余星霖，楊麗萍，陳普，段小花（云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500）

線粒體在維持大腦活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，不僅是神經(jīng)細(xì)胞的主要能量來(lái)源，還參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、調(diào)節(jié)能量代謝和維持鈣平衡等生理調(diào)節(jié)[1]。線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致許多神經(jīng)類疾病，如：腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病等[2]。因此，針對(duì)線粒體功能障礙，防止線粒體損傷對(duì)治療神經(jīng)類疾病具有重要意義。

近年來(lái)，從中藥中獲取具有線粒體靶向功能的活性成分已成為研究熱點(diǎn)[3]。天麻為蘭科植物天麻Gastro‐dia elataBl.的干燥塊莖，具有抗氧化應(yīng)激、抗衰老、改善記憶障礙、抗抑郁等藥理作用，用于治療帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇、抑郁癥、腦缺血損傷等疾病[4]。目前，在天麻中發(fā)現(xiàn)了近百種化合物，包括酚類（如天麻素、對(duì)羥基苯甲醇）、有機(jī)酸類（如巴利森苷）、甾體類（如β-谷甾醇）等[5]。實(shí)驗(yàn)研究表明，天麻素、巴利森苷等可發(fā)揮抗氧應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[6]。然而，對(duì)天麻改善線粒體功能的活性成分尚未確定，這嚴(yán)重限制了其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，有研究者基于超濾離心和高效液相色譜（HPLC）-質(zhì)譜聯(lián)用的方法獲取靶向肝臟、心臟中線粒體的中藥活性成分，并通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)證明所獲取成分具有活性作用[7―8]，這是從復(fù)雜成分中高效獲取線粒體靶向化合物的有效方法?；谔炻橹兄饕煞忠鸦颈昏b定，本課題組利用超濾離心選擇性分離與腦線粒體結(jié)合的天麻成分，并采用HPLC法分析鑒定；最后，通過(guò)缺氧缺 糖/復(fù) 氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究所得化合物的神經(jīng)保護(hù)活性。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DMi1型倒置生物顯微鏡（上海徠卡儀器有限公司）、FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、VariosKan型全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]、1260型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）、ST60-4型微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

天麻粉由云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室尹子麗副教授鑒定為蘭科植物天麻G.elataBl.的干燥塊莖粉末。對(duì)照品對(duì)羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HBA）、對(duì)羥基苯甲醛（p-hydroxybenzaldehyde，HBD）、尼莫地平、阿莫西林（批號(hào)分別為 AF21030253、AF20062752、AF21052851、AF21052807）均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司，純度均不小于98%；阿司匹林對(duì)照品（批號(hào)A8830，純度≥98%）、依達(dá)拉奉對(duì)照品（批號(hào)IE0020，純度≥98%）、噻唑藍(lán)（MTT）（批號(hào)823L051）、線粒體提取試劑盒（批號(hào)SM0020）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；中性紅（批號(hào)DS300-2）購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；健那綠（批號(hào)S19083-5g）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；線粒體膜電位（mitochondrial mem‐brane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒JC-1（批號(hào)BL711A）、ROS檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0033S）、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C2009S）、乳酸脫氫酶（lactate dehydroge‐nase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0016）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；腺苷三磷酸（adenosine tri‐phosphate，ATP）含量測(cè)試盒（批號(hào)A095-2-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株

20只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量為250～280 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。所有涉及動(dòng)物的程序均符合《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》的要求，倫理審查編號(hào)為R-062021088。HT22海馬神經(jīng)元細(xì)胞購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠腦組織中線粒體的提取及其純度、活性評(píng)估

2.1.1 線粒體的提取 脫頸處死SD大鼠，快速取出大腦，置于預(yù)冷的生理鹽水中（手術(shù)均于冰上進(jìn)行）。根據(jù)線粒體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腦線粒體，得純化線粒體。

