石佳楠，宋信莉，劉興德，陳歡歡，楊小雙，楊勝磊，沈 麗，萬開龍（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/國家苗藥工程技術(shù)研究中心/貴州中藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）是一種受多種細(xì)胞和細(xì)胞成分影響的下呼吸道異質(zhì)性慢性炎癥性疾病[1]。BA發(fā)病因素較多，主要包括感染、粉塵、自身免疫等，可反復(fù)出現(xiàn)喘息、咳嗽、胸悶和呼吸急促等癥狀，具有病程長、癥狀易反復(fù)、難以根治的特點(diǎn)[2]。若該疾病反復(fù)發(fā)作，極易引發(fā)心血管疾病及肺疾病等嚴(yán)重并發(fā)癥，對患者健康造成較大的威脅，對社會(huì)造成巨大的疾病負(fù)擔(dān)，因此，該疾病也被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為四大頑癥之一[3]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療BA主要以藥物為主，如支氣管β2腎上腺素受體激動(dòng)劑、抗膽堿藥、茶堿類和激素類藥物等。這些藥物雖然能在一定程度上緩解病情，但難以從整體上實(shí)現(xiàn)根本性治療，且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)藥對哮喘的控制效果尚不理想，仍易反復(fù)發(fā)作[4―5]。

白芥子始載于《名醫(yī)別錄》，被列為上品，其味辛，性溫，無毒，入肺經(jīng)，具有溫肺豁痰利氣、散結(jié)通絡(luò)止痛之功[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，將白芥子于穴位外用可有效治療BA[7―9]?，F(xiàn)代研究表明，白芥子中的芥子堿是抗BA的主要活性成分，其主要存在形式為芥子堿硫氰酸鹽（sinapine thiocyanate，ST）[10]?？扇苄晕⑨槪╠issoluble microneedle，DMN）是一種新型透皮給藥制劑，可突破角質(zhì)層障礙，使藥物在真皮層中釋放，從而解決傳統(tǒng)穴位外用時(shí)大分子化合物或親水性化合物難以透過角質(zhì)層的問題[11]。基于此，本課題組將ST與DMN技術(shù)相結(jié)合，制備芥子堿硫氰酸鹽可溶性微針（ST-DMN），并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，篩選ST治療哮喘的作用靶點(diǎn)，然后將ST-DMN穴位給藥BA模型大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為后續(xù)ST-DMN的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有微針模具（臺州薇凱生物科技有限公司）、AUY220型萬分之一電子天平（日本Shi‐madzu公司）、AE/240型十萬分之一電子天平（瑞士Met‐tler Toledo公司）、TD5A-120型臺式低速離心機(jī)（常州金壇良友儀器有限公司）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SPX-70BⅢ型生化培養(yǎng)箱[菲斯福儀器（河北）有限公司]、Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、402A1型超聲霧化器（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

ST-DMN由本課題組自制；白芥子散敷貼劑（批號20210720）購自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；氫氧化鋁佐劑（批號77161）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；卵清蛋白（批號MB1815）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；戊巴比妥鈉（批號P3761）購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（批號20210911）購自北京索萊寶科技有限公司；前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白細(xì)胞介素 2（interleukin-2，IL-2）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為E-EL-R3021、E-EL-R0792c、E-EL-R0013c）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮K30（批號BSF190822）購自合肥巴斯夫生物科技有限公司；硫酸軟骨素（批號20191028）購自江蘇鑫瑞生物科技有限公司；聚乙烯醇（批號P21501215）購自山東優(yōu)索化工科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量為（220±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0008。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循貴州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，且均符合3R原則。

2 方法

2.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)篩選ST抗BA的作用靶點(diǎn)

2.1.1 獲取ST靶點(diǎn) 將ST的“sdf”結(jié)構(gòu)輸入Pharm‐Mapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行初步的靶點(diǎn)預(yù)測，再將這2個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)取并集，然后將取并集后的靶點(diǎn)（即ST的預(yù)測靶點(diǎn)）輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中獲取標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

2.1.2 獲取BA靶點(diǎn) 將“asthma”“bronchial asthma”分別輸入TTD（http：//db.idrblab.net/web/search/combination）、Genecard（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、Drug Bank（https：//www.drugbank.com/）、Disgenet（https：//www.disgenet.org/search）數(shù)據(jù)庫并以相關(guān)性分?jǐn)?shù)的中位值進(jìn)行篩選，將篩選的靶點(diǎn)（即BA疾病靶點(diǎn)）輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫中獲取標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

2.1.3 篩選ST與BA的共同靶點(diǎn) 將ST的靶點(diǎn)與BA的靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Venny在線網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，取交集后，即為ST與BA的共同靶點(diǎn)。

2.1.4 構(gòu)建ST與BA的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將ST和BA的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.stringdb.org/），設(shè)置物種為“homo sapiens”，置信度為“medium confidence≥0.4”，繪制蛋白相互作用（protein-protein in‐teraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，然后利用Cytoscape 3.9.0軟件根據(jù)degree值大小篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而確定ST抗BA的核心靶點(diǎn)。

