周霖，王肖輝，孫志薛連平金建文，武婧，李曉靜鄭天元張曉堅(jiān)（.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 50052；2.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 0000；.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，鄭州 50052；.陜西麗彩藥業(yè)有限公司，陜西 咸陽 72000）

藤黃健骨膠囊的組方藥材包括骨碎補(bǔ)、淫羊藿、鹿銜草、肉蓯蓉、熟地黃、雞血藤和萊菔子，是在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下經(jīng)現(xiàn)代工藝提取加工而成的中藥復(fù)方制劑[1]，具有補(bǔ)腎、活血、止痛等功效，常用于臨床治療骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等骨質(zhì)性疾病以及風(fēng)濕類疾病，療效確切且應(yīng)用廣泛[2―4]。

質(zhì)量穩(wěn)定性是中藥應(yīng)用安全、有效的前提，然而大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)僅對中藥及其復(fù)方中個(gè)別含量較大的成分進(jìn)行了規(guī)定，忽略了其他成分對質(zhì)量的影響，致使無法從整體上有效控制中藥及復(fù)方的質(zhì)量[5―7]。本課題組前期采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對20批藤黃健骨膠囊的質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，經(jīng)主成分分析發(fā)現(xiàn)，其整體質(zhì)量較為穩(wěn)定，但存在明顯的批間差異；進(jìn)一步的偏最小二乘法-判別分析結(jié)果表明，對藥物質(zhì)量差異影響較大的差異性成分有琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素和原兒茶酸。前期研究雖為藤黃健骨膠囊的質(zhì)控提升奠定了基礎(chǔ)，但并未對上述差異性成分的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測定，無法實(shí)現(xiàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的整體量化。此外，在藤黃健骨膠囊治療疾病時(shí)，上述差異性成分是如何相互配合以及通過哪些重要通路治療相關(guān)疾病的，也是當(dāng)前尚未解決的問題。

因此，為解決以上關(guān)鍵科學(xué)問題，本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）法建立快速、科學(xué)、準(zhǔn)確的一級全掃描定量分析方法，對藤黃健骨膠囊中的7種主要差異性成分（以下稱“質(zhì)控成分”）進(jìn)行含量測定；同時(shí)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對各質(zhì)控成分的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和信號通路進(jìn)行分析，挖掘各成分在骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等骨質(zhì)性疾病以及風(fēng)濕類疾病治療中的潛在作用，為全面闡明藤黃健骨膠囊質(zhì)控成分的科學(xué)內(nèi)涵提供新思路，同時(shí)為進(jìn)一步提升其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Q-Exactive型超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）、New Classic MS型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、BX7200HP型臺式超聲波清洗器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

對照品琥珀酸（批號MUST-17030502）、金絲桃苷（批號MUST-16032113）、沒食子酸（批號MUST-18032801）、山柰酚（批號MUST-16032801）、柚皮苷（批號MUST-18050808）、柚皮素（批號MUST-16032406）和原兒茶酸（批號MUST-16032112）均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均大于99%。甲酸、乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

藤黃健骨膠囊（批號分別為170401、170901、170802、180108、180504、180106、170703、170407、170408、170103、170505、170702、170902、180408、170701、170201、180107、170202、170903、180104，編號為S1～S20，規(guī)格為每粒裝0.25 g）均購自麗彩甘肅西峰制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)控成分的定量分析

2.1.1 混合對照品儲備液的制備 分別精密稱取琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、原兒茶酸質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，山柰酚、柚皮素質(zhì)量濃度均為20 μg/mL，柚皮苷質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的單一對照品母液。量取各單一對照品母液適量，加甲醇定容至1 mL，制得琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸質(zhì)量濃度分別為20.45、6.07、10.93、0.55、52.66、0.50、19.47 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取藤黃健骨膠囊內(nèi)容物1.0 g，置于錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）輔助溶解20 min，放冷后，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件與質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：以ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～1.5 min，5%A；1.5～3.0 min，5%A～20%A；3.0～7.0 min，20%A～100%A；7.0～10.0 min，100%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

（2）質(zhì)譜條件：離子源為加熱電噴霧離子源，離子傳輸管溫度為320 ℃；輔助氣溫度為300 ℃，輔助氣流速為10 μL/min；正離子模式下的鞘氣流速為 40 μL/min，噴霧電壓為3.50 kV；負(fù)離子模式下的鞘氣流速為38 μL/min，噴霧電壓為2.80 kV；掃描范圍為m/z80～1 200，一級掃描分辨率為70 000。琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸用于定量的一級質(zhì)譜信息為m/z117.019、463.088、169.014、287.055、579.171、273.075、153.019。

