王錢，譚貝西，王恬恬，馮憶，王永輝，趙樂，周然，

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030600

神經(jīng)元作為機體內(nèi)存活時間最長的末端分化細胞，受到多種細胞應(yīng)激壓力的脅迫，其中最主要的是氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是由細胞內(nèi)活性氧（ROS）過度積累導(dǎo)致，過量的ROS不僅導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)受損，還會誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。鐵死亡是一種鐵依賴性的細胞程序性死亡方式，與胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體途徑、鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)途徑相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元鐵死亡參與缺血性腦卒中、腦出血、阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后[1-4]。

腦震寧是武國憲、田成興教授經(jīng)臨床實踐研制的以涼血活血化瘀、益血安神定智為主要功效的中藥制劑。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腦震寧可改善線粒體結(jié)構(gòu)與功能，減輕三重腦震蕩模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷，其機制與調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路有關(guān)[5-6]。c-Jun氨基末端激酶（JNK）是MAPK信號通路的一個分支，介導(dǎo)胚胎發(fā)育、代謝、程序性細胞死亡、細胞遷移、修復(fù)和軸突運輸[7-8]?；诖?，本實驗通過小鼠海馬神經(jīng)元細胞鐵死亡模型，觀察腦震寧能否通過調(diào)控JNK信號通路抑制神經(jīng)元鐵死亡，明確其作用機制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物與細胞

8周齡SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20）g，購自北京維通利華有限公司，動物合格證號110011210107050076。飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，溫度（25±2）℃，濕度50%～60%，自然晝夜節(jié)律，自由飲食飲水。本實驗經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（2021DW031）。

小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞，購自上海富衡有限公司，編號FH1027。

1.2 藥物與試劑

腦震寧由生地黃、牡丹皮、當(dāng)歸、丹參、川芎、炒酸棗仁、柏子仁、陳皮、竹茹、茯苓、地龍組成，藥物比例8∶6∶8∶15∶6∶10∶10∶10∶10∶10∶6，飲片購自山西省晉中市同仁堂有限公司。常規(guī)方法煎煮，先加入10倍量水浸泡30 min，大火煮沸，文火煎煮40 min，紗布過濾，再加入8倍量水大火煮沸，文火煎煮40 min，紗布過濾，合并2次藥液，水浴濃縮至原藥材濃度為6.68 g/mL，4 ℃冰箱保存。

胎牛血清（武漢Bioswamp 公司，批號SA211），Erastin（美國MCE公司，批號S7242），鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1，美國MCE 公司，批號HY-100579），p38 MAPK抑制劑SB203580（美國MCE公司，批號22898），ERK抑制劑PD98059（美國MCE公司，批號41867），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成，批號20211030），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成，批號20211110），ROS試劑盒（上海碧云天，批號061521210723），鐵含量檢測試劑盒（德國默克公司，批號7D01K03900），谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（上海Abmart公司，批號4000000558），鐵蛋白重鏈（FTH）抗體（武漢ABclonal公司，批號4000000023），鐵蛋白輕鏈（FTL）抗體（上海Abmart公司，批號334265），p-JNK抗體（英國Abcam公司，批號GR3323833-2），JNK抗體（武漢Servicebio公司，批號GB112329）。

1.3 實驗儀器

倒置熒光顯微鏡（日本Nikon，型號Ts2R），酶標儀（美國BioTek公司，型號EPOCH2NS），臺式高速冷凍離心機（安徽中科中佳，型號KDC-160HR），電泳和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠，型號DYY-6C），化學(xué)發(fā)光儀（美國Alpha Innotech，型號ImageQuant LAS 500），熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad，型號CFX）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為空白組和腦震寧組。給藥劑量根據(jù)人與大鼠體表面積[9]并參考文獻[10]換算，單次給藥劑量相當(dāng)于原藥材66.83 g/kg，每日早晚各灌胃1次，連續(xù)7 d?？瞻捉M予生理鹽水灌胃。末次灌胃1 h后腹主動脈取血[11]，室溫靜置2 h，3 500 r/min離心20 min，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，凍存于-80 ℃冰箱備用。