2.1.5 ST與核心靶點(diǎn)的分子對接 將PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前3位的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.pdbus.org/），下載核心靶點(diǎn)“pdb”格式文件。在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中下載ST的“mol2”文件，然后采用Pymol、AutoDock軟件將核心靶點(diǎn)和ST進(jìn)行去水、加氫等預(yù)處理，再通過AutoDock軟件進(jìn)行分子對接和結(jié)合能的計(jì)算。

2.2 ST-DMN抗BA的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)篩選的ST抗BA核心靶點(diǎn)進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證。

2.2.1 ST-DMN的制備 根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法制備ST-DMN[12]。將硫酸軟骨素-聚乙烯吡咯烷酮K30（1∶1，m/m）作為針尖材料充分溶脹于ST水溶液（10 mg/mL）中，然后澆筑在微針模具凹槽表面，再以4 000 r/min離心10 min使其完全填充；刮去多余基質(zhì)，于干燥器中干燥30 min，作為針尖層；將以ST水溶液充分溶脹的15%聚乙烯醇作為背襯材料，澆筑于上述已填充好針尖層的模具中，以4 000 r/min離心10 min后，于干燥器中干燥24 h，脫模，即得ST載藥量為1 mg/片的ST-DMN。同法制備不載藥的空白微針。

2.2.2 分組、造模與給藥 將30只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、空白微針組、白芥子散敷貼組（陽性對照組）、ST-DMN組，每組6只。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白對照組腹腔注射生理鹽水外，其余各組大鼠分別于第1、8天腹腔注射10%卵清蛋白（含氫氧化鋁佐劑）1 mL致敏，于第15天開始每天霧化吸入1%卵清蛋白，每次30 min，持續(xù)4周進(jìn)行激發(fā)哮喘，以復(fù)制BA模型[13]。當(dāng)大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、抓耳撓腮等行為時(shí)，表明造模成功。各組大鼠于每次霧化后進(jìn)行給藥：空白對照組不處理；模型對照組于大鼠肺俞穴和大椎穴脫毛處理后涂抹生理鹽水；空白微針組、白芥子散敷貼組、ST-DMN組大鼠于相同穴位分別給予空白微針、白芥子散（涂抹面積為1 cm2，給藥量為1.5 g）、STDMN（2個(gè)穴位共給了3片）處理，每天1次，連續(xù)28 d。

2.2.3 各組大鼠一般癥狀觀察及體質(zhì)量測定 分別在造模前1 d和造模后第7、14、21、28、35、42天記錄各組大鼠咳嗽、打噴嚏、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、抓耳撓腮、呼吸加快、毛發(fā)色澤的情況，并測量體質(zhì)量。

2.2.4 樣本采集 末次給藥后第2天，將大鼠麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血；血樣靜置1 h后，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采血完成后，將各組大鼠氣管暴露，用一次性注射器將2 mL磷酸鹽緩沖液緩慢注入氣管，用手輕輕按揉大鼠肺部，待充分灌洗后回抽緩沖液，反復(fù)進(jìn)行3次，即得支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。將BALF以3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以上操作完成后，處死大鼠，取肺組織，剪取右肺前葉，裝入EP管中，置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；取左肺，?%多聚甲醛溶液固定備用。

2.2.5 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取“2.2.4”項(xiàng)下各組大鼠固定于4%多聚甲醛溶液中的左肺組織，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.2.6 大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定 采用ELISA法進(jìn)行測定。取“2.2.4”項(xiàng)下各組大鼠血清、BALF和肺組織，嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法檢測其中PTGS2、MMP-9、IL-2的水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示。各組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dun‐nett’s T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 ST抗BA的作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果

3.1.1 ST靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 本研究在PharmMapper數(shù)據(jù)庫中得到ST靶點(diǎn)231個(gè)，在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中得到ST靶點(diǎn)100個(gè)，取并集后獲得258個(gè)ST靶點(diǎn)。

3.1.2 BA靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 通過TTD、Genecard、OMIM、Drug Bank、Disgenet數(shù)據(jù)庫對BA靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，刪除重復(fù)項(xiàng)后共獲取靶點(diǎn)677個(gè)。

3.1.3 ST與BA共同靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 將ST靶點(diǎn)與BA靶點(diǎn)共同導(dǎo)入Venny在線網(wǎng)站繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)70 個(gè)。

3.1.4 ST與BA的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）顯示，核心靶點(diǎn)排名前10位的蛋白分別為PTGS2、MMP-9、IL-2、EGFR（表皮生長因子受體）、HSP90AA1（熱休克蛋白90AA1）、ALB（白蛋白）、CCL5（趨化因子配體5）、MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14）、MTOR（雷帕霉素靶蛋白）、PGR（孕激素受體）。

3.1.5 ST與核心靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果 將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中degree值排名前3位的蛋白作為核心靶點(diǎn)，進(jìn)行ST與核心靶點(diǎn)的分子對接。結(jié)果顯示，ST與PTGS2、MMP-9、IL-2對接的結(jié)合能分別為－19.30、－22.44、－16.24 kJ/mol，提示ST與上述3種蛋白具有較好的結(jié)合活性[14]。