2.1.4 方法學(xué)考察 （1）專屬性考察：取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品儲備液、“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號S20）和空白溶液（甲醇），按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，空白溶液對待測成分無干擾，且供試品溶液中7種質(zhì)控成分的出峰時(shí)間與各對照品的出峰時(shí)間基本一致，說明方法專屬性較好（見圖1，空白溶液圖略）。

（2）線性關(guān)系、定量限和檢測限考察：分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品儲備液適量，用甲醇稀釋并定容，依次配制成5個(gè)質(zhì)量濃度的系列工作溶液，其中琥珀酸分別為0.64、1.28、2.56、5.11、10.23 μg/mL，金絲桃苷分別為0.19、0.38、0.76、1.52、3.04 μg/mL，沒食子酸分別為0.34、0.68、1.37、2.73、5.46 μg/mL，山柰酚分別為0.02、0.03、0.07、0.14、0.27 μg/mL，柚皮苷分別為1.65、3.29、6.58、13.17、26.33 μg/mL，柚皮素分別為0.02、0.03、0.06、0.12、0.25 μg/mL，原兒茶酸分別為0.61、1.22、2.43、4.87、9.74 μg/mL。取上述系列工作溶液和混合對照品儲備液，按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以各待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，并以信噪比10∶1確定定量限，以信噪比3∶1確定檢測限。結(jié)果（表1）顯示，7種質(zhì)控成分在各自檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積有良好的線性關(guān)系（r≥0.999 0），定量限為 0.004～0.901 ng/mL，檢測限為0.001～0.270 ng/mL。

表1 7種質(zhì)控成分的回歸方程、線性范圍和定量限

（3）精密度考察：取供試品溶液（編號S20），按“2.1.3”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸峰面積的RSD分別為1.89%、1.55%、2.32%、1.56%、2.94%、2.08%、0.40%（n＝6），表明方法精密度良好。

（4）重復(fù)性考察：取藤黃健骨膠囊樣品（編號S20），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸含量的RSD分別為1.74%、1.00%、1.14%、1.67%、1.24%、1.94%、1.75%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

（5）穩(wěn)定性考察：取供試品溶液（編號S20），分別于室溫下放置0、2、6、10、12、24 h時(shí)按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸峰面積的RSD分別為0.89%、1.50%、1.98%、2.90%、2.53%、1.72%、0.42%（n＝6），表明供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（6）加樣回收率考察：稱取已知含量的藤黃健骨膠囊內(nèi)容物（編號S20）共9份（每3份為1組），每份約0.5 g。分別按照已知量的50%、100%、150%加入“2.1.1”項(xiàng)下各單一對照品母液適量，加甲醇至50 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸的平均加樣回收率分別為96.77%、98.58%、100.66%、97.99%、98.54%、102.08%、97.61%，RSD分別為2.83%、0.82%、3.42%、3.92%、2.46%、2.28%、3.84%（n＝9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

（7）樣品含量測定：取20批藤黃健骨膠囊內(nèi)容物，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，每批3份，按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果（表2）顯示，20批藤黃健骨膠囊中琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸的平均含量分別為 520.92、67.67、129.48、4.74、397.45、5.66、376.62 μg/g。

表2 7種質(zhì)控成分的測定結(jié)果（n＝3，μg/g）

2.2 質(zhì)控成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 作用靶點(diǎn)的獲取 結(jié)合PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、SwissTarget‐Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和STITCH數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/）3個(gè)權(quán)威網(wǎng)站預(yù)測琥珀酸（succinic acid）、金絲桃苷（hyperoside）、沒食子酸（gallic acid）、山柰酚（kaempferol）、柚皮苷（narin‐gin）、柚皮素（naringenin）、原兒茶酸（protocatechuic acid）的作用靶點(diǎn)，共獲得662個(gè)作用靶點(diǎn)（包括重復(fù)靶點(diǎn)）。

2.2.2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建上述7種質(zhì)控成分的“成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2），刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，該網(wǎng)絡(luò)包含364個(gè)節(jié)點(diǎn)和662條邊。以中位度值的2倍為篩選條件[8]，獲得62個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)；頻數(shù)較高的靶點(diǎn)基因包括AKT1、TNF、VEGFA、MMP9、PTGS2、CD4、IL2、MMP2等，這些基因與免疫炎癥、疼痛、血管增生以及骨性疾病等密切相關(guān)[9―12]。