2.2 造模

取對數(shù)生長期HT22細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，以5×103個/孔接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。設(shè)置調(diào)零組、空白組、造模組，每組6個復(fù)孔，造模組分別加入空白培養(yǎng)基配制的終濃度為1、3、5、7、9 μg/mL的Erastin工作液，空白組加入空白培養(yǎng)基，分別繼續(xù)培養(yǎng)6、8、10、11 h。每孔加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)箱避光孵育2 h，酶標儀波長450 nm檢測各孔吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組吸光度-調(diào)零組吸光度）÷（空白組吸光度-調(diào)零組吸光度）×100%。

2.3 含藥血清作用時間篩選

取對數(shù)生長期HT22細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，以5×103個/孔接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。設(shè)置調(diào)零組、空白組、模型組、血清組，每組6個復(fù)孔，模型組和血清組加入5 μg/mL Erastin作用細胞11 h，隨后血清組分別加入1%、5%、10%含藥血清（用空白血清補足至10%）繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。每孔加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)箱避光孵育2 h，酶標儀波長450 nm檢測各孔吸光度，計算細胞存活率。

2.4 分組及給藥

取對數(shù)生長期HT22細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，以2×105個/孔接種于6 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將細胞分為空白組、模型組、Fer-1 組、1%腦震寧含藥血清組（1%血清組）、5%腦震寧含藥血清組（5%血清組）、10%腦震寧含藥血清組（10%血清組）、抑制劑+1%腦震寧含藥血清組（抑制劑+1%血清組）、抑制劑+5%腦震寧含藥血清組（抑制劑+5%血清組）、抑制劑+10%腦震寧含藥血清組（抑制劑+10%血清組）。除空白組外，其余各組均加入5 μg/mL Erastin作用細胞11 h，隨后分別加入相應(yīng)濃度含藥血清（用空白血清補足至10%）繼續(xù)培養(yǎng)24 h；空白組加入含10%空白血清的完全培養(yǎng)基；Fer-1 組造模前先加入5 μmol/mL Fer-1 工作液處理12 h；各抑制劑組造模結(jié)束后先予濃度為10 μmol/L的SB203580[12]和 30 μmol/L 的 PD98059 預(yù)處理 2 h[13]，隨后加入相應(yīng)濃度含藥血清（用空白血清補足至10%）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.5 TBA法檢測丙二醛含量

按“2.4”項下步驟處理細胞后，加入PBS緩沖液洗滌2次，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，按試劑盒說明書檢測MDA含量。

2.6 WST-1法檢測超氧化物歧化酶活性

按“2.5”項下方法收集細胞，WST-1法檢測SOD活性，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.7 熒光探針檢測活性氧含量

按“2.4”項下步驟處理細胞后，無血清培養(yǎng)液洗滌2次，加入10 μL DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，無血清培養(yǎng)液洗滌2次，熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image J軟件分析平均熒光強度。

2.8 比色法檢測鐵離子含量

按“2.4”項下步驟處理細胞后，PBS緩沖液洗滌細胞2次，收集細胞，16 000×g離心10 min，加入鐵檢測緩沖液重懸。每孔加入樣品30 μL，用鐵檢測緩沖液補足至100 μL，標準品孔加入鐵還原劑5 μL，樣品孔加入鐵還原劑或鐵檢測緩沖液5 μL，置于25 ℃恒溫箱避光孵育30 min。每孔加入鐵探針100 μL，搖床混合均勻，置于25 ℃恒溫箱避光孵育60 min，酶標儀波長593 nm檢測各孔吸光度，計算鐵離子含量。

2.9 RT-PCR檢測

收集細胞，依次進行總RNA提取，DNA反轉(zhuǎn)錄及擴增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.10 Westen blot檢測

