朱冬菊，樸炳奎，楊晨，白建琦，秦騰騰，朱宏偉，張平

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌發(fā)病率和病死率居全球惡性腫瘤首位，2020年新發(fā)220萬(wàn)例，死亡約180萬(wàn)例[1-2]，43%的非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）患者確診時(shí)已是晚期[3]。原發(fā)灶NSCLC細(xì)胞易擴(kuò)散至淋巴結(jié)、對(duì)側(cè)肺和遠(yuǎn)處器官（如骨、腦和肝），這些器官對(duì)最初的抗腫瘤治療反應(yīng)低，治療后復(fù)發(fā)頻率高，患者生存率低，預(yù)后惡劣[4]。

中醫(yī)藥在治療肺癌方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。固本解毒方為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院樸炳奎教授治療肺癌的經(jīng)驗(yàn)方，長(zhǎng)期臨床實(shí)踐表明其療效確切，但其作用機(jī)制尚未闡明[5-6]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，結(jié)合分子對(duì)接和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討固本解毒方治療肺癌的有效活性成分和作用靶點(diǎn)，為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 固本解毒方活性成分篩選

通過(guò)TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和本草組鑒（HERB，http://herb.ac.cn/）搜索固本解毒方藥物北沙參、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、牛膝、黃芪、補(bǔ)骨脂、當(dāng)歸、太子參、半枝蓮、土茯苓、白花蛇舌草、桔梗、甘草成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18[7]為條件篩選，獲得固本解毒方活性成分。

1.2 固本解毒方藥物靶點(diǎn)篩選

利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[8]下載藥物活性成分的2D結(jié)構(gòu)，上傳至SwissTargetPrediction數(shù) 據(jù) 庫(kù) （http://www.swisstargetprediction.ch/）[9]預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）[10]，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選

以“Lung cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），選取GSE136043數(shù)據(jù)集，以Padj<0.05且log2<-1或log2>1為條件篩選肺癌差異表達(dá)基因。同時(shí)，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）[11]、OMIM（https://omim.org/）[12]、Malacards（https://www.malacards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，得到肺癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)，合并去重，輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

使用Venny2.1.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將固本解毒方藥物靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)取交集，交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）[13]構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，可信度>0.9，隱藏孤立蛋白，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，將PPI網(wǎng)絡(luò)TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化，并利用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)度中心度（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），以大于2倍中位數(shù)篩選網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)[14]。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）[15]對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，GO分析包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組 分 （cellular component，CC） 和 分 子 功 能（molecular function，MF）。

1.6 分子對(duì)接

從RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）[16]和ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)（http://zinc.docking.org/）[17]下載受體的晶體結(jié)構(gòu)和配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用AutoDock Vina[18]軟件進(jìn)行分子對(duì)接，評(píng)價(jià)固本解毒方主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度與活性。結(jié)合能<0時(shí)配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定，能量越低其結(jié)合的可能性越大，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol時(shí)成分與靶點(diǎn)具有良好的親和力，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol時(shí)具有很好的親和力[19]。選擇最低結(jié)合能模型通過(guò)PyMOL2.4.0軟件進(jìn)行可視化分析。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 細(xì)胞和動(dòng)物

人肺腺癌A549 細(xì)胞，美國(guó)克利夫蘭州立大學(xué)Aimin Zhou實(shí)驗(yàn)室提供。SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2017-0005，飼養(yǎng)于北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)均經(jīng)北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（BJLA2020-08）。

1.7.2 藥物、試劑和儀器

固本解毒方（北沙參20 g，桔梗9 g，黃芪30 g，當(dāng)歸10 g，續(xù)斷10 g，骨碎補(bǔ)10 g，牛膝10 g，補(bǔ)骨脂10 g，太子參15 g，半枝蓮20 g、土茯苓20 g，白花蛇舌草15 g，甘草6 g）飲片，購(gòu)自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥房，經(jīng)王景紅主任藥師鑒定符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。RPMI1640培養(yǎng)基，中國(guó)北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)31800；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清，Hyclone 公司，批號(hào)分別為SH30042.01、SH30070.03；M5 HiPer MTT/細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，中國(guó)北京聚合美生物科技有限公司，批號(hào)MF837-01；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白預(yù)染Marker，中國(guó)北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為CW0014S、CW2841S；Goat Anti-rabbit IgG/HRP，中國(guó)北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)SE134；PVDF膜，德國(guó)Merck Millipore公司；蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、糖原合成酶激酶（GSK）-3β、p-GSK-3β抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)分別為4691T、4060T、12456T、9323T；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax），美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)sc-7480；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2），英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab182858。Nis-Elements D 2.30軟件（Nikon），680 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀、DYY-6C型電泳儀電源（北京六一儀器廠）。

1.7.3 含藥血清制備及細(xì)胞分組

根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算比值[20]計(jì)算大鼠每日用藥劑量為原藥材20 g/kg，常規(guī)水煎濃縮至含原藥材1.25 g/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠隨機(jī)分為給藥組和空白組，給藥組給予固本解毒方灌胃，空白組給予等量生理鹽水，每日2次，連續(xù)5 d。末次灌胃后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，3 500 r/min 離心10 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