2.2.3 京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫通路富集分析 將篩選到的62個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，共得到44條通路，經(jīng)重要性（P值）排序，其中排名前20位的重要通路分別為細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞核因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素17、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Toll樣受體等。由此可見，質(zhì)控成分對應(yīng)的靶點(diǎn)基因主要富集于炎癥方面的信號通路上，這些通路與骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病密切相關(guān)，與藤黃健骨膠囊的主治疾病契合度較高，表明了本研究對琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸等成分進(jìn)行定量分析的科學(xué)性和合理性。

2.2.4 基因本體生物過程富集分析 將篩選到的62個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物過程富集分析，從生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)層面進(jìn)行注釋。GO生物過程富集分析結(jié)果顯示，62個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)主要富集在264個(gè)生物過程、69種細(xì)胞組分和60種分子功能上。琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸等成分的生物過程主要涉及炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化等；這些靶點(diǎn)在細(xì)胞組分中與胞質(zhì)、胞膜以及胞核等相關(guān)性較大；在分子功能中與酶活性、能量活性、生長因子活性、炎癥因子活性等高度相關(guān)。

3 討論

3.1 前處理方法優(yōu)化

本課題組前期考察了不同提取方法（超聲提取、微波萃取和回流提取）對供試品提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用超聲提取時(shí)，樣品中各質(zhì)控成分的色譜響應(yīng)值最高且出峰穩(wěn)定；而在微波萃取、回流提取條件下，各成分響應(yīng)值較低，有些成分甚至出現(xiàn)缺失現(xiàn)象，峰形較差，分離效果不佳。其原因可能為藥物中成分對溫度較為敏感，微波萃取和回流提取在溫度過高時(shí)可能破壞其結(jié)構(gòu)。因此，本研究采用超聲提取法制備供試品溶液。

3.2 質(zhì)控成分含量分析

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同批次藤黃健骨膠囊中各質(zhì)控成分的含量具有一定的差異。這可能與藥物生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有關(guān)，如：原藥材的產(chǎn)地不同，原藥材的采收季節(jié)不同或者原藥材有效成分的提取方法、工藝差異等。上述因素均有可能導(dǎo)致藥物有效成分含量的變化，提示相關(guān)生產(chǎn)廠家在重點(diǎn)環(huán)節(jié)應(yīng)優(yōu)化質(zhì)控方法及標(biāo)準(zhǔn)，保證原藥材及制劑質(zhì)量的均一性。

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

本研究基于關(guān)鍵質(zhì)控成分進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以期能夠挖掘藤黃健骨膠囊治療疾病的潛在機(jī)制。研究結(jié)果表明，該制劑中的7種質(zhì)控成分主要作用于AKT1、TNF、VEGFA等炎癥和血管因子關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而映射到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Toll樣受體等骨性疾病相關(guān)炎癥通路，表明上述質(zhì)控成分可能是制劑質(zhì)量控制和療效發(fā)揮的關(guān)鍵成分。

實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)表明，山柰酚具有明顯的抗生育、抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化以及抗血小板的作用[13―14]，是該藥補(bǔ)腎壯骨、活血功效的重要活性成分之一；柚皮苷及柚皮素具有骨保護(hù)和促進(jìn)骨生長的作用[15]；金絲桃苷具有抗血栓的作用[16]，琥珀酸具有鎮(zhèn)痛的作用[17]；沒食子酸、原兒茶酸具有抗炎的作用[18―19]。以上質(zhì)控成分在藤黃健骨膠囊治療骨性疾病的過程中可從不同角度發(fā)揮著抗炎、緩解疼痛、促進(jìn)骨形成、防止骨質(zhì)丟失等骨保護(hù)作用。

綜上所述，本研究建立的方法可用于藤黃健骨膠囊質(zhì)控成分的定量分析，為藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和提升奠定了前期基礎(chǔ)；同時(shí)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，藤黃健骨膠囊的7種質(zhì)控成分可能通過作用于AKT1、TNF、VEGFA等炎癥和血管因子關(guān)鍵靶點(diǎn)，繼而調(diào)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Toll樣受體等骨性疾病相關(guān)炎癥通路，最終發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛及健骨等作用。