按“2.4”項下步驟處理細胞后，PBS緩沖液洗滌細胞2次，加入裂解液裂解2～3 min，收集細胞，冰上繼續(xù)裂解2 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入GPX4一抗（1∶2 000）、FTH一抗（1∶1 000）、FTL一抗（1∶2 000）、p-JNK一抗（1∶5 000）、JNK一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜3 次，滴加二抗孵育30 min，洗膜，ECL顯影，曝光，Alpha軟件分析目的蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 Erastin濃度對HT22細胞存活率的影響

CCK8 結(jié)果表明，Erastin 可降低HT22 細胞存活率，且呈濃度依賴性。5 μg/mL Erastin處理細胞11 h后，細胞存活率為49.44%，故選用該條件作為后續(xù)實驗造模條件。見表2。

表2 不同濃度Erastin對HT22細胞存活率的影響（，%）

表2 不同濃度Erastin對HT22細胞存活率的影響（，%）

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01

11 h 103.03±5.26 73.69±2.79##62.57±2.32##49.44±2.67##39.23±1.24##32.68±1.28##組別空白組造模組濃度/（μg/mL）0 1 3 5 7 9 n 6 6 6 6 6 6 6 h 99.45±6.03 117.67±2.02 105.87±1.03 94.90±2.84#83.25±1.26##65.26±1.96##8 h 103.47±11.23 103.94± 1.72 85.92± 1.93##81.63± 1.44##77.80± 1.33##66.09± 1.70##10 h 108.63±1.46 83.19±1.00##74.18±1.83##66.07±1.52##58.65±2.07##47.18±1.42##

4.2 腦震寧含藥血清對HT22細胞存活率的影響

與空白組比較，模型組和不同濃度血清組細胞各時點存活率明顯下降（P<0.01）；與模型組比較，10%血清組細胞24、48 h存活率顯著升高（P<0.01）；不同濃度血清組比較，10%血清組細胞24 h存活率明顯高于其他濃度血清組（P<0.05）。因此后續(xù)實驗加入含藥血清培養(yǎng)24 h。見表3。

表3 各組HT22細胞存活率比較（，%）

表3 各組HT22細胞存活率比較（，%）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與12 h、48 h比較，△P<0.05，△△P<0.01

組別空白組模型組血清組48 h 146.73±7.45 47.18±0.01##19.65±2.15##28.70±1.09##64.62±3.67##**濃度1%5%10%n 6 6 6 6 6 12 h 85.73±2.74 47.85±0.01##14.51±1.98##28.14±2.00##42.00±1.34##24 h 100.45±5.65 49.29±0.02##49.29±1.94##△△53.55±3.48##△△74.82±3.04##**△

4.3 腦震寧含藥血清對HT22細胞丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性的影響

與空白組比較，模型組細胞MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)er-1組、抑制劑+5%血清組、抑制劑+10%血清組細胞MDA含量顯著減少，SOD活性顯著升高（P<0.01），1%、5%、10%血清組細胞MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低（P<0.01）；與Fer-1組比較，1%、5%、10%血清組細胞MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低（P<0.01），抑制劑+5%血清組、抑制劑+10%血清組細胞SOD活性顯著升高（P<0.01），MDA含量無明顯變化（P>0.05）。見表4。

表4 各組HT22細胞MDA、SOD水平比較（）

表4 各組HT22細胞MDA、SOD水平比較（）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與Fer-1組比較，△△P<0.01

SOD/（U/mL）555.76±4.75 471.53±1.79##513.70±4.58**448.67±6.65**△△486.80±2.55△△457.16±3.02**△△486.16±3.47△△543.51±3.59**△△538.48±6.03**△△組別空白組模型組Fer-1組1%血清組5%血清組10%血清組抑制劑+1%血清組抑制劑+5%血清組抑制劑+10%血清組n6 6 6 6 6 6 6 6 6 MDA/（nmol/mL）0.58±0.02 1.09±0.01##0.78±0.01**1.87±0.03**△△1.74±0.03**△△1.78±0.01**△△1.18±0.01**△△0.75±0.01**0.81±0.01**