A549 細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1% 雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同劑量固本解毒方含藥血清對(duì)細(xì)胞存活率的影響，將后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為正常血清組（10%空白血清）及固本解毒方高、中、低劑量組（10%、5%、2.5%含藥血清）。

1.7.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率

收集生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)/mL，每孔 100 μL，接種于 96 孔板。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用正常血清（正常組）和固本解毒方含藥血清（實(shí)驗(yàn)組）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸去上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入Formazan溶解液110 μL，置于搖床上，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量各孔吸光度（OD值）。

1.7.5 Wetern blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，分別加入正常血清和10%、5%、2.5%固本解毒方含藥血清，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后提取總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Bax、Bcl2、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β 一抗（均以1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，TBST沖洗3次，每次5 min，加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST沖洗3次，每次5 min，顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描各條帶灰度值，用Image J軟件進(jìn)行處理，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，多組間兩兩比較采用Dunnett-t法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 固本解毒方活性成分

篩選得到固本解毒方活性成分237種，其中北沙參8種、續(xù)斷8種、骨碎補(bǔ)18種、牛膝20種、黃芪20種、當(dāng)歸2種、太子參8種、半枝蓮25種、土茯苓14種、白花蛇舌草7種、桔梗7種、甘草92種、補(bǔ)骨脂8種，主要活性成分有kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、quercetin（槲皮素）、stigmasterol（豆甾醇）、sitosterol（谷甾醇）、eriodictyol（圣草酚）、luteolin（木犀草素）、wogonin（漢黃芩素）、baicalein（黃芩素）、baicalin（黃芩苷）等。

2.2 固本解毒方藥物靶點(diǎn)和肺癌疾病靶點(diǎn)

固本解毒方237種活性成分不重復(fù)作用靶點(diǎn)共有889個(gè)。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE136043數(shù)據(jù)集中肺癌差異表達(dá)基因火山圖見(jiàn)圖1。篩選到1 821個(gè)差異表達(dá)基因，合并GeneCards、OMIM、Malacards數(shù)據(jù)庫(kù)，共收集到不重復(fù)的疾病靶點(diǎn)20 442個(gè)。

圖1 GSE136043數(shù)據(jù)集肺癌差異表達(dá)基因火山圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)

固本解毒方與肺癌交集靶點(diǎn)880個(gè)。交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。使用cytoNCA 插件計(jì)算DC、BC、CC，以大于2 倍中位數(shù)（DC≥79，BC≥2 208.1，CC≥0.5）篩選得到核心靶點(diǎn)AKT1、EGFR、TNF、IL6、STAT3、PIK3CA、mTOR等，見(jiàn)圖3。

圖2 固本解毒方治療肺癌靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 固本解毒方治療肺癌核心靶點(diǎn)

2.4 核心靶點(diǎn)GO和KEGG通路富集分析

固本解毒方治療肺癌GO富集分析結(jié)果見(jiàn)圖4。其中，BP主要富集在肽基絲氨酸/酪氨酸磷酸化和增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)，CC主要富集在質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的外部成分，MF主要富集在蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸酶活性、ATP結(jié)合盒等。KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖5。神經(jīng)活性配體-受體相互作用、癌癥相關(guān)通路、PI3KAkt 信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、凋亡相關(guān)通路顯著性較好，提示固本解毒方可能通過(guò)這些信號(hào)通路抑制肺癌。尤其是PI3K-Akt信號(hào)通路顯著性好，富集的靶點(diǎn)多，見(jiàn)圖6。

圖4 固本解毒方治療肺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析

圖5 固本解毒方治療肺癌核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

圖6 固本解毒方治療肺癌PI3K-Akt信號(hào)通路

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

將固本解毒方主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能見(jiàn)表1。固本解毒方主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有較好的對(duì)接效果，其中多個(gè)成分與AKT1、PIK3CA的結(jié)合能均較低，提示藥物可能通過(guò)AKT1、PIK3CA發(fā)揮作用。

表1 固本解毒方治療肺癌主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能（kcal/mol）

進(jìn)一步挑選結(jié)合能低的最優(yōu)構(gòu)象進(jìn)行可視化，結(jié)果見(jiàn)圖7。stigmasterol（豆甾醇）與AKT1 活性位點(diǎn)TYR-175 等形成氫鍵作用力，Inophyllum_E 與PIK3CA 的活性位點(diǎn)ARG-662 等形成氫鍵作用力，Inophyllum_E 與 GSK3β 的 活 性 位 點(diǎn) PRO-136、VAL-135、TYR-134等形成氫鍵作用力。

圖7 固本解毒方治療肺癌主要靶點(diǎn)與活性成分分子對(duì)接示意

主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果表明，AKT1、PIK3CA、GSK3β可能是固本解毒方的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.6 固本解毒方對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

