黃倩，鄭丹丹，黃秋虹，施子祿（.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理教研室，福建 泉州 3600；.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 泉州 36000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一種糖尿病引起的以腎間質(zhì)發(fā)生纖維化為核心病理特征的微血管病變，也是導(dǎo)致糖尿病患者康復(fù)率低的重要原因之一[1]。已有研究證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是誘導(dǎo)腎間質(zhì)發(fā)生纖維化的關(guān)鍵步驟之一[2]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（Snail family transcriptional repressor 1，Snail1）和卵泡抑素樣蛋白1（follistatin-like protein 1，F(xiàn)stl1）、蛋白激酶B（pro‐tein kinase B，Akt）均在EMT中發(fā)揮重要作用[3－4]。

香豆素類衍生物蛇床子素（osthole，OST）廣泛分布于傘形科植物蛇床子中，在抗心肌纖維化[5]和肝臟纖維化[6]方面均有一定作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OST能有效預(yù)防單側(cè)輸尿管梗阻模型小鼠的腎間質(zhì)纖維化[7]，在此基礎(chǔ)上，OST在其他腎損傷中，特別是對(duì)DN腎間質(zhì)纖維化是否仍有預(yù)防作用值得進(jìn)一步研究。本研究選用OST對(duì)DN模型小鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥，觀察其對(duì)小鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，并對(duì)Fstl1/Akt/Snail1通路中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行測(cè)定，旨在為臨床篩選DN防治藥物提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括逸智F型羅氏逸智血糖儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司），5810R型高速冷凍式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），UVmini-1240型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司），VE-180型垂直電泳儀和Tanon-3500型全自動(dòng)凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

OST（純度≥95%，批號(hào)78889）和鏈脲佐菌素（純度≥98%，批號(hào)S0130）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；肌酐檢測(cè)試劑盒和尿素氮檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為700460-2、SKT-213-192）均購(gòu)于武漢艾美捷科技有限公司；尿蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)GD-VN9853）購(gòu)于上海古朵生物科技有限公司；Masson三色染色試劑盒（批號(hào)16071）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）免疫組化檢測(cè)試劑盒（批號(hào)GOY-Y1007）購(gòu)于上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；波形蛋白（vimentin）免疫組化檢測(cè)試劑盒（批號(hào)US-132）購(gòu)于上海研生生化試劑有限公司；兔抗大鼠Fstl1、Snail1、vimentin、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體和小鼠抗大鼠E-cadherin單克隆抗體（批號(hào)分別為ab232777、ab82846、ab137321、ab235958、ab8932、ab8227、ab76055）均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、小鼠免疫球蛋白G二抗（批號(hào)分別為A0208、A0216）均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康C57BL/6小鼠共50只，雄性，體質(zhì)量20～24 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。所有小鼠用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水，燈光照射12 h模擬晝夜交替循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)在泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

2 方法

2.1 DN造模

參考相關(guān)文獻(xiàn)[8－9]中的方法，先建立糖尿病小鼠模型，成功后繼續(xù)喂養(yǎng)12周，建立DN小鼠模型。具體操作如下：取40只小鼠按120 mg/kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（溶解于臨時(shí)配制的pH4.5、0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，無(wú)菌），自由飲食飲水，3 d后禁食6 h，斷尾取血測(cè)空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L判定為糖尿病造模成功。糖尿病模型小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)12周，測(cè)定24 h尿蛋白＞30 mg，則認(rèn)為DN造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的糖尿病模型小鼠隨機(jī)分為模型組和OST低、中、高劑量（20、40、80 mg/kg）組[7]，每組10只。另取10只未造模小鼠為正常對(duì)照組。各組小鼠于糖尿病造模成功后開始干預(yù)（灌胃處理），每日1次，持續(xù)12周。正常對(duì)照組和模型組小鼠僅灌胃等體積溶劑，OST各劑量組小鼠灌胃相應(yīng)劑量的OST，所有溶劑均為0.2%羧甲基纖維素鈉溶液。灌胃12周內(nèi)小鼠無(wú)死亡。

2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

各組小鼠末次灌胃24 h后，禁食6 h后斷尾取血測(cè)空腹血糖；收集小鼠24 h尿液和血清，按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定24 h尿蛋白、血肌酐（serum creatinine，Scr）和尿素氮水平。

2.4 腎間質(zhì)纖維化的觀察

收集各小鼠24 h尿液后，處死小鼠，取相同部位的腎皮質(zhì)，常規(guī)石蠟包埋、切片（3 μm），行Masson染色，光鏡下觀察腎間質(zhì)區(qū)域膠原纖維的沉積情況，使用Image J軟件對(duì)膠原纖維（染成藍(lán)色）進(jìn)行定量分析。

2.5 腎皮質(zhì)中E-cadherin和vimentin表達(dá)水平的檢測(cè)

取各組小鼠腎皮質(zhì)，經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片（3 μm）后，按免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行腎皮質(zhì)E-cadherin、vimentin染色，光鏡下觀察腎皮質(zhì)中E-cadherin和vimentin的分布并對(duì)結(jié)果進(jìn)行量化。每張切片任選5個(gè)視野拍照，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒且強(qiáng)度大于非特異性背景為陽(yáng)性表達(dá)，使用Image Pro-Plus 6軟件測(cè)量陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的平均光密度（IOD）。