2.1.2 線粒體純度評(píng)估 將純化線粒體與非純化線粒體（未經(jīng)線粒體提取試劑盒中Wash Buffer處理的線粒體，含有其他細(xì)胞組織）分別懸浮于200 μL磷酸鹽緩沖溶液中，并加入0.3%健那綠溶液（線粒體專屬染料）和0.15%中性紅溶液（溶酶體、高爾基體染色）各100 μL混合。在室溫下培養(yǎng)10 min后，置于顯微鏡下觀察[7]。結(jié)果顯示，非純化線粒體中可見(jiàn)大量的雜色，純化線粒體則為單一的藍(lán)綠色，表明經(jīng)提取的線粒體純度高（圖1）。2.1.3 線粒體活性評(píng)估 將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanidem-chlorophenyl hydra‐zone，CCCP）處理組（CCCP可誘導(dǎo)膜電位下降），每組設(shè)置4個(gè)平行。每組取200 μL純化線粒體懸浮液（1 mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液配制，下同），對(duì)照組用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液處理，CCCP處理組用含CCCP的細(xì)胞培養(yǎng)液（1∶1 000）處理，根據(jù)MMP檢測(cè)試劑盒JC-1說(shuō)明書(shū)檢測(cè)線粒體活性。采用全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)為525 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm時(shí)測(cè)定熒光值，熒光值越大，MMP越高。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，與對(duì)照組熒光值（154.90±4.05）相比，CCCP處理組熒光值（80.10±4.04）顯著降低（P＜0.05），表明純化線粒體具有活性。

2.2 天麻中腦線粒體靶向化合物的獲取方法可行性驗(yàn)證

采用超濾離心-HPLC法進(jìn)行測(cè)定。以純化線粒體為對(duì)照組；取純化線粒體在沸水中持續(xù)加熱2 h，產(chǎn)生失去主要生物學(xué)功能的失活線粒體，將其作為實(shí)驗(yàn)組。

2.2.1 溶液的制備 （1）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：參考文獻(xiàn)[7]，采用二甲基亞砜制備阿司匹林、尼莫地平、阿莫西林質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液：采用二甲基亞砜制備尼莫地平質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（3）實(shí)驗(yàn)組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取5 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與200 μL失活線粒體懸浮液（1 mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液配制，下同），在37 ℃條件下孵育60 min（化合物與線粒體特異性結(jié)合）；孵育后置于0.5 mL 10 kDa超濾管中，在4 ℃下以14 000 r/min離心25 min（去除未結(jié)合成分）后用乙酸銨緩沖液（50 mmol/L，pH7.5）沖洗3次，每次200 μL（清洗未結(jié)合成分）；于超濾管中加入400 μL 80%甲醇超聲（頻率500 W，功率40 kHz，下同）20 min后，在室溫下以14 000 r/min離心25 min（分離結(jié)合成分），即得超濾液。將超濾液置于氮?dú)鈿饬飨赂稍?，?00 μL 80%甲醇溶解后即得實(shí)驗(yàn)組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液[7]。（4）對(duì)照組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取5 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與200 μL純化線粒體懸浮液，按“2.2.1（3）”項(xiàng)下方法制備，即得。（5）實(shí)驗(yàn)組尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取5 μL尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液與200 μL失活線粒體懸浮液，按“2.2.1（3）”項(xiàng)下方法制備，即得。（6）對(duì)照組尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取5 μL尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液與200 μL純化線粒體懸浮液，按“2.2.1（3）”項(xiàng)下方法制備，即得。（7）尼莫地平對(duì)照品溶液：采用80%甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的尼莫地平對(duì)照品溶液。

2.2.2 色譜條件 以Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱；水（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 取“2.2.1（3）～（7）”項(xiàng)下溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。當(dāng)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的峰面積之差與對(duì)照組峰面積的比值（ΔP）＞20%時(shí)，表明成分與線粒體能特異性結(jié)合[7]。ΔP值計(jì)算公式如下：ΔP＝（Pe－Pc）/Pe×100%，其中Pe、Pc分別代表對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的峰面積。由圖2可知，與實(shí)驗(yàn)組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，對(duì)照組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼莫地平峰面積有明顯增加，ΔP為（34.11±1.10）%（＞20%），而阿司匹林和阿莫西林均未能被檢測(cè)出（ΔP＜20%）。此外，結(jié)果顯示，與實(shí)驗(yàn)組尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，對(duì)照組尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼莫地平峰面積有明顯增加，ΔP為（43.41±6.06）%（＞20%）。有研究表明，阿莫西林和阿司匹林不與線粒體結(jié)合[9―10]，尼莫地平可與線粒體特異性結(jié)合[11]。因此，上述結(jié)果表明超濾離心-HPLC法具有識(shí)別分離功能，可用于獲取具有線粒體靶向功能的化合物。

