)氣健脾、升陽固表功效，為甘肅道地藥材，其主要成分紅芪多糖具有降血糖、抗氧化作用，契合DGP病機(jī)。

ATF6/CHOP通路為ERS的經(jīng)典通路，并且可在肌細(xì)胞凋亡中被特異性激活。當(dāng)ERS持續(xù)激活時，ATF6會轉(zhuǎn)移到高爾基體，被高爾基體蛋白酶SP1、SP2切割，再轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與ATF6反應(yīng)基因元件結(jié)合，激活下游靶點(diǎn)CHOP。CHOP是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，CHOP 通過下調(diào)Bcl-2/Bax 和上調(diào)Caspase-12、Caspase-3 蛋白表達(dá)啟動細(xì)胞凋亡程序。有研究發(fā)現(xiàn)，ATF6介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡還出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞核異常并伴有不同程度炎癥[11]。二甲雙胍為經(jīng)典降血糖藥物。有研究表明，二甲雙胍能通過調(diào)節(jié)糖尿病大鼠海馬區(qū)ATF6表達(dá)，改善其認(rèn)知功能[12]；郭衛(wèi)東等[13]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可調(diào)節(jié)脊髓損傷大鼠ERS，抑制大鼠脊髓損傷后細(xì)胞凋亡。故本實(shí)驗(yàn)選擇二甲雙胍作為陽性藥。

ERS初期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白抵抗降解并聚集，進(jìn)一步觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白合成受阻，此時ERS處于可控狀態(tài)，GRP78與下游ATF6解離，通過修正未折疊蛋白減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力[14]，但ERS長期處于高水平會將其生理輸出從促進(jìn)適應(yīng)轉(zhuǎn)換為促進(jìn)細(xì)胞凋亡。糖尿病大鼠伴有ERS反應(yīng)，而DGP常發(fā)生在糖尿病后期，大鼠ERS處于持續(xù)高水平狀態(tài)，未折疊蛋白反應(yīng)持續(xù)一段時間后將其生理輸出轉(zhuǎn)換為促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胃組織病理損傷，影響胃動力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞大量凋亡，胃排空率顯著降低，胃竇組織平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值降低。經(jīng)藥物干預(yù)后，紅芪多糖高劑量組和二甲雙胍組明顯好轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為胃竇組織平滑肌細(xì)胞凋亡率降低，胃排空率顯著改善，GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值升高。提示ERS水平降低，胃竇組織平滑肌病理損傷減輕，胃動力有所恢復(fù)。

綜上所述，紅芪多糖能在一定程度上修復(fù)DGP大鼠胃竇組織平滑肌損傷，改善胃動力，其機(jī)制可能與抑制ATF6/CHOP 通路，下調(diào)GRP78、Caspase-12、Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究可為深入研究紅芪多糖治療DGP機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中醫(yī)治療DGP提供新思路。