4.4 腦震寧含藥血清對HT22細胞活性氧含量的影響

與空白組比較，模型組細胞ROS 含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，其余各組細胞ROS含量顯著減少（P<0.01）；與Fer-1組比較，1%、5%、10%血清組、抑制劑+1%血清組、抑制劑+5%血清組細胞ROS含量顯著增加（P<0.01）。見圖1、表5。

表5 各組HT22細胞ROS含量比較（，平均熒光強度）

表5 各組HT22細胞ROS含量比較（，平均熒光強度）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與Fer-1組比較，△△P<0.01

ROS 9.64±0.27 125.47±6.48##12.44±0.98**118.83±1.16**△△95.95±3.38**△△63.65±1.43**△△49.40±1.25**△△24.42±1.99**△△14.62±0.55**組別空白組模型組Fer-1組1%血清組5%血清組10%血清組抑制劑+1%血清組抑制劑+5%血清組抑制劑+10%血清組n 6 6 6 6 6 6 6 6 6

圖1 各組HT22細胞ROS陽性表達（熒光探針，×200）

4.5 腦震寧含藥血清對HT22細胞鐵離子含量的影響

與空白組比較，模型組細胞總鐵離子和Fe3+含量顯著減少，F(xiàn)e2+含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)er-1組、10%血清組、抑制劑+1%血清組、抑制劑+5%血清組、抑制劑+10%血清組細胞Fe2+含量顯著減少，F(xiàn)e3+含量顯著增加（P<0.01），1%血清組細胞Fe2+含量顯著增加，F(xiàn)e3+含量顯著減少（P<0.01）；與Fer-1組比較，1%血清組細胞Fe2+含量顯著增加，F(xiàn)e3+含量顯著減少（P<0.01），抑制劑+10%血清組細胞Fe2+含量顯著減少（P<0.01）。見表6。

表6 各組HT22細胞鐵離子含量比較（，ng/μL）

表6 各組HT22細胞鐵離子含量比較（，ng/μL）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與Fer-1組比較，△P<0.05，△△P<0.01

組別空白組模型組Fer-1組1%血清組5%血清組10%血清組抑制劑+1%血清組抑制劑+5%血清組抑制劑+10%血清組Fe3+0.115±0.002 0.065±0.001##0.073±0.000**0.059±0.001**△△0.065±0.000△△0.071±0.001**0.073±0.000**0.074±0.001**0.076±0.001**n 6 6 6 6 6 6 6 6 6總鐵離子0.253±0.001 0.213±0.000##0.214±0.000 0.210±0.001△0.210±0.000△0.211±0.001△0.214±0.000 0.214±0.000 0.213±0.001 Fe2+0.138±0.000 0.148±0.001##0.141±0.000**0.151±0.001**△△0.142±0.000**0.139±0.000**0.141±0.000**0.140±0.000**0.137±0.001**△△

4.6 腦震寧含藥血清對HT22細胞GPX4、FTH、FTL、JNK mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組細胞GPX4、FTH、FTL、JNK mRNA表達均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)er-1組、抑制劑+5%血清組、抑制劑+10%血清組細胞GPX4、FTH、FTL、JNK mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），10%血清組細胞GPX4 mRNA表達顯著降低（P<0.01），F(xiàn)TH、FTL mRNA表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與Fer-1 組比較，1%、5%、10%血清組細胞GPX4、FTH、FTL、JNK mRNA表達均顯著升高（P<0.01）。見表7。

表7 各組HT22細胞GPX4、FTH、FTL、JNK mRNA表達比較（）

表7 各組HT22細胞GPX4、FTH、FTL、JNK mRNA表達比較（）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Fer-1組比較，△P<0.05，△△P<0.01