與正常組比較，不同劑量（2.5%、5%、10%、20%、40%）固本解毒方含藥血清處理A549細(xì)胞24 h，A549細(xì)胞存活率受到抑制，并呈一定的劑量依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)圖8。為排除固本解毒方含藥血清毒性對(duì)細(xì)胞的影響，選擇10%、5%、2.5%含藥血清作為高、中、低劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8 固本解毒方對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

2.7 固本解毒方對(duì)肺癌A549 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2表達(dá)的影響

結(jié)合GO 和KEGG 通路富集分析結(jié)果，采用Western blot檢測(cè)固本解毒方對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。與正常血清組比較，固本解毒方組A549細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.001）。

圖9 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl2蛋白表達(dá)免疫印跡

2.8 固本解毒方對(duì)肺癌A549 細(xì)胞PI3K-Akt 通路蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot 檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證固本解毒方對(duì)A549 細(xì)胞 PI3K-Akt 信號(hào)通路 Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。與正常血清組比較，固本解毒方組A549 細(xì)胞p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β 表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。表明固本解毒方通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路治療肺癌。

圖10 各組A549細(xì)胞p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達(dá)免疫印跡

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，對(duì)藥理學(xué)和生物信息學(xué)進(jìn)行結(jié)合的產(chǎn)物[21]。與以往的單成分、單靶點(diǎn)思維不同，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)認(rèn)為，藥物在體內(nèi)的過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)，即多成分-多靶點(diǎn)-多途徑作用過(guò)程，藥物通過(guò)多靶點(diǎn)間的相互作用產(chǎn)生增效減毒效果，符合中醫(yī)整體觀念，更適用于對(duì)具有復(fù)雜特性的中藥復(fù)方進(jìn)行分析[22-23]。

本研究篩選得到固本解毒方活性成分237 種，kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、quercetin（槲皮素）、baicalin（黃芩苷）等為主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，方中諸藥通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞本身的增殖和調(diào)控腫瘤免疫抑制微環(huán)境（tumor immunosuppressive microenvironment，TIM）的穩(wěn)態(tài)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)[24-26]。山柰酚能抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，可能與下調(diào)UBF的磷酸化水平影響rDNA的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[27]。β-谷甾醇引起G2/M期細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡[28]。槲皮素是一種可以預(yù)防肺癌等多種腫瘤的抗氧化類(lèi)黃酮化合物，研究表明，其可能通過(guò)Stat3/Mcl-1途徑介導(dǎo)肺癌PC9/GR細(xì)胞凋亡[29]。黃芩苷通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞復(fù)極化為M1樣巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)腫瘤中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制肝細(xì)胞癌模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)[30]。

本研究顯示，固本解毒方治療肺癌的核心靶點(diǎn)有AKT1、 PIK3CA、 EGFR、 TNF、 IL6、 STAT3、mTOR，主要通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路，富集在蛋白酪氨酸激酶活性、增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等過(guò)程。這些靶點(diǎn)及通路在中醫(yī)藥調(diào)節(jié)TIM方面發(fā)揮重要作用。有研究顯示，肺瘤平膏及其有效組分桔梗皂苷D通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-AKT-mTOR通路改善TDCs脂質(zhì)異常堆積和抗原呈遞功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，進(jìn)而發(fā)揮抑瘤效應(yīng)[31-33]。Yim 等[34]發(fā)現(xiàn)，桔梗苷通過(guò)AMPK/mTOR/AKT信號(hào)介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞的死亡。Li等[35]研究表明，中藥配方通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路，抑制免疫抑制細(xì)胞因子的激活和免疫逃逸以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，顯著抑制黑色素瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。Bcl-2家族包含促凋亡蛋白及抗凋亡蛋白兩大類(lèi)，Bax主要通過(guò)升高線粒體膜通透性和促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放而起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，而B(niǎo)cl-2主要通過(guò)減少線粒體細(xì)胞色素C 的釋放而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[36-38]。Aghvami等[39]研究表明，苦參堿在急性淋巴細(xì)胞白血病B淋巴細(xì)胞中上調(diào)促凋亡蛋白Bax，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2。髓源性抑制細(xì)胞通過(guò)激活TGF-β、EGF和HGF信號(hào)通路，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[40]?；谘逅幚韺W(xué)方法，Chen等[41]發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤湯含藥血清通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)IL-2和TNF-α的產(chǎn)生，顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該結(jié)果與其以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)結(jié)果一致，表明血清藥理學(xué)是評(píng)價(jià)扶正固本中藥抗腫瘤作用的一種合理可行的方法。本研究分子對(duì)接結(jié)果表明，固本解毒方主要活性成分與AKT1、PIK3CA、GSK3β均有很好的結(jié)合力。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固本解毒方含藥血清可顯著降低Bcl2、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β表達(dá)水平。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，分析固本解毒方治療肺癌的作用機(jī)制，并利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步驗(yàn)證，PI3K-Akt信號(hào)通路可能是固本解毒方抗肺癌的關(guān)鍵通路，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供思路。