2.3 天麻中腦線粒體靶向化合物的獲取

2.3.1 天麻凍干粉的制備 將50 g天麻粉浸入500 mL 70%甲醇中30 min后，超聲提取60 min，過(guò)濾提取液；殘余物加入400 mL 70%甲醇超聲提取60 min，過(guò)濾提取液。將2次過(guò)濾的提取液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45 ?C下減壓濃縮，濃縮物用冷凍干燥機(jī)凍干，即得天麻凍干粉，于室溫下儲(chǔ)存在干燥器中備用。

2.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)篩選化合物獲取的最佳條件 參考“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組和“2.2.1（3）”項(xiàng)下對(duì)照組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的方法，以天麻凍干粉的3個(gè)質(zhì)量濃度（150、300、600 g/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵育時(shí)間為60 min進(jìn)行操作，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每組平行測(cè)定3次，考察標(biāo)準(zhǔn)溶液的最佳濃度。結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為300、600 g/L時(shí)，天麻提取物有4個(gè)峰ΔP＞20%，但質(zhì)量濃度為600 g/L時(shí)與線粒體結(jié)合的成分含量更高（表2）。進(jìn)一步以該質(zhì)量濃度為標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)孵育時(shí)間（30、60、90 min）進(jìn)行檢測(cè)，考察標(biāo)準(zhǔn)溶液的最佳孵育時(shí)間。結(jié)果顯示，孵育時(shí)間為60 min時(shí)，孵育效果最好，有4個(gè)峰ΔP＞20%（表2）。天麻中線粒體靶向化合物獲取的最佳條件為：天麻凍干粉質(zhì)量濃度600 g/L，孵育時(shí)間60 min。

表2 不同質(zhì)量濃度、不同孵育時(shí)間下天麻中成分與線粒體結(jié)合效果（n＝3）

2.3.3 成分指認(rèn) 取HBA、HBD對(duì)照品適量，分別采用80%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將上述色譜圖與“2.3.2”項(xiàng)下天麻凍干粉質(zhì)量濃度為600 g/L、孵育時(shí)間為60 min時(shí)的實(shí)驗(yàn)組線粒體超濾液色譜圖進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)P2為HBA、P3為HBD，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 獲得化合物對(duì)離體腦線粒體活性的影響

2.4.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊）或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（方差不齊）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2.4.2 MMP測(cè)定 MMP下降是線粒體活性下降的標(biāo)志[7]。將純化線粒體分為對(duì)照組（僅純化線粒體）、CCCP誘導(dǎo)組、HBA處理組（CCCP+HBA 50、100、150 μmol/L）、HBD處理組（CCCP+HBD 50、100、150 μmol/L），每組設(shè)置6個(gè)平行。除對(duì)照組外，各組按“2.1.3”項(xiàng)下CCCP處理組方法處理并給予相應(yīng)藥物后，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行MMP檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示，與對(duì)照組比較，CCCP誘導(dǎo)組MMP顯著降低（P＜0.05）；與CCCP誘導(dǎo)組比較，HBA、HBD 處理組 MMP顯著升高（P＜0.05），表明HBA、HBD處理均能使線粒體活性升高。此外，由表3可知，HBA改善MMP的作用優(yōu)于HBD，而且2020年版《中國(guó)藥典》中把HBA列入天麻質(zhì)量控制的成分之一，因此選取HBA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 獲得化合物對(duì)MMP的影響（±s，n＝6）

表3 獲得化合物對(duì)MMP的影響（±s，n＝6）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與CCCP誘導(dǎo)組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組CCCP誘導(dǎo)組HBA處理組化合物濃度/（μmol/L）MMP 12.49±0.58 5.76±0.47a 10.77±0.60b 11.01±0.49b 10.27±0.86b組別HBD處理組50 100 150化合物濃度/（μmol/L）50 100 150 MMP 9.42±0.40b 9.60±0.61b 10.13±0.59b