JNK 1.00±0.03 1.24±0.05##0.91±0.04*1.71±0.05**△△1.21±0.01△△1.34±0.04△△1.19±0.03△△0.78±0.03*△1.07±0.02*△△組別空白組模型組Fer-1組1%血清組5%血清組10%血清組抑制劑+1%血清組抑制劑+5%血清組抑制劑+10%血清組n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 GPX4 1.00±0.05 2.29±0.09##1.16±0.05**1.29±0.01**△1.31±0.02**△1.53±0.01**△△1.32±0.01**△1.44±0.06**△△1.47±0.01**△△FTH 1.00±0.07 1.83±0.07##1.27±0.11**2.12±0.06△△2.15±0.08△△2.55±0.10**△△1.37±0.02**1.32±0.03**1.00±0.06**△FTL 1.00±0.02 1.49±0.07##1.18±0.02*2.23±0.05**△△1.77±0.07*△△1.70±0.03*△△1.16±0.02*1.26±0.05*1.32±0.03*

4.7 腦震寧含藥血清對HT22細胞GPX4、FTH、FTL、JNK蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞GPX4、FTH、FTL、p-JNK、JNK蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)er-1組、抑制劑+1%血清組、抑制劑+5%血清組、抑制劑+10%血清組細胞GPX4、FTH、FTL、p-JNK、JNK 蛋白表達顯著降低（P<0.01）；與Fer-1 組比較，1%、5%、10%血清組細胞GPX4、FTH、FTL和JNK蛋白表達顯著升高（P<0.01）。見圖2、表8。

表8 各組HT22細胞GPX4、FTH、FTL、p-JNK、JNK蛋白表達比較（）

表8 各組HT22細胞GPX4、FTH、FTL、p-JNK、JNK蛋白表達比較（）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與Fer-1組比較，△△P<0.01

JNK 0.69±0.01 0.93±0.01##0.58±0.01**1.46±0.01**△△0.76±0.01**△△0.98±0.01**△△0.72±0.02**△△0.39±0.01**△△0.69±0.01**△△組別空白組模型組Fer-1組1%血清組5%血清組10%血清組抑制劑+1%血清組抑制劑+5%血清組抑制劑+10%血清組n6 6 6 6 6 6 6 6 6 GPX4 0.14±0.01 1.58±0.02##0.16±0.01**0.54±0.02**△△0.62±0.01**△△0.81±0.02**△△0.62±0.02**△△0.65±0.01**△△0.74±0.01**△△FTH 0.11±0.03 1.32±0.08##0.44±0.03**2.80±0.03**△△2.88±0.03**△△3.22±0.15**△△0.96±0.06**△△0.52±0.02**△△0.18±0.06**△△FTL 0.11±0.01 1.57±0.02##1.37±0.01**1.94±0.05**△△1.80±0.02**△△1.57±0.03△△0.13±0.01**△△0.31±0.01**△△0.36±0.01**△△p-JNK 0.36±0.02 1.32±0.01##0.88±0.01**0.47±0.01**△△0.62±0.01**△△0.79±0.01**0.16±0.01**△△0.29±0.01**△△0.32±0.00**△△

圖2 各組HT22細胞GPX4、FTH、FTL、p-JNK、JNK蛋白免疫印跡

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腦震寧方中生地黃清熱涼血，牡丹皮活血止痛，當(dāng)歸、丹參、川芎化瘀通絡(luò)，炒酸棗仁、柏子仁養(yǎng)血安神、寧心定志，陳皮、茯苓、竹茹和胃降逆、化痰止嘔，地龍清熱通絡(luò)、利尿。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁、柏子仁、茯苓是改善腦震蕩模型小鼠記憶損傷的主要藥物[14]；川芎、地龍、丹參等活血止痛、化瘀通絡(luò)功效與抑制神經(jīng)元鐵死亡、增強神經(jīng)細胞抗氧化能力、減少神經(jīng)細胞凋亡有明顯關(guān)聯(lián)[15]。