3.2 ST-DMN抗BA的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 大鼠一般癥狀觀察及體質(zhì)量測定結(jié)果 空白對照組大鼠狀態(tài)良好，毛色光澤，行為敏捷，呼吸平穩(wěn)，體質(zhì)量明顯增加。模型對照組和空白微針組大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、抓耳撓腮現(xiàn)象，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸減慢或節(jié)律不齊、四肢癱軟、行動(dòng)遲緩、體質(zhì)量明顯減輕、毛色失去光澤、反應(yīng)遲鈍現(xiàn)象。白芥子散敷貼組和ST-DMN組大鼠咳嗽減輕，毛色恢復(fù)，行為靈敏，呼吸平穩(wěn)，體質(zhì)量增加。

3.2.2 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 空白對照組大鼠肺組織各級支氣管結(jié)構(gòu)正常，肺泡上皮細(xì)胞正常，肺間質(zhì)未見明顯纖維組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤。模型對照組和空白微針組大鼠肺泡隔明顯增厚，肺泡上皮細(xì)胞增生，細(xì)胞成分增多，肺間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤。與模型對照組比較，白芥子散敷貼組和ST-DMN組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)、肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤等情況均得到不同程度的改善。結(jié)果見圖2。

3.2.3 大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組和空白微針組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，白芥子散敷貼組和ST-DMN組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。白芥子散敷貼組和ST-DMN組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；空白微針組與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定結(jié)果（±s，n＝6，pg/mL）

表1 各組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定結(jié)果（±s，n＝6，pg/mL）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05；c：與模型對照組比較，P＜0.01；d：與模型對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型對照組空白微針組白芥子散敷貼組ST-DMN組PTGS2 MMP-9 IL-2肺組織79.91±12.42 133.72±25.08b 117.97±27.87b 81.66±16.40d 86.15±20.47d血清749.83±71.40 2 402.08±220.71a 2 185.86±140.91a 1 194.49±109.60c 1 434.82±127.00c BALF 1 026.27±147.86 3 020.88±259.50a 2 684.92±210.92a 1 567.70±245.99c 2 041.84±267.62c肺組織1 956.47±201.54 7 430.86±754.64a 6 430.90±705.63a 3 641.04±521.86c 4 505.17±713.35c血清52.74±8.55 212.40±25.05a 177.96±17.81a 93.11±9.94c 112.43±10.54c BALF 132.75±28.77 306.75±37.61a 268.73±27.31a 185.40±24.96c 214.77±28.43c肺組織151.19±24.78 399.94±30.20a 374.86±20.09a 254.86±34.39c 298.66±29.81c血清55.41±9.16 93.40±10.79a 79.70±6.78a 60.34±7.00c 65.81±6.17c BALF 79.91±12.42 133.72±25.08b 117.97±27.87b 81.66±16.40d 86.15±20.47d

4 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)篩選ST抗BA的作用靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ST抗BA的核心靶點(diǎn)主要包括PTGS2、MMP-9、IL-2、EGFR、HSP90AA1等。其中，PTGS2也稱為環(huán)氧合酶2，是一種炎癥誘導(dǎo)酶，是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過程中的關(guān)鍵酶，主要參與炎癥反應(yīng)[15]。研究表明，PTGS2的激活可以導(dǎo)致哮喘的發(fā)生，抑制PTGS2可通過核因子κB信號通路發(fā)揮抗炎、抗哮喘作用[16]。MMP-9是MMP家族的成員，主要由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，也可由上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，是氣道壁重塑和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的關(guān)鍵媒介[17―18]。IL-2主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，主要功能是促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長、增殖和分化，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[19]。IL-2不僅能促進(jìn)體內(nèi)免疫球蛋白E的合成，還能誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量過氧化物，并使嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位趨化，從而破壞支氣管上皮，加重哮喘[20]。由此可知，本研究篩選出的3個(gè)核心靶點(diǎn)（PTGS2、MMP-9、IL-2）與BA均有著極大的關(guān)聯(lián)性，ST抗BA的作用可能與上述3個(gè)靶點(diǎn)有關(guān)。進(jìn)一步通過分子對接發(fā)現(xiàn)，ST與上述3個(gè)靶點(diǎn)之間的結(jié)合能均遠(yuǎn)小于－5.0 kJ/mol，表明ST與這3個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合能力較好。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的結(jié)果，本課題組進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討ST-DMN穴位給藥抗BA的藥效作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ST-DMN干預(yù)后，大鼠咳嗽減輕，毛色恢復(fù)，行為靈敏，呼吸平穩(wěn)，體質(zhì)量增加，肺組織結(jié)構(gòu)、肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤等病理變化均得到不同程度的改善，血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平均顯著降低，且效果與陽性對照組相當(dāng)。

綜上所述，ST-DMN穴位給藥抗BA的效果良好，其作用機(jī)制可能與下調(diào)血清、BALF、肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平有關(guān)。