2.5 HBA對(duì)HT22細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用

2.5.1 HT22細(xì)胞存活率的檢測(cè) 采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）、正常組（正常培養(yǎng)細(xì)胞）、不同濃度HBA（25、50、100、200、400 μmol/L）組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。HBA組細(xì)胞加入含相應(yīng)濃度藥物的完全培養(yǎng)基（即含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，下同），正常組加入完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）＝（AHBA組－A空白對(duì)照組）/（A正常組－A空白對(duì)照組）×100%。按“2.4.1”項(xiàng)下統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算（下同），結(jié)果顯示，與正常組相比，HBA給藥濃度在25～200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率無(wú)顯著改變（P＞0.05），分別為（103.70±4.68）%、（99.05±3.66）%、（99.39±5.19）%、（94.50±2.12）%；給藥濃度為400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率[（90.49±2.58）%]顯著下降（P＜0.05）?？梢?jiàn)HBA給藥濃度在25、50、100 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率影響較小，故選擇上述濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 HBA對(duì)OGD/R損傷HT22細(xì)胞死亡率與形態(tài)學(xué)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為6.4×104個(gè)/mL，每孔2 mL，將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（依達(dá)拉奉100 μmol/L[12]）和不同濃度HBA（25、50、100 μmol/L）組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置細(xì)胞最大酶活性孔（對(duì)照組中正常培養(yǎng)細(xì)胞加入試劑盒提供的LDH釋放劑）。HBA組與陽(yáng)性組細(xì)胞加入含相應(yīng)濃度藥物的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基。24 h后，對(duì)照組更換新鮮完全培養(yǎng)基，其余各組加入含10 mmol/L 連二亞硫酸鈉（Na2S2O4，常用細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)劑）的無(wú)糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞2 h進(jìn)行氧糖剝奪[13]，隨后更換為DMEM高糖培養(yǎng)基復(fù)氧2 h建立OGD/R細(xì)胞模型。細(xì)胞死亡率的檢測(cè)根據(jù)LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)A，計(jì)算細(xì)胞死亡率：細(xì)胞死亡率（%）＝（A給藥組－A對(duì)照組）/（A細(xì)胞最大酶活性孔－A對(duì)照組）×100%。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用倒置顯微鏡觀察各組HT22細(xì)胞的形態(tài)并拍攝圖片。結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞死亡率為（16.66±1.57）%，陽(yáng)性對(duì)照組和不同濃度HBA（25、50、100 μmol/L）組的細(xì)胞死亡率均顯著低于模型組（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴性，細(xì)胞死亡率分別為（3.34±0.29）% 、（12.79±0.57）% 、（10.22±0.17）% 、（4.39±0.24）%，其中100 μmol/L HBA保護(hù)作用最佳。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察如圖4所示，模型組出現(xiàn)大量細(xì)胞皺縮，細(xì)胞突起減少，胞質(zhì)凝聚；與模型組比較，HBA組細(xì)胞的形態(tài)得到改善并呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.5.3 HBA對(duì)OGD/R損傷HT22細(xì)胞ATP、ROS水平的影響 按“2.5.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組及處理，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定ATP、ROS水平，使用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中ATP水平顯著降低、ROS水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和不同濃度HBA組ATP水平（除 HBA 25 μmol/L組外）均顯著升高、ROS水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞ATP、ROS水平比較（±s，n＝5）

表4 各組細(xì)胞ATP、ROS水平比較（±s，n＝5）

a：與對(duì)照組相比，P＜0.05；b：與模型組相比，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組ATP 288 996±3 894 115 843±2 410a 155 414±1 992b ROS 2.93±0.02 10.20±0.33a 3.72±0.07b組別HBA25 μmol/L組HBA50 μmol/L組HBA100 μmol/L組ATP 113 991±3 091 181 939±5 081b 142 537±1 742b ROS 8.98±0.12b 8.23±0.09b 6.22±0.08b

2.5.4 HBA對(duì)OGD/R損傷HT22細(xì)胞線粒體功能的影響 按“2.5.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組及處理，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。參照MPTP檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀以激發(fā)光波長(zhǎng)494 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)517 nm進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估MPTP開(kāi)放程度，熒光越強(qiáng)，開(kāi)放程度越低。參照“2.1.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)MMP。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中MMP水平顯著降低，MPTP開(kāi)放程度顯著變大（P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和不同濃度HBA組MMP水平顯著升高，MPTP開(kāi)放程度（除 HBA25 μmol/L組外）顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞MMP、MPTP比較（±s，n＝5）

表5 各組細(xì)胞MMP、MPTP比較（±s，n＝5）

a：與對(duì)照組相比，P＜0.05；b：與模型組相比，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組MPTP熒光值139.8±10.54 169.4±4.40b 194.2±15.43b MMP 14.82±0.52 3.60±0.06a 10.95±0.22b MPTP熒光值258.4±13.03 127.8±10.33a 225.4±13.92b組別HBA25 μmol/L組HBA50 μmol/L組HBA100 μmol/L組MMP 5.22±0.08b 9.60±0.25b 10.40±0.21b