2.6 腎皮質(zhì)中 Fstl1、Akt、p-Akt和 Snail1 蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取各組小鼠腎皮質(zhì)100 mg，適當(dāng)研磨后制成勻漿，12 000 r/min離心30 min后收集上清。采用二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度，加熱煮沸變性5 min，按每孔100 μg蛋白樣品上樣，隨后電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；洗膜后加入相應(yīng)一抗（Fstl1 的質(zhì)量濃度為 1 μg/mL，Akt、p-Akt、Snail1和β-actin的稀釋比例分別為1∶3 000、1∶5 000、1∶500、1∶1 000），4 ℃過(guò)夜孵育；洗膜后加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶2 000），室溫孵育1 h，顯影、成像。使用Image J軟件分析蛋白條帶的光密度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin的光密度比值反映目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，以p-Akt與Akt的光密度比值反映Akt的磷酸化水平，并進(jìn)行歸一化處理。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 OST對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、Scr和尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，OST各劑量組小鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、Scr和尿素氮水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 OST對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響（±s，n＝10）

表1 OST對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響（±s，n＝10）

a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組OST低劑量組OST中劑量組OST高劑量組空腹血糖/（mmol/L）5.45±1.23 27.43±3.64a 24.12±2.28b 20.27±2.63b 17.73±1.96c 24 h尿蛋白/（μg/d）10.78±0.23 32.21±1.65a 28.75±1.12b 26.65±1.33b 21.79±1.09c Scr/（μmol/L）7.50±1.28 22.60±3.62a 17.54±2.47b 14.91±1.94b 10.53±1.85c尿素氮/（mmol/L）12.43±1.42 34.15±4.62a 29.86±3.75b 26.72±3.21b 20.53±3.05c

3.2 OST對(duì)小鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

正常對(duì)照組小鼠腎小管上皮細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，腎臟組織內(nèi)極少有膠原纖維分布，藍(lán)色較淡。模型組小鼠腎間質(zhì)膠原纖維增多，間質(zhì)內(nèi)有明顯藍(lán)色深染的膠原纖維，呈灶狀分布，且膠原纖維沉積占比顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。與模型組比較，OST各劑量組小鼠腎間質(zhì)藍(lán)色深染的膠原纖維沉積占比均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3 OST對(duì)小鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin和vimentin表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），vimentin表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，OST各劑量組小鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），vimentin表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

3.4 OST對(duì)小鼠腎皮質(zhì)中Fstl1/Akt/Snail1通路關(guān)鍵蛋白的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中Fstl1、Snail1蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt比值均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，OST各劑量組小鼠腎皮質(zhì)中Fstl1、Snail1蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

4 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，OST可以降低血糖、改善胰腺功能、緩解腎小球基底膜的增生、增強(qiáng)抗氧化酶活性[10]。OST可能是潛在的抗DN候選藥物?；诖耍狙芯靠疾霴ST預(yù)防性用藥對(duì)DN模型小鼠的影響，結(jié)果顯示，OST可以有效降低DN模型小鼠的空腹血糖、24 h尿蛋白、Scr和尿素氮水平，提示OST具有降血糖作用和保護(hù)腎功能的作用。Masson染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎間質(zhì)區(qū)域內(nèi)膠原纖維明顯增多，出現(xiàn)典型的腎間質(zhì)纖維化病理變化，而OST預(yù)防性用藥可明顯減少DN模型小鼠腎間質(zhì)區(qū)域膠原纖維的沉積，延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。

EMT是誘導(dǎo)DN腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵步驟之一，為了驗(yàn)證OST對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用，本研究對(duì)EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin和vimentin的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，vimentin表達(dá)顯著上調(diào)；OST預(yù)防性用藥12周后，E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，vimentin表達(dá)顯著下調(diào)，提示OST預(yù)防性用藥可有效延緩DN模型小鼠腎小管上皮細(xì)胞的EMT和腎間質(zhì)纖維化。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是啟動(dòng)腎小管EMT的重要細(xì)胞介質(zhì)[11]。減少TGF-β1或抑制其下游信號(hào)的表達(dá)可減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和改善實(shí)驗(yàn)性腎損傷動(dòng)物模型中纖維化的進(jìn)展[12]。Akt蛋白是TGF-β1信號(hào)通路的重要下游蛋白和信號(hào)分子[13]。Snail1是影響腎小管上皮細(xì)胞黏附性的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可直接下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，參與腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[14]。Fstl1是由TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種新型促纖維化因子，高表達(dá)于心、腎、肺和小腸等多個(gè)器官中[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中Fstl1、Snail1蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt比值均異常升高，表明Fstl1/Akt/Snail1通路參與了DN狀態(tài)下腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生；OST預(yù)防性用藥12周后，F(xiàn)stl1、Snail1蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt比值均顯著降低，提示OST預(yù)防性用藥可以抑制DN狀態(tài)下小鼠腎皮質(zhì)中Fstl1/Akt/Snail1通路的激活。

綜上所述，OST預(yù)防性用藥可有效降低DN模型小鼠的空腹血糖，保護(hù)其腎功能，抑制腎小管EMT，延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與抑制Fstl1/Akt/Snail1通路有關(guān)。