鐵死亡主要由于細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）耗竭，GPX4 活性下降，F(xiàn)e2+氧化脂質(zhì)，產(chǎn)生過量ROS 引起[16]。ROS是一類具有高反應(yīng)性的含氧活性物質(zhì)，過量ROS能導(dǎo)致細胞膜脂質(zhì)過氧化及抗氧化系統(tǒng)紊亂。SOD催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧，是一種重要的自由基清除劑。MDA能反映機體氧化損傷程度，因此，MDA、SOD、GPX4、ROS可作為反映細胞鐵死亡的重要指標。當(dāng)細胞發(fā)生鐵死亡時，調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的蛋白表達異常，如鐵蛋白和二價金屬轉(zhuǎn)運體1蛋白表達降低[17]。鐵蛋白主要由24個亞基構(gòu)成的FTH和FTL組成，F(xiàn)TH主要在神經(jīng)元表達，其作用是氧化Fe2+為Fe3+，而FTL主要負責(zé)儲存Fe3+。當(dāng)細胞內(nèi)Fe2+濃度過高時，氧化應(yīng)激水平隨之提高，引起脂質(zhì)氧化物ROS過度蓄積，進一步促進鐵死亡[18]。Erastin是一種高效鐵死亡誘導(dǎo)劑，通過抑制胱氨酸-谷氨酸轉(zhuǎn)運受體system Xc-誘導(dǎo)鐵死亡，其作用于離體細胞后可誘導(dǎo)鐵死亡的各種損傷，包括細胞內(nèi)ROS生成增多、脂質(zhì)過氧化物及活性鐵含量增加等。ROS由Fe2+酶催化生成，被抗氧化系統(tǒng)清除，F(xiàn)e2+增多可加速飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化，使ROS過量產(chǎn)生[19]，此時細胞自身的氧化反應(yīng)超過抗氧化能力，迫使其激發(fā)自身抗氧化反應(yīng)來維持生理穩(wěn)態(tài)。GPX4是清除多余ROS的關(guān)鍵抗氧化酶[20]，以GSH為還原劑催化脂質(zhì)過氧化物還原成對應(yīng)醇，從而保護細胞免受脂質(zhì)過氧化損傷。本研究中模型組GPX4高表達，可能是細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)消耗過多，而被迫作出的一種自身調(diào)節(jié)反應(yīng)。Fer-1是通過小分子文庫高通量篩選得到的特異性鐵死亡抑制劑，主要通過還原反應(yīng)抑制脂質(zhì)過氧化，防止膜脂質(zhì)被破壞，可降低Erastin 誘導(dǎo)的ROS 蓄積，抑制細胞鐵死亡[21-22]。

MAPK信號通路包括p38、ERK、JNK 3個分支，3條通路相互影響，p38信號通路激活會加重細胞炎癥反應(yīng)，提高氧化應(yīng)激水平，加劇ROS蓄積。p38能激活JNK信號通路，JNK信號通路激活后，可抑制線粒體呼吸鏈，增加MDA含量，降低SOD活性，進一步誘發(fā)鐵死亡[23]。ERK信號通路能介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響ROS蓄積[24]。因此，單獨抑制JNK信號通路并不能完全阻斷p38和ERK信號通路的影響，且p38和ERK信號通路也會誘發(fā)鐵死亡。此外，JNK抑制劑多使用SP600125，雖然可同時抑制JNK1/2/3，但SP600125是一種有效的鐵死亡抑制劑，因此本研究使用SB203580和PD98059抑制p38和ERK信號通路。結(jié)果顯示，SB203580 和 PD98059 預(yù)處理后，HT22 細胞MDA、ROS含量減少，SOD活性升高，GPX4、FTH、FTL蛋白和mRNA表達降低，F(xiàn)e2+含量減少，p-JNK蛋白表達降低，說明腦震寧通過抑制JNK信號通路激活改善HT22細胞鐵死亡。未使用抑制劑預(yù)處理組效果弱于抑制劑預(yù)處理組，說明腦震寧影響HT22細胞鐵死亡不僅受JNK信號通路影響，還可能受p38、ERK信號通路影響，當(dāng)另2條通路作用強于JNK通路時，腦震寧抑制細胞鐵死亡作用將減弱。

綜上所述，腦震寧含藥血清能改善Erastin誘導(dǎo)的HT22細胞鐵死亡，其機制可能是通過抑制JNK信號通路激活降低氧化應(yīng)激水平，減少Fe2+含量。但鐵死亡作用機制復(fù)雜，本課題組今后將進一步探討腦震寧抑制鐵死亡的作用機制。