3 討論

基于超濾離心-HPLC法獲取線粒體靶向化合物的關(guān)鍵是獲得大量具有活性和高純度的線粒體。本研究采取線粒體提取試劑盒提取高純度線粒體，用線粒體專屬染料健那綠與中性紅評(píng)估線粒體純度[14]。采用CCCP處理、檢測(cè)MMP的方法來(lái)確定線粒體活性[15]。結(jié)果顯示提取的線粒體純度高、活性強(qiáng)，可以用于進(jìn)一步研究。

本研究采用阿莫西林、阿司匹林、尼莫地平3種成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，來(lái)檢驗(yàn)超濾離心-HPLC法獲取線粒體靶向化合物的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼莫地平對(duì)照組峰面積顯著增強(qiáng)，而阿司匹林和阿莫西林條件下均未見(jiàn)對(duì)照組峰面積增強(qiáng)。且進(jìn)一步通過(guò)尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)合線粒體，結(jié)果與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果一致，尼莫地平對(duì)照組峰面積顯著增強(qiáng)，表明超濾離心-HPLC法具有分離和識(shí)別能力，可用于獲取線粒體靶向化合物。

線粒體質(zhì)量濃度、樣品質(zhì)量濃度和孵育時(shí)間是影響本研究的關(guān)鍵因素。首先，實(shí)驗(yàn)的靈敏度由線粒體質(zhì)量濃度決定，質(zhì)量濃度越高，靈敏度越高，但當(dāng)線粒體質(zhì)量濃度大于1.0 g/L會(huì)堵塞超濾膜[7]。所以本研究選擇1.0 g/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其次，對(duì)天麻提取物的3個(gè)質(zhì)量濃度（150、300、600 g/L）進(jìn)行檢測(cè)，以明確化合物與線粒體結(jié)合的最佳質(zhì)量濃度，并探討隨化合物質(zhì)量濃度的增加，與線粒體結(jié)合的藥物量是否隨之增加。結(jié)果顯示，天麻提取物達(dá)到300、600 g/L時(shí)，有4個(gè)峰ΔP＞20%，但其中質(zhì)量濃度為600 g/L時(shí)與線粒體結(jié)合成分含量更高。因此，本研究選取600 g/L進(jìn)行后續(xù)研究。最后，對(duì)孵育時(shí)間（30、60、90 min）進(jìn)行篩選。當(dāng)孵育時(shí)間較短時(shí)，可能會(huì)錯(cuò)過(guò)與線粒體松散結(jié)合的活性分子，而較長(zhǎng)的孵育時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)變化。研究結(jié)果表明，活性分子在孵育時(shí)間為60 min時(shí)與線粒體結(jié)合化合物的數(shù)量最多，達(dá)到4個(gè)。以上研究結(jié)果表明，藥物質(zhì)量濃度為600 g/L、孵育時(shí)間為60 min時(shí)，與失活線粒體組相比，純化線粒體組4個(gè)峰（P1～P4）的峰面積顯著增強(qiáng)（ΔP＞20%）。這表明4個(gè)峰（P1～P4）與活性線粒體具有特異性結(jié)合。通過(guò)與對(duì)照品對(duì)比后，鑒定出結(jié)合量較大的2個(gè)成分（P2為HBA，P3為HBD），并且這2個(gè)成分可提高離體MMP，提示P2、P3具有線粒體保護(hù)作用。

由于HBA提高M(jìn)MP的作用強(qiáng)于HBD，而且2020年版《中國(guó)藥典》中把HBA列入天麻質(zhì)量控制成分之一，本研究通過(guò)HT22細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證HBA的神經(jīng)保護(hù)作用[13]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R可引起神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和壞死，而HBA能明顯改善這一情況，與之前的報(bào)道一致[16]。在本研究中，HBA預(yù)處理可以減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞病理改變，減少細(xì)胞的死亡率，起到神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞OGD/R時(shí)產(chǎn)生大量ROS，線粒體容易受到氧化損傷，線粒體功能發(fā)生障礙導(dǎo)致ATP水平降低，MMP去極化，MPTP開(kāi)放異常并釋放細(xì)胞凋亡因子，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)HBA處理逆轉(zhuǎn)了OGD/R細(xì)胞模型中ROS、ATP、MPTP、MMP的異常變化，表明HBA可通過(guò)減少氧化損傷，保護(hù)線粒體功能，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功從天麻中獲取2個(gè)腦線粒體靶向化合物（HBA、HBD），并且驗(yàn)證了結(jié)合率最高的HBA對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，可能是通過(guò)線粒體靶向治療而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。